Les auteurs tiennent à remercier les enfants et les donneurs de plasma des adultes, et le personnel de la Papouasie-Nouvelle-Guinée Institut de recherche médicale. Les auteurs tiennent à remercier Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny W Wilson, Ivo Mueller et Diana S Hansen pour leur contribution au développement de cette technique, et je remercie la Croix-Rouge australienne pour le sang et de sérum packs. Ce travail a été rendu possible grâce au soutien victorienne gouvernement de l&#39;État d&#39;exploitation de l&#39;infrastructure et du gouvernement australien NHMRC IRIISS. Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches médicales de la santé nationale et accorde # 1031212 et # 637406, et les Instituts nationaux de la Santé subvention # AI089686.

Remarque: Toutes les étapes, en plus de la centrifugation et la cytométrie en flux, doivent être effectuées à l&#39;intérieur d&#39;une hotte à flux laminaire afin de maintenir la stérilité. Prendre les précautions appropriées sont prises concernant la manipulation des échantillons humains. Le test est très sensible pour de petites quantités de plasma. Les dilutions prévues sont optimales pour résoudre des réponses allant de 5 à 78% avec le plasma des enfants semi-immuns de la Papouasie-Nouvelle-Guinée (PNG). La dilution optimale peut varier selon les écrans plasma testés, et par conséquent, il est recommandé que le plasma est titré pour déterminer les conditions expérimentales pour chaque application. Assurer l&#39;inclusion de deux contrôles négatifs cellules THP-1 avec mérozoïtes en l&#39;absence de plasma; et cellules THP-1 avec mérozoïtes opsonisés avec un pool de plasma de paludisme naïfs. Ceci permettra de contrôler le respect des mérozoïtes de cellules THP-1 et pour permettre rigoureux cytométrie de flux de déclenchement d&#39;événements de phagocytose. L&#39;utilisation d&#39;échantillons de plasma était PNGapprouvé par le Comité consultatif de la recherche médicale, de la Papouasie-Nouvelle-Guinée ministère de la Santé, Walter et Eliza Comité hall Institut humain éthique de la recherche (numéro de projet 04/04). Consentement écrit a été obtenu des parents / tuteurs de tous les participants. 1. THP-1 Culture <ol><li> Maintenir la lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 en milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% sérum de veau foetal (FCS) et 55 uM de 2-mercapthoethanol (THP-1 moyenne) et à 37 ° C dans un incubateur à CO2 humidifié à 5%. </li><li> Maintenir les cellules à une densité inférieure à 5 x 10 5 cellules / ml. NOTE: Prolifération se traduira par une différenciation en cellules adhérentes et la régulation négative de récepteurs Fc. Une fois les cellules ont été repiquées environ 10 fois, décongeler un nouveau flacon pour maintenir le phénotype cellulaire. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;échantillon d&#39;anticorps et de dilution <ol><li> Chaleur inactiver le plasma à tester et le paludisme naïfs contrôle plasma par incubation à 56 °; C pendant 30 minutes </li><li> Diluer en série des échantillons de plasma à 1/2, 000 THP-1 moyen. </li><li> Plasma magasin dilué à -20 ° C. </li></ol> 3. Culture de très synchronisée P. falciparum NOTE: La ligne de parasite exprimant la GFP D10-PfPHG 27 avait été utilisée en raison de son cycle de vie 48 heures qui assiste la synchronisation des parasites et le moment de l&#39;addition contrôlée E64. En outre, parce que cette ligne exprimant la GFP dans le cytosol, cette ligne permet la détection de la parasitémie et mérozoïtes libres par la détection par cytométrie en flux de la GFP. Cependant, l&#39;intensité de fluorescence de la GFP n&#39;est pas suffisante pour assurer une