Ce protocole a été utilisé pendant plus de 40 ans et reste la seule méthode fiable pour les analyses de transplantation de cellules mammaires chez le rat. Cette méthode est largement utilisée pour interroger les effets autonomes des cellules mammaires par rapport à l’hôte dans la recherche sur la susceptibilité au cancer du sein. En greffant dans la graisse interscapulaire, cette méthode contourne l’épithélium de la membrane endogène qui n’est pas efficace chez les rats.
La méthode est donc moins invasive et les glandes mammaires endogènes peuvent être utilisées comme contrôle interne. Pour commencer cette procédure, placez un rat femelle euthanasié sur son dos et fixez-le avec des broches. Pulvériser toute la surface ventrale avec 70% d’éthanol.
Faire une incision sagittale en forme de Y permettant l’accès aux glandes mammaires thoraciques, abdominales et inguinales. Utilisez des ciseaux pour disséquer tout le tissu mammaire de la glande du rat donneur et enlever tous les ganglions lymphatiques visibles. Ensuite, utilisez des forceps pour extraire le tissu mammaire.
Placez-le dans un plat étiqueté de 60 millimètres contenant 500 microlitres de dmem F12 sans sérum et gardez-le sur la glace. Ensuite, utilisez des ciseaux pour hacher finement le tissu mammaire. Tout d’abord, retournez soigneusement le corps de l’animal donneur pour le placer dans une position couchée et fixez-le avec des broches.
Vaporiser la tête et le haut du dos avec 70% d’éthanol. Localiser la base du crâne et faire une incision sous les condyles occipital, insérer des ciseaux pointus sous la peau et couper la peau loin du crâne, y compris les côtés de la tête. Ensuite, utilisez des coupeurs d’os ou des ciseaux solides pour couper le crâne le long de la ligne médiane de l’occipital aux os frontaux tout en s’assurant de garder la lame aussi superficielle que possible et inclinée vers le haut pour empêcher la destruction du tissu cérébral sous-jacent.
Utilisez rongeurs ou des forceps forts pour éplucher l’os. Insérez l’outil latéral au cervelet pour briser l’os de chaque côté. Couper les connexions aux méninges en exposant pleinement le canal auditif.
Utilisez des forceps incurvés à pointe fine pour soulever le cerveau hors du crâne et enregistrer son poids. Utilisez un nouveau départ de fournitures pour d’autres cerveaux donneurs. Transférez-le immédiatement dans un tube de 15 millilitres contenant une quantité égale de supports stockés sur la glace.
Homogénéiser le cerveau pendant 10 à 15 secondes à basse vitesse. Filtrez ensuite l’homogénéité pour enlever les gros morceaux. Conserver le liquide sur la glace jusqu’à ce qu’il soit nécessaire.
D’abord, coupez un centi mètre de l’extrémité d’une pointe de pipette de 1000 microlitres et placez-la manuellement sur le pipettor. Utilisez une pointe de pipette coupée pour transférer le tissu donneur haché de chaque plat de 60 millimètres au tube de digestion de collagène. Mélanger délicatement le tissu haché en le pipetting de haut en bas une à deux fois.
Ensuite, fixez les échantillons en position horizontale dans l’incubateur qui tremble. Laissez les échantillons digérer pendant 1,5 à 2 heures à 37 degrés Celsius tout en secouant à une vitesse comprise entre 200 et 220 RPM. Lorsque le tissu mammaire de la glande donneuse est entièrement digéré, centrifuger la suspension à 1 200 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Après s’être assuré qu’une pastille s’est formée, utilisez une pipette pour enlever la couche de graisse ou versez soigneusement le supernatant. Resuspendez doucement la pastille en 10 millilitres de dmem F12 frais. Répétez ce processus pour bien laver les cellules.
Préparer un tube de 50 millilitres à l’aide d’une passoire de 40 micromètres pour chaque animal donneur. Pré-mouiller la passoire avec au moins un millilitre de DMEM F12 médias. Ensuite, utilisez une pipette pour passer la suspension cellulaire à travers le filtre pour recueillir des fragments ductal ou organoïdes.
Pour les organoïdes, ne gardez que les cellules qui restent dans le filtre. Inverser la passoire cellulaire sur un nouveau tube de 50 millilitres et rincer avec n’importe quel volume de médias stériles nécessaires pour recueillir toutes les cellules. Après cela, pelleter les cellules une fois de plus et resuspendre dans un petit volume de médias pour le comptage.
Préparez des lots simples de matériel de donneur pour tous les receveurs de greffe en combinant des volumes égaux de la suspension cellulaire avec 50% d’homogénéité cérébrale pour chaque site de transplantation. Tout d’abord, identifier la base du crâne et le début de la colonne vertébrale sur un animal receveur. Environ un tiers du chemin vers le bas de la colonne vertébrale, raser une zone de trois centimètres par deux centimètres sur la partie thoracique supérieure du dos.
