Nous tenons à remercier Kerstin Thim (AstraZeneca, Lund, Suède), Benita Dahlberg et le Dr Anders Eklund (Karolinska Institutet, Stockholm, Suède) ainsi que le Dr Martin Stampfli (Université McMaster, Hamilton, ON, Canada) à l&#39;aide habile et des conseils d&#39;experts.

Les études chez l&#39;animal ont été approuvés par le comité d&#39;éthique de bien-être animal du Nord de Stockholm. Les procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec la législation suédoise. 1. Génération d&#39;un aérosol LPS <ol><li> Dissoudre 0,5 g purifiée P. aeruginosa LPS dans 50 ml de solution saline stérile avec agitation douce et vérifier dissolution. Diluer 1 ml de LPS en solution dans 9 ml de solution saline stérile, à une concentration finale de 1 mg / ml. Protéger de la lumière avec une feuille d&#39;aluminium et conserver à -20 ° C. </li><li> Décongeler LPS solubilisées dans l&#39;obscurité à la température ambiante et bien mélanger immédiatement avant utilisation. </li><li> Dans un ventilé niveau II Biohazard capot, insérer une entrée rouge dans un nébuliseur, et connectez le nébuliseur à l&#39;air ambiant sous pression via la tubulure fournie par le (régime d&#39;examen présentant les dispositifs expérimentaux dans la figure 1) du fabricant. ATTENTION: l&#39;équipement de protection individuelle approprié, y compris une demi-pièce faciale respirat réutilisableou de filtres à particules, lunettes, gants et vêtements de protection doit être utilisé au cours de l&#39;exposition. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/51470/51470fig1highres.jpg" /> Figure 1:. Présentation schématique des dispositifs expérimentaux utilisés pour générer un aérosol de l&#39;entrée du nébuliseur est relié à une alimentation en air. La sortie du nébuliseur est relié à un premier compteur de débit par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube de 15,9 mm et un filtre à air, et l&#39;alimentation en air est ajusté à 5,0 L / m à une pression de 2 kbar. La sortie est à côté connecté à une boîte en plexiglas équipée avec des couvercles amovibles et 5 trous de mm pour éviter l&#39;accumulation de pression. <ol start="4"><li> Raccorder la sortie du nébuliseur pour un débitmètre de masse par l&#39;intermédiaire d&#39;un filtre à air. Connectez le débitmètre massique à une alimentation électrique. </li><li> Réglez l&#39;alimentation en air à 5 L / min, avec une pression en restant à 1,0-2,0 bar. </li><li> Retirez le débitmètre massique etdébrancher l&#39;alimentation en air. </li><li> Raccorder la sortie du nébuliseur pour un tube de 15,9 mm, ce qui bifurque et se connecte à deux boîtes en plexiglas de dimensions: 150 x 163 x 205 mm, munis de couvercles amovibles. Chaque boîte doit avoir un trou de 5 mm dans le côté opposé de l&#39;entrée, pour éviter l&#39;accumulation de pression. </li><li> Placez jusqu&#39;à 5 souris dans chaque boîte de plexiglas et fermer les couvercles. </li><li> Ouvrir le nébuliseur et remplir l&#39;insert avec au moins 4 ml de LPS en solution dans du sérum physiologique stérile ou le véhicule seul (solution saline stérile, le volume ne doit pas dépasser 8 ml). Re-connecter l&#39;entrée de l&#39;alimentation en air. </li><li> Laisser l&#39;aérosol se écouler dans les boîtes en plexiglas fermées pendant 10 min. Surveiller en continu les animaux. Assurez-vous que l&#39;alimentation en air reste solidement attaché à l&#39;entrée du nébuliseur. </li><li> Débranchez l&#39;alimentation en air. Avec les couvercles fermés, laisser les animaux restent dans les boîtes en plexiglas pendant 2 min. </li><li> Ouvrez les couvercles et permettre l&#39;aérosol de se disperser, et de renvoyer les animaux à tes cages. Si les animaux semblent humide, placer les cages sur un coussin chauffant à basse température, pour éviter l&#39;hypothermie. </li><li> Surveiller les animaux en continu pendant les 30 premières minutes, et ensuite tous les 2 h pour le 6 premières heures. Les animaux doivent présenter motif respiratoire normale et l&#39;activité pendant et après la procédure de nébulisation. </li></ol> 2. lavage