Ce protocole montre l’utilisation de la microscopie à force atomique en mode contact pour observer les changements dans la morphologie cellulaire dus à une maladie ou à un traitement spécifique. Il est fortement recommandé d’utiliser des récipients scellés pour cette procédure afin d’éviter la contamination et d’analyser l’échantillon fixe dès que possible pour éviter le vieillissement. Commencez par fixer les échantillons sur la lame en passant doucement la lame sur une flamme plusieurs fois jusqu’à ce que l’échantillon soit sec.
Placez les échantillons fixes dans une boîte de Petri et transportez-les vers l’équipement de microscope à force atomique pour observation. Ensuite, allumez l’ordinateur et le microscope à force atomique. Sélectionnez ensuite le mode de contact, les sondes ContAI-G et les options de pente automatique dans le logiciel.
Définissez les valeurs par défaut pour le contrôleur Z en réglant le point de consigne à 20 nanomètres, le gain P à 10 000, le gain I à 1 000, le gain D à zéro et la tension de pointe à zéro millivolts. À l’aide de la tête de plage de balayage de 70 micromètres, placez les échantillons en mode de contact AFM. Obtenez une vue rapide de la surface de la zone sous la sonde à l’aide d’une caméra montée sur deux objectifs intégrés dans la tête de numérisation.
Maintenant, choisissez la zone souhaitée en la déplaçant manuellement dans le plan XY. Laissez la sonde s’approcher électroniquement de la surface de l’échantillon jusqu’à ce que le contact soit atteint. Ajustez électroniquement le plan de mesure XY du scanner et de la surface de l’échantillon en réduisant la direction de la pente XY.
Définissez les paramètres standard du logiciel sur une ligne par seconde et 256 points par ligne. Ensuite, effectuez une plage de balayage complète d’une zone de 70 par 70 micromètres. Sélectionnez la zone plus petite à l’aide de l’outil de zoom.
Sélectionnez une nouvelle zone de l’échantillon en rétractant électroniquement le porte-à-faux et en déplaçant l’échantillon le long du plan XY. Effectuez ensuite une nouvelle analyse comme démontré précédemment. Ensuite, utilisez le nivellement ligne par ligne dans le menu Outils de l’image dans la sélection de filtre pour effectuer le traitement des données.
Optimisez la hauteur maximale et minimale dans la barre de couleur pour obtenir la meilleure résolution d’image. Enfin, effectuez l’analyse d’image à l’aide du menu d’analyse. Sélectionnez les points initiaux et finaux avec l’outil souhaité pour déterminer la longueur et la distance.
L’analyse microscopique à force atomique des cultures bactériennes a montré que les cultures de Staphylococcus aureus étaient distribuées par zones avec des agrégats de cocci. L’augmentation des échelles a montré qu’il y avait une meilleure appréciation de la distribution de la population et de la morphologie des cocci. Les images en mode contact AFM ont permis de déterminer la taille des cocci qui présentaient une largeur moyenne de 1,25 micromètre.
Pseudomonas hunanensis a montré une distribution homogène sur toute la surface de support en verre formant une monocouche adhérente. Les cultures étaient en forme de bâtonnets avec une longueur de 1,9 micromètre et une largeur de 0,9 micromètre. L’exposition à la micro-dilution de nanoparticules d’oxyde de magnésium de Staphylococcus aureus a entraîné la perte d’une surface lisse et de contours homogènes en raison d’une grave détérioration de la structure cellulaire.
La formation de vésicules et la libération de matériel cytosolique ont été observées dans des cultures à des concentrations plus élevées que le CMI. Des résultats similaires ont été obtenus dans des cultures d’E. coli, les témoins montrant des surfaces lisses mettant en évidence sa forme homogène en forme de bâtonnet. La structure a complètement disparu à 1 000 ppm d’exposition aux nanoparticules avec seulement des silhouettes distinguables.
Il est important d’effectuer correctement la fixation des échantillons car elle est essentielle pour une analyse plus approfondie. Le filtre d’image permet de fournir une bonne résolution d’image et des détails d’échantillonnage. En utilisant la méthode de fixation, des modes sans contact AFM pourraient être appliqués, ce qui peut être utile dans l’étude des propriétés mécaniques.
Cette méthodologie pourrait être un outil peu coûteux et utile pour la recherche médicale et microbiologique axée sur l’analyse des dommages cellulaires bactériens.
