Nous remercions Adam Coster et tous les autres membres des laboratoires Altschuler et Wu pour commentaires et discussions utiles. Cette recherche a été soutenue par l&#39;Institut national de la santé accorde R01 GM085442 et CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), et la Fondation Welch I-1619 (SJA) et I-1644 (LFW).

Une. Préparation des échantillons et d&#39;imagerie <ol><li> La culture cellulaire <ol><li> Diviser les cultures régulièrement et maintenir à 20-70% de confluence. Un jour avant l&#39;expérience, la croissance des cellules HeLa dans du DMEM (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, voir le tableau des matériaux) et supplémenté avec 10% de FBS (sérum bovin fœtal) et 1x pénicilline / streptomycine. </li><li> Au jour de l&#39;expérience, les cellules en croissance par division en culture (environ 50% de confluence). </li><li> Laver les cellules avec du PBS (Phosphate Buffered Saline), exposer à environ 2 ml de trypsine / EDTA (acide éthylène diamine) pendant quelques secondes. Aspirer excès de trypsine / EDTA et maintenir les cellules baignant dans un film mince de trypsine / EDTA dans la hotte à température ambiante pendant environ 3 min. </li><li> Agiter mécaniquement flacons à deux reprises et détacher les cellules avec les médias de sérum complété. Compter les cellules et diluer à 5000 cellules/50 ul de milieu et immédiatement la plaque 50 pl / puits sur une plaque de fond de verre de 384 puits en utilisant une manipulation du liquide robot automatisé (seulement 30 biens de la plaque sont utilisés ici). </li><li> Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 min afin de minimiser les effets de bord dans les puits 5. Après RT incubation, placer les plaques dans une ° C / 5% de CO 2 incubateur à 37 pendant la nuit. </li><li> Chaque médicament sera testé en double. Ajouter 25 ul de médicament dans les puits correspondants de la plaque support contenant déjà. </li><li> Fixer la plaque avec une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS à 24 heures après un traitement médicamenteux. </li></ol></li><li> Coloration Les anticorps spécifiques des anticorps primaires, secondaires marqués par fluorescence et d&#39;autres colorants fluorescents qui ont été utilisées ici sont énumérés dans le tableau de matériaux. <ol><li> Cellules perméabilisent fixe avec 0,2% de Triton X-100 solution dans du TBS (solution saline tamponnée au Tris) pendant 3 min, et laver avec TBST (solution saline tamponnée au Tris + Tween 20) 3x. Ajouter 5% de BSA (Bovine Serum Albumine) en solution TBST pour bloquer. </li><li> Incuber la plaque à température ambiante pendant 2 heures, puis laver avec du TBST 3x. </li><li> Faire DILUT anticorps primaireions dans 5% de BSA dans TBST (voir le tableau des matériaux) et ajouter 10 ul / puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 2 heures, puis laver 3x avec TBST. </li><li> Faire dilutionin anticorps secondaire 5% de BSA dans TBST (voir le tableau des matériaux) et ajouter 10 ul / puits. </li><li> Incuber la plaque dans l&#39;obscurité à la température ambiante pendant 2 heures puis laver deux fois avec TBST. </li><li> Préparer des dilutions pour Hoechst et phalloidin (voir le tableau des matériaux) dans du PBS et ajouter 10 ul / puits. </li><li> Incuber la plaque à l&#39;obscurité pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Après 2 lavages de TBST, plaques de recouvrement en aluminium et conserver à 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Imagerie Acquérir des images à l&#39;aide d&#39;un microscope à épifluorescence en utilisant un objectif 20x avec caméra 1x1 binning. Acquérir seize images pour chaque bien, pour un total de 480 images (canaux x3). </li></ol> 2. Analyser Images Téléchargez et installez PhenoRipper de phenoripper.org, et lancer PhenoRipper pour commencer l&#39;analyse des images. PhenoRipper prend actuellement en charge TIFF, PNG et JPEG et tous les autres formats pris en charge par MATLAB (logiciel de microscope prennent généralement en charge l&#39;exportation au format TIFF). 