broncho-alvéolaire (LBA) <ol><li> Au point de fin expérimentale, profondément anesthésier les animaux avec de l&#39;isoflurane à effet tel que recommandé par le personnel vétérinaire de votre institution. Pincez la patte arrière pour vérifier un réflexe de retrait pour assurer une profondeur suffisante de l&#39;anesthésie pour mener une intervention chirurgicale majeure. Arroser la fourrure des animaux avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Ouvrez l&#39;abdomen avec des ciseaux, et de rompre l&#39;aorte pour être exsangue l&#39;animal. Placez un morceau de tissu sur l&#39;abdomen pour absorber le sang. </li><li> Follwing l&#39;euthanasie, utiliser une seule coupe des ciseaux antéro-postérieur àexposer le thorax. Soulevez la cage thoracique par l&#39;extrémité antérieure du sternum et utiliser les ciseaux pour percer la membrane au point ventrale plus, sans couper dans toute lobe pulmonaire. Ouvrez la cage thoracique en faisant deux entailles dans le sens antéro-postérieur (réunion en dessous de la mâchoire). </li><li> Tirez doucement en dehors de la cage thoracique en utilisant une pince, et couper la trachée sous le larynx. </li><li> Soulevez la trachée avec la pince et retirer les poumons en coupant les ligaments reliant les lobes de la cavité thoracique, et en tirant doucement par le tissu adipeux et cardiaque. </li><li> Insérez un tube de polyéthylène (diamètre intérieur: 0,58 mm; diamètre extérieur: 0,965 mm) dans la trachée et fixer le tube avec une chaîne de fil de soie. </li><li> Nouez le multilobe (les quatre lobes du poumon droit) avec du fil de soie. </li><li> Insérer une aiguille de calibre 23 dans le tube de polyéthylène et injecter lentement 250 ul de glacé PBS stérile dans le lobe unique avec une seringue de 1 ml. </li><li> Enfoncer délicatement les poumons30 heures et recueillir le liquide à travers la seringue. Répéter la procédure avec 200 ul de PBS (environ 300 ul de PBS doit être récupéré à partir du lobe unique à partir du volume injecté de total de 450 ul). </li><li> Gardez le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF) sur la glace, ou énumérer les cellules BAL immédiatement. Compter les cellules avec un heamocytometer, en utilisant une solution Turk pour colorer les cellules 11. Calculer le nombre total de cellules en multipliant le nombre de cellules avec le facteur de dilution de la solution de coloration et le volume dans le domaine de la heamocytometer compté. </li><li> Préparer numérations cellulaires différentielles à partir de cellules cytocentrifuged comme décrit par ailleurs 11. </li></ol> 3. La fixation au formol des tissus pulmonaires pour l&#39;évaluation histologique <ol><li> Retirez le multilobe et enclenchez-gel sur glace sèche. Stocker à -80 ° C. </li><li> Monter une seringue de 60 ml avec le piston retiré sur un stand de support métallique. Remplir la seringue avec 10% de formol àla hauteur de 20 cm au-dessus du banc de laboratoire, soit 20 cm de pression constante. </li><li> Connecter l&#39;aiguille de calibre 23 fixée à la trachée de la seringue de 60 ml par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube en plastique avec une vanne pour commander l&#39;écoulement de la formaline. </li><li> Insuffler le lobe du poumon avec de la formaline pendant 5 min. Déconnecter l&#39;aiguille et la retirer avec le tube de polyéthylène à partir de la trachée tout en tirant sur le fil de soie pour fermer la trachée et de conserver la pression dans le poumon. </li><li> Immerger le lobe du poumon dans le formol et fixer pendant 24 heures à 4 ° C. </li><li> Laver le tissu fixé à trois reprises pendant au moins 20 min avec 70% d&#39;éthanol, et déshydrater au xylène par le schéma suivant (1 h chacun): <ul><li> 3x éthanol à 70% </li><li> 3x éthanol à 95% </li><li> 3x éthanol à 100% </li><li> 3x xylène </li><li> 1x (liquide) de paraffine </li></ul></li><li> Incluez tissus déshydratés dans de la paraffine, coupés en sections 4-5 pm, et les taches avec de l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine pour permettre une évaluation histologique.</li>
</ol>

