Cette recherche démontre une nouvelle approche de l’étude des thérapies et de la pathobiologie du cancer appendice dans un contexte préclinique. Ces méthodes peuvent être plus largement applicables à l’étude d’autres tumeurs malignes. Le cancer de l’appendice est difficile à étudier étant donné sa faible incidence en l’absence d’appendice chez la souris pour la modélisation de la maladie.
Cette technique permet l’étude des interactions cellulaires au sein du microenvironnement tumoral. Cette méthode peut être appliquée pour étudier la biologie de plusieurs types de cancers qui ont tendance à métastaser dans l’épiploon, tels que les cancers colorectal et ovarien. Commencez par préparer les milieux de transport et de culture.
À l’arrivée des tissus, transférer les tissus tumoraux du pseudomyxome peritonei dans 35 DMEM complets contenant des plats de six centimètres de diamètre. En plus d’enlever toute mucine liquéfiée ou les régions tissulaires très mucineuses, enlevez tout tissu difficile à couper avec un scalpel. Coupez les nodules du tissu tumoral grossièrement en morceaux cubes d’un centimètre plus petits.
pour la préparation de l’agarose et l’encastrement tissulaire, préparer une solution à 5 % d’agarose à bas point de fusion dans du PBS sans sérum bovin fœtal ni FBS le même jour si les tissus arrivent. Ajouter la solution liquide à 5% d’agarose aux boîtes de six centimètres contenant deux à trois échantillons tumoraux plus petits jusqu’à ce qu’elle recouvre l’échantillon. Placez les mouchoirs en papier incrustés dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.
Démontez les échantillons de tissu sur le vibratome, retirez la tarière solidifiée du réfrigérateur et coupez les cubes d’agarose légèrement plus grands que la largeur du tissu à l’aide d’un scalpel. Appliquez la super colle sur l’étage de vibratome et placez doucement le cube d’agarose sur la super colle pendant une à deux minutes pour la fixation. Fixez la lame au vibratome et réglez l’épaisseur de la section de tissu à environ 150 à 250 microns pour une imagerie optimale en aval.
Pour mettre en culture les tranches de tissu, préparez une plaque d’insertion perméable en ajoutant deux millilitres de média DMEM complet au-dessus de la membrane perméable et trois millilitres sous la membrane perméable. Ensuite, soulevez doucement les tranches de tissu hors de la chambre de coupe du vibratome à l’aide d’un pinceau mince et placez deux à quatre tranches dans des boîtes de culture perméables contenant du DMEM complet. Cultivez les tranches jusqu’à sept jours à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 5%.
Pendant le remplacement des milieux, toutes les 24 heures, ajouter du bortézomib comme témoin de la destruction cellulaire et des chimiothérapies testables 5-fluorouracile, ou 5-FU, dans les milieux de culture pour effectuer une intervention pharmacologique. Placez les tranches tumorales pour l’analyse d’imagerie confocale dans un seul puits d’une boîte de 12 puits contenant du PBS avec 1% FBS. Pour les expériences d’imagerie calcique, au lieu de PBS, incuber les tranches dans une solution de calcium extracellulaire.
Colorer les échantillons avec des colorants d’imagerie pour déterminer la viabilité des tranches de tissu. Incuber pendant 10 minutes à une heure après l’ajout du colorant de viabilité. Après l’incubation, transférer les tranches dans une boîte de Petri à fond de verre optiquement transparent contenant du PBS avec 1% FBS à utiliser pour l’imagerie sur un appareil d’imagerie confocale.
Couper un petit morceau à l’extrémité d’une pointe de pipette d’un millilitre pour élargir l’ouverture, permettant une dissociation mécanique vigoureuse par pipetage. Incuber des tranches à 37 degrés Celsius avec rotation de cinq à 15 minutes dans un millilitre de tampon de digestion, avec une perturbation tissulaire vigoureuse deux à trois fois pendant l’incubation par dissociation mécanique. Une fois le tissu digéré, transférez le tissu perturbé avec un milieu de digestion sur un filtre de 70 micromètres placé sur un tube conique de 50 millilitres.