2.1 Chargement des données <ol><li> Il n&#39;existe pas de convention de nommage / organisation standard pour les images de microscopie, ce qui peut rendre le chargement des images et des métadonnées à associer (c. annotation expérimentale tels que le type de traitement, bien nombre et ainsi de suite) la partie la plus difficile du flux de travail. Choisissez l&#39;une des méthodes présentées (décrit ci-dessous). <ol><li> PhenoLoader: Choisissez cette option pour semi-charger automatiquement les données lorsque le nom de fichier et / ou de la structure de répertoire contiennent suffisamment d&#39;informations pour des images de groupe comme vous le souhaitez (par exemple B16 HeLa_Drug5-DAPI.png pourrait indiquer que l&#39;image est de bien B16, les cellules sont traitées avec le médicament dont l&#39;ID est 5, et l&#39;image capture la tache de DAPI nucléaire - avec cette convention de nommage, toutes les images du puits A1 ou traités avec des médicaments 5 pourraient facilement être regroupées). L&#39;assistantguider l&#39;utilisateur étape par étape d&#39;associer des métadonnées avec des groupes d&#39;images et de définir les marqueurs de la manière suivante: <ol><li> Cliquez sur &quot;Structure de fichiers&quot; pour accéder à la fenêtre PhenoLoader. </li><li> Cliquez sur &quot;Définir le répertoire racine&quot; pour sélectionner le répertoire contenant l&#39;image ensemble de données. Puis filtrer les fichiers qui ne sont pas utilisés (fichiers inutilisés) pour l&#39;analyse (en option, peut être laissé vide). </li><li> Cliquez sur &quot;Définir&quot; marqueurs pour indiquer les biomarqueurs utilisés dans l&#39;expérience et les associer aux images. En particulier, cliquez sur un fichier image, puis sélectionnez une partie du nom de fichier qui identifie les biomarqueurs. Enfin, entrez un nom pour chaque biomarqueur. </li><li> Cliquez sur &quot;Définir métadonnées&quot; pour associer des informations à chaque image. En particulier, cliquez sur un fichier image, puis sélectionnez une partie du nom du fichier des informations d&#39;identification de l&#39;image (par exemple &quot;B16&quot; pour le nom de bien). Une fenêtre demandant un nom de groupe (par exemple, «Nousll &quot;) apparaîtra, entrez un nom. membres du groupe extrait du fichier sera affiché sur le tableau de groupe (par exemple, la liste complète des noms et). Pour ajouter des informations supplémentaires non présentes dans le nom de fichier, cliquez sur le&quot; (facultatif) Suivant &quot;. Cliquez sur&quot; Ajouter des métadonnées Groupe &quot;, entrez le nom du groupe supplémentaire (par exemple&quot; des médicaments &quot;) et pour chaque valeur du groupe prédéfini (par exemple:« Eh bien »), entrez la valeur (par exemple,« Taxol ») . Il n&#39;y a pas de limite au nombre de groupes supplémentaires qui peuvent être ajoutés. </li><li> Enfin, cliquez sur &quot;Créer MetadataFile&quot; pour générer le fichier de métadonnées et de poursuivre l&#39;analyse. Si un fichier de métadonnées a été généré précédemment, les étapes ci-dessus peuvent être évités en chargeant directement le fichier en utilisant l&#39;option &quot;Fichier de métadonnées&quot; (décrit dans 3 ci-dessous). </li></ol></li><li> Modèles Expression régulière base: Les expressions régulières sont une approche standard pour les modèles correspondantdans le texte. Choisissez cette option lorsque le nom de fichier et / ou de la structure de répertoire contiennent suffisamment d&#39;informations pour des images de groupe et la convention de dénomination correspond à un des modèles pré-existants. Les modèles personnalisés basés sur les expressions régulières peuvent également être définis et réutilisés manuellement. Cette option avancée est recommandé uniquement pour les utilisateurs familiers avec les expressions régulières. </li><li> Métadonnées Fichier: Choisissez cette option pour personnalisation ultime. Définir et charger un séparées par des virgules valeurs (CSV) contenant les noms de fichiers et les métadonnées associées à chaque image. Un exemple de format de fichier est disponible sur la partie téléchargement du site web (phenoripper.org). Il suffit de charger le fichier via l&#39;interface pour afficher les informations qu&#39;il contient. </li></ol></li><li> Sélectionnez le champ de métadonnées qui définit répétitions dans l&#39;expérience d&#39;éviter l&#39;échantillonnage redondant. Pour les jeux de données qui contiennent des répétitions (par exemple toutes les images dans un puits devraient être similaires), les regrouper (par exemple en bien) peut améliorperformances ove. Dans la plupart des cas, il est raisonnable de choisir l&#39;option par défaut &quot;au hasard (je ne sais pas)&quot;, qui sélectionne un sous-ensemble aléatoire. </li></ol> 2.2 Réglage Paramètres d&#39;analyse Cliquez sur &quot;Définir les paramètres&quot; pour définir les paramètres nécessaires pour traiter l&#39;ensemble de données. Les paramètres à définir sont sur le panneau de gauche. Le panneau de droite affiche un échantillon fusionné de l&#39;ensemble de données. Cliquez sur les flèches gauche / droite pour basculer entre les différentes images. <ol><li> Seuil Intensité: Choisissez une valeur de seuil approprié pour identifier plus ou moins les parties cellulaires (plutôt que le fond, les régions non cellulaires) d&#39;images. Un seuil est précalculée par PhenoRipper, mais peut être