Ce protocole est important pour la production d’organoïdes épithéliaux mémoire qui sont générés sans passage. Le principal avantage de cette technique est que les organoïdes peuvent être isolés des tissus mammaires et mémoire humains et murins après digestion enzymatique. Nous effectuons une série d’étapes de centrifugation différentielle qui isolent les organoïdes épithéliaux sans avoir à passer par les cellules.
Une personne effectuant cette technique peut faire face à des défis lors de l’incorporation des tissus dans le collagène ou la matrice et de leur placage dans une plaque de 96 puits. De plus, l’utilisation de collagène correctement polymérisé et le placage de dômes stables sont la clé pour voir l’invasion. Pour commencer, prélevez le tissu mammaire d’une souris euthanasiée en écartant les membres de la souris et, à l’aide de quatre aiguilles de calibre 19, épinglez la souris par les pattes à une planche recouverte d’un tampon absorbant avec la face ventrale tournée vers le haut.
Vaporiser avec de l’éthanol à 70% pour lisser la fourrure et désinfecter la peau et essuyer les matières fécales avec un tampon de gaze ou un mouchoir. En commençant juste au-dessus de la région anogénitale, couper vers le haut à partir de la ligne médiane à l’aide de ciseaux chirurgicaux en prenant soin de ne pas percer le péritoine. En atteignant le menton, faites des coupes latérales le long des deux clavicules et le long des pattes postérieures et épinglez la peau de la souris tendue à la planche pour exposer les coussinets graisseux mammaires.
Après avoir localisé les coussinets graisseux mammaires inguinaux et thoraciques sur des souris de type sauvage, utilisez des forceps pour élever le coussinet graisseux mammaire. À l’aide de l’extrémité émoussée des ciseaux émoussés tranchants, créez une poche sous le coussinet graisseux mammaire loin de la peau et coupez le coussinet graisseux mammaire en un seul morceau complet. Une fois que les coussinets graisseux mammaires ont été retirés, rincer dans le PBS avant de les placer dans un plat de culture tissulaire stérile, puis transférer rapidement dans une hotte de culture tissulaire.
Hachez les tumeurs mammaires avec un scalpel numéro 10 ou numéro 11 pour desserrer les tissus jusqu’à ce qu’ils atteignent une consistance pâteuse. Transférer le tissu haché dans un tube conique contenant 10 à 30 millilitres de solution de collagénase à l’aide d’un scalpel. Pour vous assurer que tous les tissus sont recueillis, pipeter un millilitre de solution de collagénase sur la plaque de culture tissulaire et revenir dans le tube conique.
Placez le tube conique dans un incubateur à secouer de paillasse jusqu’à ce que le tissu devienne filandreux et que la solution de collagénase devienne trouble. Faites tourner 50 millilitres de solution pendant cinq à 10 minutes à 1 500 tr / min. Aspirer le surnageant, et ajouter 12 millilitres du milieu basal et mélanger en pipitant de haut en bas trois à quatre fois ou en tournant doucement le poignet tout en tenant le tube 15 fois.
Encore une fois, faire tourner vers le bas le surnageant d’aspiration, ajouter le milieu basal et mélanger par pipetage ou rotation du tube comme démontré précédemment. Une fois que les fragments de tissu les plus lourds se déposent au fond, prélevez le surnageant avec une pipette sérologique et transférez-le dans un tube conique de 15 millilitres. Après chaque centrifugation, assurez-vous que la pastille devient de plus en plus opaque.
Suspension appropriée aliquote des organoïdes dans des tubes microcentrifugés en fonction de la densité organoïde par rapport à la quantité de BECM par puits. Centrifuger les tubes microcentrifugeuses pendant 10 minutes à 300 G à température ambiante et éliminer le surnageant des tubes. Déplacer les tubes contenant des pastilles organoïdes dans de la glace et ajouter le volume approprié de BECM à chaque tube microcentrifugeux.
Pipeter doucement de haut en bas pour remettre en suspension les organoïdes dans BECM, en prenant soin de ne pas produire de bulles. Pipeter lentement et soigneusement les organoïdes suspendus BECM sur la surface de placage et remplir tous les puits vides avec du PBS pour maintenir l’humidité. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure pour permettre à BECM de se solidifier, puis recouvrez avec le volume approprié de média.
Pour préparer la solution de collagène, combinez 375 microlitres de 10 fois la concentration de DMEM, 100 microlitres d’un hydroxyde de sodium normal et trois millilitres de solution de collagène I de queue de rat dans un tube conique de 15 millilitres. Mélanger à pipette en prenant soin de ne pas faire de bulles, et titrer la solution à un pH de 7,2 à 7,4 avec une petite quantité d’hydroxyde de sodium ou 10 fois la concentration de DMEM selon les besoins. Enduisez le fond des puits avec la quantité minimale de collagène nécessaire pour couvrir complètement le fond du puits en plaçant une petite quantité de collagène et secouez la plaque d’un côté à l’autre.
Laissez les sous-couches de collagène se fixer à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à deux heures. Aliquote la suspension appropriée des organoïdes dans des tubes de microcentrifugation en fonction de la densité organoïde par rapport à la quantité de collagène par puits. Conservez la solution de collagène à quatre degrés Celsius et surveillez la polymérisation en vérifiant la formation de fibres au microscope toutes les 10 minutes.
Centrifuger les tubes de microcentrifugation à 300 G pendant 10 minutes à température ambiante et éliminer le surnageant des tubes. Déplacez les pastilles organoïdes dans la glace et ajoutez le volume approprié de collagène à chaque tube de microcentrifugeuse. Pipeter doucement de haut en bas pour remettre en suspension les organoïdes dans le collagène, en prenant soin de ne pas produire de bulles.
Pipeter lentement et soigneusement les organoïdes en suspension de collagène sur la surface de placage. Les images immunofluorescentes d’organoïdes intégrés dans la matrice extracellulaire basale ou le collagène ont été obtenues pour étudier les similitudes de composition tissulaire inter-espèces. Les organoïdes intégrés dans la matrice de collagène peuvent être utilisés pour un test d’invasion et analysés en suivant l’expansion des vrilles se ramifiant à partir de l’organoïde lui-même, soit par marquage de la tomate membranaire, soit par coloration de la phalloïdine de l’actine.
Enfin, la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine des organoïdes incorporés à la paraffine montre que les organoïdes maintiennent la même histologie du cancer du sein. Il est crucial de garder le BECM et le collagène froids tout en pipetant des dômes gélifiés pour éviter une polymérisation prématurée. De plus, une fixation prolongée des dômes en PFA conduira à une solution gélifiée si elle effectue une coloration immunofluorescente.
Les organoïdes peuvent également être utilisés dans des procédures in vitro et in vivo telles que les criblages de médicaments et les modèles murins de métastases. Ces méthodes peuvent fournir des informations sur la sensibilité thérapeutique du tissu tumoral, les propriétés métastatiques et les interactions immunitaires.