Choisissez des morceaux plus gros à l’aide d’une pince stérile ou d’une pipette. À l’aide du backend émoussé d’une seringue en plastique de cinq millilitres, écrasez toutes les tranches non dissociées plus grosses et lavez-les avec quatre millilitres de PBS contenant 2% FBS. Prenez le surnageant cellulaire dissocié et centrifugez à 300G pendant cinq à 10 minutes.
Retirez le surnageant et lavez la pastille avec un millilitre de PBS contenant 2% FBS. Pour préparer l’échantillon à la cytométrie en flux, ajoutez le tampon de blocage contenant 50 microlitres de bloc FC humain et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Effectuer une coloration cellulaire supplémentaire en utilisant les anticorps respectifs dans 50 microlitres de PBS contenant 2% FBS.
Aliquote cinq millilitres de milieu complet pour les conditions de contrôle et de traitement. Sur les deux à quatre tranches plaquées sur les boîtes perméables, ajouter les milieux provenant des aliquotes du traitement témoin et les combinaisons thérapeutiques supplémentaires à utiliser pour l’analyse de la viabilité en aval et des morts vivants. Laisser les tranches de tissu dans une culture contenant du DMEM complet pendant deux à cinq jours, en changeant de milieu ainsi que le bortézomib et le 5-FU tous les deux jours.
Pour l’analyse de viabilité luminescente, ajoutez 500 microlitres de PBS dans un plat de 12 puits et transférez les tranches de tissu appariées séquentiellement à la solution de PBS à l’aide d’un pinceau ou d’une pipette d’un millilitre. Retirez le PBS des tranches. Ajouter 500 microlitres de la solution de viabilité luminescente par condition et incuber avec une rotation lente sur l’agitateur à température ambiante pendant 30 minutes avant de lire la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaque de luminescence.
La coloration de la mucine dans les tranches de tissu a été visualisée à l’aide d’une coloration périodique par décalage acide et d’anticorps spécifiques à la mucine. L’incubation de calcéine AM et d’iodure de propidium a déterminé la santé et la viabilité. Les noyaux chevauchaient les cellules proliférées pendant la culture.
Ces résultats ont été quantifiés pour déterminer le nombre de cellules proliférantes dans la tranche tumorale. Les tranches incubées dans l’anticorps conjugué PE CD11b et Fluo-4 AM, ont marqué les cellules immunitaires locales dans la CTU. Des images à l’échelle pseudo-couleur montrant les niveaux de calcium intracellulaire ont permis de visualiser les niveaux différentiels de calcium intracellulaire.
L’activité spontanée suivie et le temps écoulé avant, pendant et après la réponse intercellulaire au calcium dans la cellule immunitaire positive CD11b mise en évidence sont présentés ici. Les traces brutes de réponses calciques dans la cellule immunitaire CD11b, ainsi que dans d’autres cellules sensibles et non sensibles ont été quantifiées. Les résultats représentatifs de l’immunotypage d’un échantillon de tumeur de patient avec pseudomyxome peritonei sont présentés ici.
La quantification du profil immunologique tumoral a montré que l’échantillon de donneur 337 a des niveaux élevés de macrophages M2, ce qui indique que l’utilisation de tranches de tissu dérivées de pseudomyxoma peritonei a permis d’interroger le paysage cellulaire unique du donneur des échantillons tumoraux du patient. La pharmacotypage et l’analyse en aval de tranches de tissus humains de pseudomyxoma peritonei ont montré la destruction des cellules dans les tranches tumorales, comme le confirment l’analyse de cytotoxicité et l’imagerie confocale tunnel. En réponse au médicament cytotoxique, le bortézomib et le 5-fluorouracile.
L’analyse de viabilité luminescente a été effectuée à l’aide de tranches appariées séquentiellement. La production réussie de tranches à partir de tumeurs mucineuses nécessite une dissection méticuleuse et l’élimination des composants tissulaires cellulaires et acellulaires comme la graisse et les tissus denses de la paroi abdominale. Cette technique peut permettre de modéliser les interactions entre les cellules cancéreuses et plusieurs types de cellules dans le microenvironnement tumoral, telles que les interactions entre les cellules adipeuses, vasculaires et immunitaires.