ajusté pour améliorer la mise en évidence des régions cellulaires en utilisant la barre de défilement sur le dessus de l&#39;image. Si un seuil choisi ne fonctionne pas sur toutes les images, abaisser le seuil de façon à inclure des régions non cellulaires plutôt que de laisser tomber les régions cellulaires. </li><li> Bloquer Siser: Choisissez une taille de bloc appropriée (en pixels) de la grille de l&#39;image. Blocs de taille spécifiée seront superposés sur l&#39;image. Ajuster la taille du bloc pour obtenir une moyenne de 20-30 blocs / cellule. Pour superposer la grille sur l&#39;image, cliquez sur la case en face du champ &quot;Block Size&quot;. </li><li> Paramètres optionnels: Si les images auto-échelle ne présentent des marqueurs avec des intensités relatives souhaitées (par exemple, une couleur est saturée) ou si les marqueurs doivent être larguées à partir de l&#39;analyse, utilisez l&#39;option &quot;Ajuster l&#39;intensité du canal». Pour identifier les régions cellulaires sur un sous-ensemble de marqueurs utiliser les &quot;canaux utilisés pour Threshold&quot; option. Les choix par défaut des autres paramètres sont généralement suffisant, mais si nécessaire, les régler en utilisant les &quot;Options d&#39;analyse avancée&quot;. </li><li> Exécutez l&#39;analyse en appuyant sur &quot;PhenoRip&quot; sur le panneau principal de l&#39;application. PhenoRipper identifie automatiquement les types de blocs récurrents dans les images. Profils phénotypiques seront générés pourchaque image en fonction des fractions de différents types de blocs à l&#39;intérieur. </li></ol> 3. Résultats Explorer <ol><li> Explorer les relations entre les profils phénotypiques des images en utilisant le PhenoBrowser (Figure 1). L&#39;interface PhenoBrowser se compose de quatre panneaux: le panneau en haut à gauche est une représentation graphique (nuage de points) de la relative similitude entre les différentes images / conditions, les deux panneaux sur les bons exemples d&#39;images d&#39;affichage de certaines conditions, et le panneau final (graphique à barres ) compare leurs profils phénotypiques. </li><li> &quot;Jeter Cadres vides&quot; en utilisant le menu &quot;Traitement des données&quot;. </li><li> Supprimer les images de mauvaise qualité: Tout d&#39;abord, pour étudier des images individuelles s&#39;éteignent groupe dans le menu &quot;Traitement des données&quot;. Ensuite, cliquez sur les points de aberrantes dans le nuage de points et jetez les images de faible qualité (par exemple, de se concentrer, artefact coloration). </li><li> Explorez les données: Décidez qui définit les métadonnées sur le terrainune unité de base de comparaison (par exemple, pour comparer les médicaments, les images ayant la même valeur du champ de métadonnées «drogue» doivent être regroupées). Réduire toutes les images avec la même valeur de ce champ de métadonnées dans un seul point de données avec &quot;Groupe par&quot;. Par exemple, le regroupement par médicament moyenne des images au sein de chaque médicament pour obtenir un point par médicament. Le secteur abrite (ou éloignés) dans le nuage de points reflètent les conditions qui suscitent des phénotypes cellulaires similaires (ou différents). Couleur ou étiquettes des points (menu d&#39;affichage de données) sur la base de métadonnées disponibles pour aider l&#39;intelligibilité. L&#39;intrigue est rotatif 3D en cliquant sur la case à cocher &quot;tourner&quot; et en cliquant sur le bouton gauche et en faisant glisser la souris dessus. </li><li> Sélectionnez deux points différents pour les comparer directement. Les panneaux d&#39;image affiche des images échantillons pour chaque point, et le panneau graphique à barres affichent les types de blocs dont les fréquences occurrence sont les plus différents entre les deux points. </li><li> Lancer la clustergram dans le menu &quot;Clustergram&quot; pour fournir une vue plus globale de la relation entre les types de blocs et des conditions expérimentales. En regroupant les deux types et conditions bloc, cette représentation met en évidence les phénotypes cellulaires qui distinguent le mieux les groupes de conditions (figure 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le flux de travail décrit ici permet de caractériser rapide et facile et la comparaison des images de microscopie. Nous avons d&#39;abord montré comment ce flux de travail peut aider à l&#39;optimisation de l&#39;expérience, par exemple en effectuant rapidement le contrôle de la qualité sur les images de microscopie. Ensuite, nous avons démontré son potentiel pour l&#39;analyse des données de criblage à haut débit: nous étions en mesure de médicaments du groupe en fonction de leur mécanisme d&#39;action. ...

