Nous remercions Brian G. Coon et Claudia B. Hanna pour des discussions utiles et de soutien. Ce projet a été soutenu par fonds de démarrage du Dép. des sciences biologiques, Université de Purdue à R. Claudio Aguilar et une société américaine du cancer Subvention de recherche institutionnelle à R. Claudio Aguilar via le Centre de Purdue Cancer.

Culture cellulaire et d&#39;induction des protéines A. Cette section décrit les conditions de culture cellulaire, cycle cellulaire synchronisation avec Nocodazole, suivie par l&#39;induction de l&#39;expression de la protéine à partir d&#39;un promoteur régulable dans des cellules de levure. <ol><li> La souche de type sauvage de levure W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) est transformé avec de copies (2μ) ADN plasmidique qui contient notre gène d&#39;intérêt (ENTH2) sous le contrôle d&#39;un promoteur répressible par la méthionine (MET25). 2 mM de méthionine est suffisante pour supprimer l&#39;activité du promoteur, tandis que des milieux sans méthionine permet une expression maximale. Par conséquent, une gamme de concentrations de méthionine peut être utilisé pour exprimer la protéine au niveau désiré. 1 Transformation d&#39;ADN plasmidique dans les cellules W303 est fait en utilisant la méthode LiAc-TE selon les procédures standard 2. Remarque: Cette expérience doit être réalisée par culture des cellules pendant la nuit, en présence de 2 mM de moithionine pour assurer l&#39;expression des protéines seulement à des niveaux de fond. Le lendemain matin, l&#39;expression de protéines devrait être induite par remise en suspension des cellules dans des milieux dépourvus de méthionine immédiatement après la synchronisation du cycle cellulaire (environ 4h). Cependant, nous avons constaté que le phénotype cellulaire dépendante ENTH2 division est induite qu&#39;après une forte concentration de ENTH2 s&#39;est accumulée dans les cellules (en général après 4-6h de 3 induction de protéines), ce qui rend le cours du temps pour l&#39;analyse de toutes les manifestations de le phénotype très longue (au moins 16h). Nous avons constaté que la croissance des cellules au jour le jour, en présence de 0,2 mM de méthionine réprime le phénotype morphologique mais permet la concentration de protéines sous-critique qui peut être augmentée rapidement au phénotype induisant des niveaux lorsqu&#39;ils sont transférés à des milieux sans méthionine. Cela permet une analyse détaillée des manifestations graves de la défectuosité de la division cellulaire dans une période relativement courte de temps. Nous recommandons par conséquent que la détermi expérimentateure la concentration de méthionine qui est sous-seuil pour l&#39;induction phénotype au cas par cas. </li><li> Choisissez six colonies partir d&#39;une plaque contenant des cellules transformées récemment et l&#39;inoculer dans 50 ml de milieu sélectif avec la méthionine 0,2 mM dans une fiole conique stérilisé en utilisant des techniques stériles. Incuber une nuit à 30 ° C avec agitation à 200 rpm. (Pour plus d&#39;informations sur les conditions standard de culture de levures, voir réf. 4) </li><li> Le lendemain matin, estimation de la densité cellulaire en mesurant la densité optique de la culture à 600 nm. Transférer l&#39;équivalent de 20 600 nm DO de cellules dans un tube de centrifugation stériles et récolte par centrifugation à 2200 rpm pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Resuspendre les cellules dans YPD à une concentration de 0,4 DO 600 nm / ml et ajouter Nocodazole à une concentration finale de 15μg/ml d&#39;un stock de 1mg/ml dans du DMSO. Incuber pendant 4h à 30 ° C sous agitation à 200rpm. Méthodes alternatives, y compris un arrêt: Noterrest à la phase G0 à l&#39;aide du facteur alpha ou en phase de G1-S en utilisant l&#39;hydroxyurée peut être utilisé. Nous avons trouvé que l&#39;arrestation lors de la mitose en utilisant Nocodazole est simple et assez efficace pour nos besoins. </li><li> Après 4h, vérifiez pourcentage de cellules en mitose arrêtés en comptant le nombre de cellules avec des bourgeons de taille égale en regardant au microscope. Si l&#39;arrestation est supérieur à 90%, passez à l&#39;étape suivante. Sinon, maintenir les cellules dans Nocodazole jusqu&#39;à ce que le pourcentage désiré de arrêt de la mitose est atteint. </li><li> Récolte des cellules par centrifugation à 2200 rpm pendant 5 minutes et laver avec de l&#39;eau glacée à trois reprises. Après le lavage final, les resuspendre dans des milieux sélectifs manquent de méthionine à une densité cellulaire d&#39;environ 600 nm 0,5 DO / ml. Transférer la moitié du volume de cellules dans un nouveau tube stérile et ajouter la méthionine à une concentration finale de 0,2 mM. Cela permet un contrôle des effets dus aux niveaux de base de l&#39;expression des protéines. Il s&#39;agit de la première fois, le point de l&#39;expérience (time = 0h). Analyser les cellules toutes les heures