<ol>
	<li>King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Inflammation+Induced+by+Lipoteichoic+Acid+or+Lipopolysaccharide+in+Humans.">Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).</li><li>Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+humoral+responses+to+Escherichia+coli+and+sheep+red+blood+cell+antigens+introduced+via+the+respiratory+tract.">Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract.</a> Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).</li><li>Asti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.+I.+Concomitant+evaluation+of+inflammatory+cells+and+haemorrhagic+lung+damage.">Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinase-Activated+Receptor-1,+CCL2+and+CCL7+Regulate+Acute+Neutrophilic+Lung+Inflammation.">Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).</li><li>Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).</li><li>Bafadhel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Exacerbations+of+COPD:+Identification+of+Biological+Clusters+and+Their+Biomarkers.">Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).</li><li>Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+and+Upper+and+Lower+Airway+Inflammation+at+Exacerbation+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary.">Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 173, 71-78 (2006).</li><li>Rabe, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease:+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).</li></ol>

Abraham Roos a reçu des honoraires de conférencier de Boehringer Ingelheim, bourses de voyage d&#39;AstraZeneca R &amp; D et une subvention d&#39;AstraZeneca R &amp; D recherche. Magnus Nord est un employé à temps plein d&#39;AstraZeneca R &amp; D et a reçu des subventions de recherche d&#39;AstraZeneca R &amp; D. Johan Grunewald et Tove Berg sont co-chercheurs sur un projet de recherche indépendant financé par AstraZeneca R &amp; D.

LPS en aérosol génère une réponse inflammatoire dans les voies respiratoires, caractérisé par des neutrophiles dans la muqueuse epitheliale, les espaces entourant les voies respiratoires conductrices, ainsi que les espaces alvéolaires. Ce est, avec la teneur en protéines totales ont augmenté dans BALF, indicatif de fuite plasmatique, représentant de la pathologie de la lésion pulmonaire aiguë. Comme LPS induit une inflammation stérile, la réaction est indépendante de la réponse immunitaire adaptative, et...