Au cours de la dernière décennie, les progrès rapides de la technologie d&#39;imagerie ont donné de nombreux laboratoires la possibilité d&#39;effectuer la microscopie à haut débit. Le défi est maintenant passé de l&#39;une des images à une analyse. Comment pouvons-nous caractériser, comparer, et d&#39;explorer le torrent de phénotypes subtils complexes générées par un écran d&#39;imagerie à haut débit typique? Un certain nombre d&#39;images d&#39;analyse et de plateformes informatiques ont donné utilisateurs boîtes à outils sophistiqués 1-3 pour extraire des informations biologiques provenant de grandes collections d&#39;images. Pourtant, de nombreux obstacles restent importants dans l&#39;analyse des données de écrans à base d&#39;images à haut débit. Difficultés à choisir caractérisations appropriées des images et un réglage fin des paramètres algorithmiques (le système d&#39;intérêt) entraînent souvent des délais d&#39;établissement, en particulier pour les utilisateurs sans compétences d&#39;analyse d&#39;image. En particulier, la segmentation cellulaire, le processus d&#39;identification de cellules individuelles dans unn l&#39;image, est un obstacle majeur à cet égard. La segmentation peut être très sensible à des paramètres expérimentaux tels que le type de cellules, la densité cellulaire et des bio-marqueurs, et nécessite souvent l&#39;ajustement répété pour un grand ensemble de données. Pour ces raisons, l&#39;analyse d&#39;image est souvent une étape terminale indépendante réalisée par des spécialistes plutôt que de faire partie intégrante du flux de travail expérimental. Cela empêche le cycle de rétroaction rapide entre l&#39;analyse et l&#39;expérimentation, un élément essentiel du développement de dosage. Nous décrivons ici un autre flux de travail qui est optimisé pour haut débit de microscopie par fluorescence et évite bon nombre des difficultés mentionnées ci-dessus. À cette fin, nous faisons usage de PhenoRipper 4, une plate-forme logicielle open-source pour l&#39;exploration et l&#39;analyse des images de microscopie rapide. De manière significative, PhenoRipper évite beaucoup de défis liés à la segmentation des cellules en n&#39;essayant pas d&#39;identifier des cellules individuelles. Au lieu de cela, PhenoRipper divise les images en pixelsblocs de taille subcellulaire et caractérise images en termes de blocs qu&#39;ils contiennent. Plus précisément, PhenoRipper profils blocs en termes de base-colocalisation-marqueurs caractéristiques et identifie automatiquement 4 types de blocs les plus représentatifs dans les images d&#39;apprentissage. PhenoRipper attribue alors à chaque bloc de type de bloc représentant le plus similaire, et finalement caractérise des images basées sur les types des blocs qu&#39;elles contiennent. Comparé à-cellulaires simples approches plus traditionnelles, cette approche nécessite un réglage amende minimale et l&#39;expertise. Ainsi, les utilisateurs ne doivent régler deux paramètres: la taille de bloc et une intensité de seuil (à jeter parties non cellulaires d&#39;une image), qui sont tous deux mis à la rétroaction graphique. Surtout, le flux de travail décrit ici a été démontré à l&#39;échelle 4 facilement à beaucoup de plus grands ensembles de données, où la vitesse et le réglage amende minimale fournit grand temps et des gains de fiabilité. Dans la pratique, nous constatons que cette applicationgardon réduit le temps nécessaire à la fois pour l&#39;installation et l&#39;exécution de plusieurs ordres de grandeur 4. La sortie principale du PhenoRipper est une représentation visuelle de l&#39;image de similitude, ce qui permet à l&#39;utilisateur d&#39;identifier des groupes de conditions expérimentales qui causent des cellules à afficher des phénotypes similaires. Les groupements PhenoRipper trouve généralement ont &quot;intelligibilité biologique&quot; comparables à ceux générés par d&#39;autres méthodes, à base de cellules fastidieuses 4. Dans la pratique, cela signifie que, souvent, dans une demi-heure de l&#39;exécution d&#39;une expérience typique de 96 puits microscopie de fluorescence, un expérimentateur sans expérience d&#39;analyse d&#39;image avant peut obtenir une lecture fiable de la performance de son expérience. L&#39;expérimentateur peut alors commencer à explorer les relations entre les différentes conditions expérimentales et concernant ces relations à des phénotypes d&#39;image. Nous démontrons ce flux de travail ici en analysant les effetsdes médicaments dans les classes mécanistiques distinctes sur les cellules HeLa colorées pour les marqueurs d&#39;ADN et du cytosquelette. Images de cellules traitées avec la même classe de médicaments ont été regroupés, et des images de mauvaise qualité (artefacts de coloration, sur des cellules de réflexion et ainsi de suite) sont apparus comme des valeurs aberrantes, ce qui les rend faciles à identifier et potentiellement jeter. Bien que ce flux de travail est utile pour un grand nombre d&#39;essais basés sur l&#39;image, il ya clairement de nombreuses situations où une approche différente pourrait être plus informatif. Par exemple, la sortie de PhenoRipper est essentiellement une comparaison relative des motifs de fluorescence dans des conditions expérimentales. Si une caractérisation absolue d&#39;une caractéristique spécifique d&#39;une cellule unique est nécessaire à la place (par exemple le nombre de mouchetures dans une cellule), une seule analyse à base de cellules serait nécessaire. Néanmoins, même dans ce type de situation, PhenoRipper est susceptible de détecter des changements dans ces phénotypes unicellulaires et donc être un outil utile pour le dosage optisation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