pendant 6h. </li></ol> B. Analyse du développement Phénotype Remarque: Toutes les méthodes d&#39;analyse décrites ci-dessous n&#39;ont pas besoin d&#39;être exécutées simultanément. Détermination des niveaux d&#39;expression des protéines par western blot <ol><li> A chaque point dans le temps, mesurer l&#39;OD 600 nm de la culture et de la récolte 2 DO 600nm équivalents de cellules par centrifugation à 2200 rpm pendant 5 minutes. </li><li> Reprendre le culot dans 1 ml d&#39;eau stérile et transférer la suspension dans un tube de 1,5 ml Eppendorf. Répétez la centrifugation pour obtenir un culot. Aspirer le surnageant. </li><li> Reprendre le culot dans 50 pl de SDS-PAGE tampon échantillon de Laemmli (Tris 50 mM pH 6,8, SDS 2%, glycérol 10%, β 2%-mercaptoéthanol et 0,006% bleu de bromophénol). Ajouter 50 ul de billes de verre lavées à l&#39;acide (0.2-0.4 microns de diamètre) et vortex pendant 1 min. </li><li> Faire bouillir les tubes sur un 95 ° C blo chaleurck pendant 2 minutes, tourbillon à nouveau pendant 30 secondes et reprendre l&#39;ébullition pendant 5 minutes. Congeler l&#39;échantillon de protéine à -20 ° C. </li><li> Exécuter échantillons de protéines sur un 12% gel SDS-PAGE, transfert sur une membrane de nitrocellulose et d&#39;effectuer Western blot avec des anticorps appropriés pour détecter la protéine d&#39;intérêt. Dans cet exemple, nous sondons la présence de l&#39;hémagglutinine (HA) taggés domaines Enth par incubation avec la souris anticorps anti-HA (Covance, Princeton, NJ) à 1:2000 dilution dans Blotto-Tween (1XPBS, 5% de lait écrémé sec , 0,1% Tween). HRP étiquetés de chèvre anti-anticorps de souris secondaire (Pierce) à une dilution de 1:2500, également en Blotto-Tween, est autorisé à lier l&#39;anticorps primaire sur la membrane pendant 1 heure à température ambiante. Supersignal West Pico Substrat chimiluminescent est utilisé pour détecter HRP anticorps marqué souris anti. </li><li> Quantifier les niveaux d&#39;expression de protéines par densitométrie. </li></ol> Cette section décrit deux méthodes de développement phénotype de suivi en fonction des incrémentsasing concentration en protéines. La première méthode est basée population de cellules, tandis que la deuxième étude il au niveau d&#39;une seule cellule. Quantification de la division cellulaire et la mort cellulaire phénotype <ol><li> A chaque point dans le temps, transférer 1 ml de suspension cellulaire dans un tube stérile eppendorf utilisant des techniques stériles et les cellules de récolte par centrifugation à 2200 rpm pendant 5 minutes. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 70μl médias, suivis par 30μl de bleu de méthylène à partir d&#39;un stock de 1mg/ml dans l&#39;eau stérile. Le bleu de méthylène est un colorant bleu vitale qui devient incolore dans l&#39;environnement réducteur du cytosol où les cellules mortes peuvent être identifiés par leur couleur bleue. </li><li> Pipette ~ 6μl de cette suspension sur une lame de verre propre et placer une lamelle sur la goutte. Appuyer sur la lamelle doucement pour former une couche mince et uniforme de cellules entre les interfaces verre. </li><li> Diviser la lamelle en 9 quadrants et prendre 3 images par quadrant en salleicated la Fig. 2. Le nombre de cellules / champ ne doit pas être supérieur à 30 cellules pour permettre une quantification précise. Chaque lamelle peut être visualisé pendant environ 15 minutes avant que les bulles d&#39;air endommager la préparation. </li><li> Compter le nombre de cellules présentant le phénotype à l&#39;étude. Le défaut de la division cellulaire induite lors de ENTH2 surexpression conduit à la mort cellulaire et, par conséquent, nous avons également compter le nombre de cellules mortes identifiés par leur couleur bleue. </li><li> Calculer le pourcentage de cellules phénotypiques. </li><li> Tracer les données comme indiqué dans la Fig. 3. </li></ol> Visualisation des phénotypes spécifiques à l&#39;aide de la microscopie à fluorescence défauts Division cellulaire des cellules défectueuses, comme on le voit sur ENTH2 surexpression, sont souvent caractérisés par des défauts de cellules mur et septines mislocalization3 (visualisé comme protéines de fusion GFP). La paroi cellulaire de la levure bourgeonnante peuvent être facilement visualisées par coloration avec calcofluor blanc (CFW) qui se lie irréversiblement à la chitine dans la levureles parois cellulaires. <ol><li> A chaque fois 1ml point aliquotes, de la culture dans un tube stérile eppendorf et les cellules de récolte par centrifugation à 2200 rpm pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 ul de solution CfW 1mg/ml dans l&#39;eau stérile et incuber pendant 5 minutes à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Récolte des cellules par centrifugation et laver 3 fois avec du PBS 1X. </li><li> Reprendre le culot dans 100 ul de PBS 1X et de l&#39;image au microscope optique à l&#39;aide de la paroi cellulaire (UV) et