Le lipopolysaccharide (LPS) est un composant de la paroi cellulaire de bactéries à Gram négatif 1. Défi au LPS est un modèle bien documenté de lésion pulmonaire aiguë, un syndrome caractérisé par une inflammation neutrophile aiguë et un oedème 2. En outre, neutrophilie pulmonaire est également une caractéristique de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) 3, et le défi LPS chez l&#39;homme a été utilisé pour modéliser exacerbations de la MPOC 4. Ainsi, les modèles expérimentaux d&#39;exposition LPS sont des outils pertinents et utiles pour comprendre la pathologie humaine cliniquement. L&#39;objectif de l&#39;administration pulmonaire de LPS aérosol décrits ici est de générer une réponse inflammatoire neutrophile dans la conduite et les voies respiratoires, sans atteinte systémique. Plusieurs techniques de LPS ont été décrits précédemment. L&#39;injection intra-veineuse de LPS est la voie d&#39;administration la plus couramment utilisée. Bien que cette technique est facilement accessible, til dommages primaires est à l&#39;endothélium, la destruction secondaire de l&#39;épithélium pulmonaire après la migration des neutrophiles dans les poumons. L&#39;administration intra-veineuse provoque également une inflammation systémique deux, ce qui peut compliquer le tableau clinique chez des modèles animaux. L&#39;inflammation systémique est en revanche pas observé avec l&#39;administration intra-trachéale. Cette technique, cependant, est beaucoup de travail et nécessite anesthésiques ainsi que la formation considérable 5, 6. En outre, le dépôt pulmonaire par cette voie d&#39;administration dépend de la respiration 7. Ainsi, le dépôt pulmonaire est affectée par la profondeur de l&#39;anesthésie nécessaires pour l&#39;administration intra trachéale et le dépôt dans les voies aériennes variables peuvent être observées. En revanche, l&#39;administration pulmonaire avec du LPS en aérosol nécessite une formation minimale, et peut facilement être réalisée sur un grand nombre d&#39;animaux avec peu ou pas de variation entre les individus 5, 8.Une étude récente confirme que l&#39;administration par aérosol est supérieure à la voie intra-trachéale à l&#39;égard de dépôt, et que des doses plus pertinentes de LPS induit une inflammation neutrophile 8 avec ce modèle. Des études antérieures ont démontré que défi pour aérosol Pseudomonas aeruginosa LPS génère une réponse inflammatoire marquée dans la lumière des voies respiratoires et du parenchyme pulmonaire, y compris les espaces alvéolaires 9, 10. L&#39;inflammation est caractérisée par une prédominance de neutrophiles et la présence d&#39;un œdème pulmonaire, et peut ainsi être utilisée pour traiter pathogenèse de la lésion pulmonaire aiguë et obtenir en outre la connaissance des mécanismes qui contribuent à la pathologie de la maladie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:931px;" width="929">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">Name of the material/equipment&#160;</td>
			<td style="width:244px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog number</td>
			<td style="width:235px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:307px;">Purified Pseudomonas aeruginosa LPS&#160;</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:235px;">Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pari LC sprint star nebulizer</td>
			<td style="width:244px;">PARI Respiratory Equipment Inc.&#160;</td>
			<td style="width:145px;">023G1250</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">TSI mass flowmeter 4040</td>
			<td style="width:244px;">TSI</td>
			<td style="width:145px;">4040</td>
			<td style="width:235px;">Alternative product from supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">Z685704</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Plexiglas boxes with removable lids</td>
			<td style="width:244px;">Custom built</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:235px;">150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">3M Half Facepiece Reusable Respirator</td>
			<td style="width:244px;">3M</td>
			<td style="width:145px;">7503</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">3M Advanced Particulate Filters (P100)&#160;</td>
			<td style="width:244px;">3M</td>
			<td style="width:145px;">2291</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sissors</td>
			<td style="width:244px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">233-1104</td>
			<td style="width:235px;">Preferred scissors may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:244px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">232-1313</td>
			<td style="width:235px;">Preferred forceps may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Intramedic PE50 polyethylene tube</td>
			<td style="width:244px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">427411</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread&#160;</td>
			<td style="width:244px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">95056-992</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">26 &#189;&#160; gage needle&#160;</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile</td>
			<td style="width:244px;">BD</td>
			<td style="width:145px;"><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=301025">301025</a></td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene&#160;</td>
			<td style="width:244px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">301035</td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fluka Hematoxylin-Eosin</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">3972</td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T&#252;rk&#39;s solution</td>
			<td style="width:244px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:145px;">109277</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Table top centrifuge</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:235px;">Alternative manufacturers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cytospin 4 cytocentrifuge</td>
			<td style="width:244px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A78300003</td>
			<td style="width:235px;">Alternative centrifuge can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HEMA-3 stat pack</td>
			<td style="width:244px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">23-123-869</td>
			<td style="width:235px;">Alternative staining kits exists.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">HT501128&#160;</td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
	</tbody>
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a method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide

Lésion pulmonaire aiguë (ALI) est une maladie grave caractérisée par neutrophilie alvéolaire, avec des options de traitement limitées et une mortalité élevée. Des modèles expérimentaux de ALI sont clé dans l&#39;amélioration de notre compréhension de la pathogenèse de la maladie. Le lipopolysaccharide (LPS) provenant de bactéries à gram positif induit une inflammation neutrophile dans les voies respiratoires et du parenchyme pulmonaire de la souris. Délivrance pulmonaire efficace des composés tels que le LPS est toutefois difficile à réaliser. Dans l&#39;approche décrite ici, l&#39;administration pulmonaire chez la souris est réalisé par défi pour aérosol Pseudomonas aeruginosa LPS. LPS a été dissous en aérosol par un nébuliseur relié à air comprimé. Les souris ont été exposées à un flux continu d&#39;aérosol de LPS dans une boîte en plexiglas pendant 10 minutes, puis 2 min après le conditionnement aérosol a été abandonnée. L&#39;intubation endotrachéale et lavage broncho-alvéolaire subséquente, suivi par une perfusion de formol a été prochain effectuées, ce qui permet la caractérisation de la p stérileulmonary inflammation. LPS en aérosol génère une inflammation pulmonaire alvéolaire caractérisé par neutrophilie, détecté dans le lavage broncho-alvéolaire et par évaluation histologique. Cette technique peut être mis en place à un faible coût avec quelques appareils, et exige une formation et une expertise minimale. Le système d&#39;exposition peut donc être effectuée systématiquement dans tout laboratoire, avec le potentiel d&#39;améliorer notre compréhension de la pathologie pulmonaire.

Défi d&#39;aérosol P. aeruginosa LPS donne généralement une réponse inflammatoire marqué dans la lumière des voies aériennes et de l&#39;espace alvéolaire, caractérisé par une prédominance de neutrophiles aux deux points de temps précoces et tardifs. Aérosol LPS induit neutrophilie pulmonaire Souris C57BL / 6BY et BALB / c ont été exposées à des aérosols P. aeruginosa LPS ou du véhicule et les neutrophiles ont été dénombrées...

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A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Nous décrivons une méthode pour induire une inflammation pulmonaire neutrophile par défi pour lipopolysaccharide aérosol par nébulisation, pour modéliser une lésion pulmonaire aiguë. En outre, des techniques chirurgicales de base pour l&#39;isolement du poumon, l&#39;intubation endotrachéale et lavage broncho-alvéolaire sont également décrits.

Une méthode pour générer pulmonaire Neutrophilie Utilisation Aerosolized lipopolysaccharide

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K vues.  Karolinska Institutet.  Nous décrivons une méthode pour induire une inflammation pulmonaire neutrophile par défi pour lipopolysaccharide aérosol par nébulisation, pour modéliser une lésion pulmonaire aiguë. En outre, des techniques chirurgicales de base pour l'isolement du poumon, l'intubation endotrachéale et lavage broncho-alvéolaire sont également décrits. 

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A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Une méthode pour l&#39;étiquetage dans les vaisseaux sanguins souris embryonnaires

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Recherche

Immunologie et infection

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world population1, and almost two million people are killed by TB each year.2 Universal access to high-quality, patient-centered treatment for all TB patients is emphasized by WHO's Stop TB Strategy.3 The rapid detection of MTB in respiratory specimens and drug therapy based on reliable drug resistance testing results are a prerequisite for the successful implementation of this strategy. However, in many areas of the world, TB diagnosis still relies on insensitive, poorly standardized sputum microscopy methods. Ineffective TB detection and the emergence and transmission of drug-resistant MTB strains increasingly jeopardize global TB control activities.2
Effective diagnosis of pulmonary TB requires the availability - on a global scale - of standardized, easy-to-use, and robust diagnostic tools that would allow the direct detection of both the MTB complex and resistance to key antibiotics, such as rifampicin (RIF). The latter result can serve as marker for multidrug-resistant MTB (MDR TB) and has been reported in &gt; 95% of the MDR-TB isolates.4, 5 The rapid availability of reliable test results is likely to directly translate into sound patient management decisions that, ultimately, will cure the individual patient and break the chain of TB transmission in the community.2
Cepheid's (Sunnyvale, CA, U.S.A.) Xpert MTB/RIF assay6, 7 meets the demands outlined above in a remarkable manner. It is a nucleic-acids amplification test for 1) the detection of MTB complex DNA in sputum or concentrated sputum sediments; and 2) the detection of RIF resistance-associated mutations of the rpoB gene.8 It is designed for use with Cepheid's GeneXpert Dx System that integrates and automates sample processing, nucleic acid amplification, and detection of the target sequences using real-time PCR and reverse transcriptase PCR. The system consists of an instrument, personal computer, barcode scanner, and preloaded software for running tests and viewing the results.9 It employs single-use disposable Xpert MTB/RIF cartridges that hold PCR reagents and host the PCR process. Because the cartridges are self-contained, cross-contamination between samples is eliminated.6 Current nucleic acid amplification methods used to detect MTB are complex, labor-intensive, and technically demanding. The Xpert MTB/RIF assay has the potential to bring standardized, sensitive and very specific diagnostic testing for both TB and drug resistance to universal-access point-of-care settings3, provided that they will be able to afford it. In order to facilitate access, the Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND) has negotiated significant price reductions. Current FIND-negotiated prices, along with the list of countries eligible for the discounts, are available on the web.10

