Les tests d’innocuité de nouveaux médicaments sont essentiels, et ce protocole décrit comment utiliser des normes validées pour évaluer la reproductibilité, la robustesse et les limites potentielles d’une plateforme CRS. Cette technique a été validée avec ces réactifs dans 11 laboratoires différents et dans une étude collaborative internationale avec des modèles de réponse similaires observés, améliorant ainsi les efforts d’harmonisation et de reproductibilité. Les applications de cette technique s’étendent à l’amélioration des tests de risque CRS de nouveaux anticorps thérapeutiques, et elle aidera également à être prêt pour la prise en charge clinique des effets secondaires potentiels.
Ce travail vise à améliorer la reproductibilité et l’harmonisation, et une démonstration visuelle augmente les chances de reproductibilité. Commencez par reconstituer le contenu des ampoules du réactif de référence dans un millilitre d’eau distillée stérile et laissez reposer 5 à 10 minutes de réhydratation. Ensuite, mélangez correctement chaque solution d’anticorps avant de la transférer dans un tube stérile bouché.
Ensuite, diluez chaque anticorps reconstitué et testez l’anticorps à 10 microgrammes par millilitre dans du PBS stérile. Prenez une plaque de microtitre en polypropylène à 96 puits stérile, non traitée TC, et ajoutez 100 microlitres de la solution d’anticorps diluée souhaitée dans les puits désignés de la plaque. Ensuite, incubez la plaque pendant une nuit à quatre degrés Celsius avant d’effectuer le test en phase solide.
Après avoir prélevé un minimum de 30 millilitres de sang total périphérique dans un tube hépariné, retournez-le plusieurs fois pour assurer un bon mélange de l’échantillon de sang avec de l’héparine sodique. Mettez de côté 15 millilitres de l’échantillon de sang entier dans un tube séparé pour une utilisation ultérieure dans le test de sang total en phase aqueuse. Diluez les 15 millilitres restants de sang total en ajoutant un volume égal de PBS ou de milieu RPMI 1640 sans sérum.
Superposez doucement le sang dilué sur 15 millilitres d’un milieu à gradient de densité dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger le tube à l’aide d’un rotor pivotant sans frein et avec une accélération réduite à 500 G et à température ambiante pendant 20 minutes pour séparer le sang en ses différents composants. Après centrifugation, le gradient de densité se sépare en une couche supérieure de plasma, suivie d’une fine couche de couche leucocytaire contenant des PBMC et d’une couche inférieure contenant des globules rouges et des granulocytes polymorphonucléaires, y compris les neutrophiles et les éosinophiles.
Retirez soigneusement la couche supérieure de plasma, puis la couche suivante, pour récolter les PBMC. Pour le lavage, mettez en suspension la couche leucocytaire récoltée dans 10 millilitres de PBS ou de milieu RPMI 1640 sans sérum. Centrifugez le tube à partir de 500 G pendant 10 minutes pour granuler les cellules.
Jetez le surnageant et répétez le lavage. Ensuite, remettez en suspension la pastille résultante dans deux millilitres de média RPMI complet. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la concentration de PBMC à 1 million de cellules par millilitre en RPMI complet.
Pour le test de libération de cytokines dans le sang total en phase aqueuse, prélever l’échantillon de sang entier préalablement mis de côté, ajouter 190 microlitres de l’échantillon dans les puits d’une plaque de polystyrène à fond en U de 96 puits, des anticorps de traitement thermique et des réactifs de référence pré-dilués à 100 microgrammes par millilitre dans du PBS, et ajouter 10 microlitres de l’anticorps dilué souhaité dans les puits désignés contenant 190 microlitres de sang total. Incuber la plaque pendant 48 heures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius. Pour le test de libération de cytokines PBMC en phase solide, obtenir les plaques revêtues préalablement préparées.
À l’aide d’une pipette multicanaux, jeter la solution d’anticorps des plaques revêtues. Après avoir rempli un réservoir de réactif avec du PBS, lavez la plaque trois fois avec 200 microlitres de PBS pour éliminer les anticorps monoclonaux non liés. Ajoutez 200 microlitres de la suspension PBMC préalablement préparée dans chaque puits.
Incuber la plaque pendant 48 heures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation de 48 heures avec des anticorps monoclonaux de contrôle et de test, centrifuger les plaques à 400 G pendant cinq minutes. Prélevez le milieu conditionné ou le plasma sans perturber la pastille cellulaire.
Congelez le surnageant ou le plasma recueilli à moins 20 degrés Celsius. Les résultats de l’essai en phase solide PBMC ont démontré que les anticorps de contrôle positifs induisaient des niveaux significativement élevés de cytokines par rapport aux témoins isotypes appariés. Il a également été observé que le superagoniste anti-CD28 induisait une variation significativement plus élevée de l’interleukine-2, ou libération d’IL-2, que son isotype correspondant, tandis que l’anti-CD3 et l’anti-CD52, tout en induisant l’expression de l’IL-2, entraînaient des modifications plus faibles.
Dans l’essai en phase aqueuse du sang total, le taux de cytokines détectables était relativement inférieur à celui de l’essai en phase solide, mais était caractérisé par une plus grande sensibilité à la stimulation par l’anti-CD52.