filtre FITC (GFP-septines) à un grossissement de 100X. </li><li> Quantifier le pourcentage de cellules avec anomalie de la paroi cellulaire et la mauvaise localisation septines en suivant les étapes 4-6 dans la section B.2.1 </li></ol> B.3. Détermination du phénotype de développement au niveau de la cellule unique: la vidéo-microscopie time-lapse. <ol><li> Nettoyer une lame de verre avec une dépression concave avec 70% d&#39;alcool et laisser sécher à l&#39;air. </li><li> Faire bouillir 0,06 g d&#39;agarose dans 5ml milieux sélectifs qui n&#39;ont pas methionine dans un tube de verre stérile dans un four micro-ondes jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose dissout complètement. </li><li> Rapidement pipette 200 ul de l&#39;agarose contenant médias dans la dépression diaporama et retourner une autre lame de verre propre sur elle, en veillant à ce qu&#39;aucune bulle d&#39;air n&#39;est piégée en dessous. </li><li> Quand le gel se solidifie, déplacer le tiroir sans à-coup sur le dessus loin de la glissière dépression, en maintenant leurs surfaces parallèles à tout moment. Ceci assure que la surface du lit d&#39;agarose est de niveau avec la surface de la lame dépression. Nettoyez la région de coulissement entourant le lit d&#39;agarose avec un tissu délicat. La diapositive est maintenant prêt à être utilisé. </li><li> A l&#39;heure = 4 heures, 1 ml de transfert de cellules de la culture dans un tube eppendorf stérile et la récolte par centrifugation à 2200 rpm pendant 5 min à température ambiante. Remarque: Il est recommandé un point dans le temps plus tard, être choisi pour assurer des niveaux élevés d&#39;expression de la protéine ainsi que le développement phénotype est garanti. Des expériences pilotes sont tenus de determine temps d&#39;induction au cas par cas. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 ul de milieu sélectif frais dépourvus de méthionine. </li><li> Appliquer de la vaseline sur les bords de la lamelle. Ensuite, placez une goutte de suspension cellulaire au centre du lit d&#39;agarose et répartie uniformément en appuyant doucement sur une lamelle sur eux. </li><li> Sceller les bords de la lamelle avec de la vaseline et de fixer sa position en alignant les bords avec du vernis à ongles. Attendez jusqu&#39;à ce que le séchage de vernis à ongles. </li><li> Placez la lame sur une platine chauffante d&#39;un microscope et choisissez un champ qui ne contient pas plus de 10 cellules espacées de manière adéquate. Comme les cellules se divisent, le champ sera pris d&#39;assaut au fil du temps. </li><li> Prendre une image du champ de toutes les 5 minutes pendant ~ 5 heures. Progression phénotype peut être étudié par l&#39;assemblage des images dans un film à l&#39;aide du logiciel ImageJ ( <a name="cite">Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info</a>.nih.gov / ij /, 1997-2005) </li></ol> Remarque: Nous utilisons microscope Zeiss Axiovert 200M, Zeiss Axiocam MRm monochrome appareil photo numérique et Carl Zeiss AxioVision logiciel d&#39;acquisition d&#39;image (version 4.4) pour l&#39;imagerie de cellules vivantes. Contrôle de la température est obtenue en plaçant des diapositives sur une platine chauffante maintenue à 30 ° C par le TempControl PECON 37 périphérique. Afin d&#39;éviter de ré-ajuster la mise au point à plusieurs reprises, il est commode de programmer le logiciel d&#39;acquisition d&#39;images pour acquérir automatiquement quelques z-stack images à chaque point dans le temps et choisir l&#39;image avec la meilleure mise au point plus tard, lors du montage du film. Certains logiciels d&#39;acquisition d&#39;image ont la possibilité de mise au point automatique pour des expériences suivies dans le temps. Il est commode d&#39;utiliser cette option dans le cas échéant. Cellules de levure de type sauvage poussent mieux à 30 ° C de contrôle où la température est critique. Afin deassurer une température adéquate, il est utile de fournir une source de chaleur externe, en plus de la platine chauffante. Par exemple, nous laissons la lumière transmise blanc du microscope pendant toute la durée de l&#39;imagerie. Il est également essentiel pour éviter les bulles d&#39;air lors de la préparation du lit agarose et sandwich de cellule. L&#39;air piégé dans les bulles se dilate lorsqu&#39;il est chauffé dans le temps et ont tendance à pousser les cellules hors du champ représenté par une image. Il est également important de s&#39;assurer que les positions des cellules individuelles dans le domaine n&#39;ont pas changé de façon appréciable au cours de la durée du processus d&#39;imagerie, en particulier pendant les tentatives de recentrage. Plugins stabilisation d&#39;image sont disponibles pour ImageJ pour remédier à de faibles variations de position de la cellule après le film a été monté. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ Kangli / code / Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).</li></ol>