Malgré les progrès rapides de la microscopie à haut débit, les tests basés sur l&#39;image quantitatives posent encore des défis importants. Bien qu&#39;une variété d&#39;outils spécialisés d&#39;analyse d&#39;images sont disponibles, la plupart des workflows traditionnels à base de d&#39;analyse d&#39;image ont des courbes d&#39;apprentissage (pour un réglage fin des paramètres d&#39;analyse) et conduisent à longs délais d&#39;exécution entre l&#39;imagerie et l&#39;analyse. En particulier, la segmentation de la cellule, le processus d&#39;identification des cellules individuelles dans une image, est un obstacle majeur à cet égard. Nous présentons ici un suppléant, sans segmentation des cellules workflow basé sur PhenoRipper, une plate-forme logicielle open-source conçu pour l&#39;analyse et l&#39;exploration des images de microscopie rapide. Le pipeline présentée ici est optimisé pour des images de microscopie par immunofluorescence de cultures de cellules et nécessite une intervention minimale de l&#39;utilisateur. En une demi-heure, PhenoRipper peut analyser des données à partir d&#39;une expérience typique de 96 puits et de générer des profils d&#39;image. Les utilisateurs peuventalors explorer visuellement leurs données, effectuer un contrôle de la qualité de leur expérience, assurer une réponse aux perturbations et vérifier la reproductibilité de répétitions. Ceci facilite un cycle de rétroaction rapide entre l&#39;analyse et l&#39;expérience, ce qui est essentiel au cours de l&#39;optimisation du dosage. Ce protocole est utile non seulement comme une première analyse de la transmission du contrôle de qualité, mais également peut être utilisée comme une solution de bout en bout, en particulier pour le criblage. Le flux de travail décrit ici échelles de grands ensembles de données tels que ceux générés par des écrans à haut débit, et a été montré à la catégorie des conditions expérimentales par phénotype précision sur une large gamme de systèmes biologiques. L&#39;interface PhenoBrowser fournit un cadre intuitive pour explorer l&#39;espace phénotypique et d&#39;associer les propriétés d&#39;image pour annotations biologiques. Dans l&#39;ensemble, le protocole décrit ici permettra de réduire les obstacles à l&#39;adoption analyse quantitative des écrans d&#39;image en fonction.