Ensuite, préparez le champ stérile qui sera utilisé pour la chirurgie et organiser toutes les fournitures nécessaires. Rincer les seringues Hamilton avec des supports DMEM F12 stériles pour éviter la perte de cellules. Chargez l’ensemble du volume de matériel de donneur dans une seringue séparée pour chaque condition.
Une fois la seringue complètement chargée, inversez-la et appuyez légèrement sur le piston pour enlever les bulles d’air à l’extrémité de l’aiguille. Gardez la seringue sur la glace tout au long de l’intervention. Assurez-vous que l’animal ne réagit toujours pas aux stimuli profonds avec un pincement ferme des pieds.
Ensuite, utilisez une lame chirurgicale tranchante pour faire une petite incision interscapulaire. Localisez le vaisseau sanguin médial pour l’orientation et utilisez des forceps pour soulever la peau d’un côté de l’incision. Tenez la peau à l’écart de la graisse et évitez la graisse brune sous-jacente pendant que la greffe est effectuée.
Ensuite, insérez l’aiguille dans le site de la greffe. Injectez soigneusement 40 microlitres du mélange cellulaire dans le tissu interscapulaire de la adipeuse blanche. Retirez l’aiguille lentement.
Maintenez le tissu en place et laissez les cellules transplantées se contenter de trois à cinq secondes. Répétez l’ensemble de la procédure d’injection telle qu’elle a été décrite précédemment au deuxième site de transplantation. Après cela, fermez la plaie chirurgicale à l’aide de pinces à plaies ou de sutures, puis interrompez l’anesthésie.
Après avoir sacrifié l’animal, préparez-le à la dissection. Identifiez le vaisseau sanguin médial qui sépare les emplacements de greffe dans le tampon interscapulaire de graisse. Exciser l’ensemble de la garniture comme un seul morceau de tissu.
Placez le tissu sur une lame de microscope chargée positivement pour la monture entière. Placez les glissières dans 70% d’éthanol pendant sept à dix jours pour dé grossir le tissu. Ensuite, préparez la tache d’alun carmin et traiter les diapositives lorsque le tissu est suffisamment opaque.
Lorsque le traitement est terminé et que le tissu de la diapositive a été effacé, utilisez une microscopie légère de faible puissance ou une photographie numérique haute résolution pour acquérir des images des diapositives aux fins d’analyse. Dans cette étude, les cellules épithéliales mammaires sont transplantées à l’aide d’une technique optimisée pour travailler avec les rats où les organoïdes épithéliales mammaires isolés des rats donneurs sont greffés dans la graisse blanche interscapulaire des rats receveurs. La présence, l’absence ou l’abondance de l’épithélium peuvent être évaluées pour déterminer le succès de l’expérience ainsi que l’autonomie des effets liés aux variables expérimentales.
Une expérience de transplantation réciproque où chaque facteur a deux niveaux tels que le type sauvage contre KO créera quatre groupes de transplantation pour l’essai d’hypothèse. L’ensemble représentatif monté coussin de graisse interscapulaire montré ici contient l’excroissance épithéliale positive aux deux emplacements de la transplantation. Lors de l’analyse des diapositives, le manque d’épithélium dans le tampon de graisse interscapulaire sur de nombreux échantillons peut indiquer un problème technique avec la procédure et doit être traité comme un résultat négatif.
L’excroissance épithéliale du donneur peut également être comparée à la glande mammaire endogène et peut faciliter des conclusions supplémentaires. Dans l’exemple montré ici, les résultats de la transplantation réciproque utilisant le type sauvage et les rats de KO de CDKN1B ont suggéré des effets autonomes non mammaires de cellules sur le développement mammaire de glande. N’oubliez pas que les cellules épithéliales et organoïdes des donneurs doivent être préparés avec soin et maintenus en vie jusqu’à ce qu’ils soient injectés dans l’animal receveur.
Il est impératif de planifier à l’avance et d’effectuer la procédure avec soin et sans interruption. Des analyses primaires de carcinogenèse peuvent être exécutées après transplantation pour interroger l’autonomie mammaire de cellules dans l’étiologie ou le traitement du cancer du sein. L’édition génétique peut également être incorporée pour concevoir génétiquement les cellules donneuses ou le rat receveur.
Comme seule méthode d’exécution de la transplantation mammaire de cellules épithéliales chez les rats, cette procédure facilite le développement de glande mammaire aussi bien que des études de carcinogenèse. Cette technique est particulièrement importante pour la recherche sur les interactions entre les cellules cancéreuses du sein et/ou les cellules épithéliales mammaires avec le microenvironnement hôte. Il permet des études dans le développement des glandes mammaires ainsi que la recherche sur le cancer du sein.
Ceux qui tentent cette technique pour la première fois devraient optimiser les préparations cellulaires des donneurs afin d’assurer un rendement et une viabilité cellulaires maximaux, puis effectuer de petites expériences pilotes pour pratiquer des interventions chirurgicales et déterminer le nombre de cellules à injecter et déterminer les temps d’incubation post-chirurgicaux requis pour les expériences.