The Xpert MTB/RIF test integrates sample decontamination, hands-free operation, on-board sample processing, and ultra-sensitive hemi-nested PCR for the simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampicin resistance, either in expectorated sputum or concentrated sputum sediments, in approximately two hours. Testing is standardized and requires only moderate laboratory infrastructure and training.

Diagnostic de la tuberculose pulmonaire avec le Xpert MTB / RIF test

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Two-photon Imaging intravitale des leucocytes au cours de la réponse immunitaire dans le foie de souris traitées Lipopolysaccharide

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Génération des vecteurs recombinants Avian Herpesvirus avec CRISPR/Cas9 gène édition

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-Immunoprécipitation dosage pour l’étude des Interactions fonctionnelles entre les récepteurs et les Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university centers worldwide. While ECP&#8217;s clinical efficacy and exemplary safety profile have driven its widespread use, elucidation of the underlying mechanisms has remained a challenge, partly owing to lack of a laboratory ECP model. To overcome this obstacle and create a simple, user-friendly platform for ECP research, we developed a scaled-down version of the clinical ECP leukocyte-processing device, suitable for work with both mouse models, and small human blood samples. This device is termed the Transimmunization (TI) chamber, or plate. In a series of landmark experiments, the miniaturized device was used to produce a cellular vaccine that regularly initiated therapeutic anti-cancer immunity in several syngeneic mouse tumor models. By removing individual factors from the experimental system and ascertaining their contribution to the in vivo anti-tumor response, we then elucidated key mechanistic drivers of ECP immunizing potential. Collectively, our results revealed that anti-tumor effects of ECP are initiated by dendritic cells (DC), physiologically generated through blood monocyte interaction with platelets in the TI plate, and loaded with antigens from tumor cells whose apoptotic cell death is finely titrated by exposure to the photoactivatable DNA cross-linking agent 8-methoxypsoralen and UVA light (8-MOPA). When returned to the mouse, this cellular vaccine leads to specific and transferable anti-tumor T cell immunity. We verified that the TI chamber is also suitable for human blood processing, producing human DCs fully comparable in activation state and profile to those derived from the clinical ECP chamber. The protocols presented here are intended for ECP studies in mouse and man, controlled generation of apoptotic tumor cells with 8-MOPA, and rapid production of physiologic human and mouse monocyte-derived DCs for a variety of applications.

The transimmunization (TI) device or plate and related protocols have been developed to replicate the key features of extracorporeal photochemotherapy (ECP), in an experimental setting, allowing for production of physiologically activated, tunable dendritic cells (DCs) for cancer immunotherapy.