Ici, nous avons testé la capacité de ce flux de travail à des médicaments du groupe en fonction de leur mécanisme d&#39;action. Des cellules HeLa ont été ensemencées dans 30 puits d&#39;une plaque à 384 puits et on les colore pour l&#39;ADN / actine / α-tubuline. Les anticorps spécifiques des anticorps primaires, secondaires marqués par fluorescence, et d&#39;autres colorants fluorescents qui ont été utilisés sont listés dans le tableau de matériaux. Les puits ont été traités avec des 15 médicaments...

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Nous décrivons ici un flux de travail pour analyser rapidement et collections d&#39;images de microscopie de fluorescence à l&#39;aide PhenoRipper, une plate-forme d&#39;analyse d&#39;image récemment développé explorer.

Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

rapid-analysis-and-exploration-of-fluorescence-microscopy-images

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K vues.  UT Southwestern Medical Center.  Nous décrivons ici un flux de travail pour analyser rapidement et collections d'images de microscopie de fluorescence à l'aide PhenoRipper, une plate-forme d'analyse d'image récemment développé explorer. 

Vidéo: Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Recherche

Biologie

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Électrofusion cellulaire visualisé par microscopie à fluorescence

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Analyse quantitative de l&#39;autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Analyse de l&#39;autophagie dans<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; À l&#39;aide de famine Pads en association avec microscopie de fluorescence

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identification des Kinesin-1 Cargos utilisant microscopie à fluorescence

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualisation Fréquence Stromule avec Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source Content Haute Analyse Utilisant automatisé Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Dynamique d'oligomerisation des récepteurs de surface cellulaire dans les cellules vivantes par microscopie de fluorescence interne totale combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images

Résumé

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