Ce protocole décrit comment suivre le développement d&#39;un phénotype morphologique (cellule de levure incapable de subir une division cellulaire proprement dite) sur surexpression de la protéine. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de récolter des cellules de levure par granulation à la vitesse de centrifugation recommandé que des vitesses plus rapides peuvent endommager les cellules et les résultats obscurs. Le bleu de méthylène et du blanc de calcofluor doit être ajout...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> Nocodazole </td><td> Réactif </td><td> Sigma (St. Louis, MO) </td><td> M1404 </td><td></td><tr><td> Bleu de méthylène à 1% (p / v) </td><td> Réactif </td><td> VWR International </td><td> VW6276-0 </td><td></td><tr><td> Calcofluor blanc </td><td> Réactif </td><td> Sigma (St. Louis, MO) </td><td> F3543 </td><td></td><tr><td> Vaseline </td><td> Réactif </td><td> VWR International </td><td> VW3339-2 </td><td></td></tbody></table></div>

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

Délétion du gène et surexpression de la protéine sont des méthodes courantes pour l&#39;étude des fonctions des protéines. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l&#39;analyse du développement phénotype en fonction de la concentration de protéines au niveau de la population et une seule cellule dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Bien que ce protocole est basé sur la surexpression d&#39;une protéine, il peut facilement être adapté pour phénotypes morphologiques dépendant de la suppression de l&#39;expression des protéines. Notre laboratoire s&#39;intéresse à l&#39;étude des propriétés de signalisation de la protéine adaptatrice epsin endocytose. À cette fin, nous avons utilisé une approche dominante négative dans laquelle nous surexprimé l&#39;conservée<u&gt; E</u&gt; PSIN<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; Erminal<u&gt; H</u&gt; Omology (ENTH) de domaine dans le but d&#39;interférer avec les fonctions de endogène epsin-2 (Ent2 ou YLR206W). Nous avons observé que la surexpression du domaine de ENTH Ent2 (ENTH2) dans les cellules de type sauvage a conduit à un défaut de la division cellulaire qui dépend de la mauvaise localisation d&#39;une famille de protéines d&#39;échafaudage, septines.

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Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Délétion du gène et surexpression de la protéine sont des méthodes courantes pour l&#39;étude des fonctions des protéines. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l&#39;analyse du développement phénotype en fonction de la concentration de protéines au niveau de la population et une seule cellule dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

Analyse du développement d&#39;un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

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10.7K vues.  Purdue University. Délétion du gène et surexpression de la protéine sont des méthodes courantes pour l'étude des fonctions des protéines. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l'analyse du développement phénotype en fonction de la concentration de protéines au niveau de la population et une seule cellule dans Saccharomyces cerevisiae.

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Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

L&#39;utilisation de Rotorod comme une méthode pour l&#39;analyse qualitative de la marche chez le rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

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Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mesure Life Span réplicative dans la levure bourgeonnante

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importance de la concentration de protéines correct pour Cinétique et Détermination d&#39;affinité en analyse structure-fonction

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bourgeonnement de levure extraction et purification des protéines pour l&#39;étude de la fonction, Interactions, et des modifications post-traductionnelles

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analyse de néphron Composition et fonction du rein poisson zèbre adulte

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

L&#39;imagerie à haute résolution et d&#39;analyse de l&#39;individu Astral microtubules Dynamique dans la levure bourgeonnante

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...