Nouveau protocole pour la génération de cellules dendritiques immunogéniques physiologiques

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

Visualisation de la résistance bactérienne à l’aide de sondes antibiotiques fluorescentes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Cigarette Smoke Exposure in Mice using a Whole-Body Inhalation System

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular diseases have been widely studied, however, the impact of CS in other tissues and organs such as blood and bone marrow remain incompletely defined. Finding the appropriate system to study the effects of CS in rodents can be prohibitively expensive and require the purchase of commercially available systems. Thus, we set out to build an affordable, reliable, and versatile system to study the pathologic effects of CS in mice. This whole-body inhalation exposure system (WBIS) set-up mimics the breathing and puffing of cigarettes by alternating exposure to CS and clean air. Here we show that this do-it-yourself (DIY) system induces airway inflammation and lung emphysema in mice after 4-months of cigarette smoke exposure. The effects of whole-body inhalation (WBI) of CS on hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in the bone marrow using this apparatus are also shown.

This protocol demonstrates the study of the pathophysiologic effects of cigarette smoke (CS) with a whole-body inhalation (WBI) exposure system (WBIS) built in-house. This system can expose animals to CS under controlled repeatable conditions for research of CS-mediated effects on lung emphysema and hematopoiesis.

Exposition à la fumée de cigarette chez les souris utilisant un système d’inhalation du corps entier

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular ...

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti. S.&#160;stercoralis is a human-parasitic, skin-penetrating nematode that infects approximately 610 million people, while the rat parasite S.&#160;ratti is closely related to S.&#160;stercoralis and is often used as a laboratory model for S.&#160;stercoralis. Both S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti are easily amenable to the generation of transgenics and knockouts through the exogenous nucleic acid delivery technique of intragonadal microinjection, and as such, have emerged as model systems for other parasitic helminths that are not yet amenable to this technique.
Parasitic Strongyloides adults inhabit the small intestine of their host and release progeny into the environment via the feces. Once in the environment, the larvae develop into free-living adults, which live in feces and produce progeny that must find and invade a new host. This environmental generation is unique to the Strongyloides species and similar enough in morphology to the model free-living nematode Caenorhabditis elegans that techniques developed for C. elegans can be adapted for use with these parasitic nematodes, including intragonadal microinjection. Using intragonadal microinjection, a wide variety of transgenes can be introduced into Strongyloides. CRISPR/Cas9 components can also be microinjected to create mutant Strongyloides larvae. Here, the technique of intragonadal microinjection into Strongyloides, including the preparation of free-living adults, the injection procedure, and the selection of transgenic progeny, is described. Images of transgenic Strongyloides larvae created using CRISPR/Cas9 mutagenesis are included. The aim of this paper is to enable other researchers to use microinjection to create transgenic and mutant Strongyloides.

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The functional genomic toolkit for the parasitic nematodes Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti includes transgenesis, CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis, and RNAi. This protocol will demonstrate how to use intragonadal microinjection to introduce transgenes and CRISPR components into S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti.

Génération de transgéniques et de Knockouts chez les espèces de strongyloïdes par microinjection

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and ...

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung injury (ALI)/acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other respiratory pathologies in vivo is difficult due to the limited accessibility and inherent motion artifacts of the lungs. Nonetheless, various approaches have been developed to overcome these challenges. This protocol describes a method for intravital fluorescence microscopy to study real-time leukocyte-endothelial interactions in the pulmonary microcirculation in an experimental model of ALI. An in vivo lung imaging system and 3-D printed intravital microscopy platform are used to secure the anesthetized mouse and stabilize the lung while minimizing confounding lung injury. Following preparation, widefield fluorescence microscopy is used to study leukocyte adhesion, leukocyte rolling, and capillary function. While the protocol presented here focuses on imaging in an acute model of inflammatory lung disease, it may also be adapted to study other pathological and physiological processes in the lung.

Intravital fluorescence microscopy can be utilized to study leukocyte-endothelial interactions and capillary perfusion in real-time. This protocol describes methods to image and quantify these parameters in the pulmonary microcirculation using a vacuum-stabilized lung imaging system.

Microscopie à fluorescence intravitale à grand champ de la microcirculation pulmonaire dans une lésion pulmonaire aiguë expérimentale à l’aide d’un système d’imagerie stabilisé sous vide

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...