visualisation à l&#39;intérieur de cellules THP-1 et, par conséquent, les mérozoïtes sont contre-colorées avec le bromure d&#39;éthidium (BET). D&#39;autres souches du parasite peuvent être utilisées, à condition que la synchronie étanche est réalisable. Synchroniser les parasites en utilisant une combinaison de sorbitol traitement pour lyser les formes matures 28 et de l&#39;héparine pour inhiber l&#39;invasion 15 </svous&gt;. <ol><li> Maintenir P. falciparum parasites en O + erythrocytes humains (RBC) à 3% d&#39;hématocrite dans un milieu RPMI-1640 (pH 7,4) supplémentée avec 25 mg / ml d&#39;HEPES, 50 ng / hypoxanthine ml, 10% de sérum humain regroupé, 2 mg / ml de bicarbonate de sodium, et 20 ug / ml de gentamycine (milieu de parasite). Ajouter 5 mg / ml de blasticidine S-chlorhydrate dans le milieu de culture pour sélectionner des parasites GFP +. </li><li> Incuber les cultures à l&#39;air boîtes étanches ou des flacons de culture alternative à double scellées à 37 ° C dans une atmosphère de 1% O 2, 4% de CO 2 et 95% de N 2. </li><li> Préparer des lames de frottis minces, fixer à 100% de méthanol pendant 10 secondes, et la tache avec une solution de 10% de Giemsa à 6,7 mM (pH 7,1) de tampon phosphate (solution Giemsa) pendant 10 min pour contrôler la parasitémie. Après coloration, rincer la lame dans l&#39;eau et sécher à l&#39;air. Évaluer la parasitémie en utilisant une lentille 100X à immersion d&#39;huile. </li><li> Maintenir les cultures des parasites à une parasitémie inférieure à 5% RBC infecté en divisant les cultures et en ajoutant non infectéRBC selon les besoins. </li><li> Pour synchroniser avec l&#39;héparine, ajouter 20 UI / ml d&#39;héparine de qualité médicale à sonner stade cultures. </li><li> Lorsque la majorité des parasites sont au stade schizonte, un culot de cellules à 300 g pendant 5 min, éliminer le milieu contenant de l&#39;héparine et remettre en suspension dans un milieu de parasite pour permettre schizonte rupture et l&#39;invasion des mérozoïtes. </li><li> Après 4 heures, ajouter 20 UI / ml d&#39;héparine retour aux cultures, bloquant toute nouvelle invasion des mérozoïtes. NOTE: Plusieurs cycles de sorbitol et le traitement à l&#39;héparine peuvent être nécessaires avant que les parasites sont suffisamment synchronisées. Pour générer un nombre adéquat de mérozoïtes, préparer 150 ml de culture de parasite de 3 - 5% parasitémie. </li></ol> 4. Isolation de Late Phase P. falciparum Trophozoïtes <ol><li> Trente-six heures après le retour de l&#39;héparine de cultures, un culot de cellules cultivées à 300 g pendant 5 min, et remettre le culot en milieu de parasite à 25% d&#39;hématocrite. </li><li> Attacher une grande colonne magnétique (volume de la matrice de 6,3ml) à un aimant, et équilibrer la colonne avec du milieu de parasite, en s&#39;assurant que toutes les bulles d&#39;air sont éliminées. </li><li> Ajouter le P. remis en suspension culture falciparum à la colonne, et régler le débit à une goutte par seconde. </li><li> Une fois la culture a traversé la colonne, laver la colonne avec le milieu de parasite jusqu&#39;à ce que le flux continu soit claire. </li><li> Éluer les parasites provenant de la colonne dans 30 ml de milieu de 37 ° C parasite. </li><li> Préparer un frottis mince de parasites, fixer à 100% de méthanol pendant 10 secondes, et tacher avec une solution Giemsa pendant 3 min. Examiner la lame sous le microscope, et veiller à ce que les parasites remplissent presque le globule rouge, et semblent être à des stades schizontes début. Si les parasites n&#39;ont pas atteint le stade de maturation approprié, retourner parasites purifiés à un incubateur à 37 ° C dans une atmosphère de 1% O 2, 4% de CO 2 et 95% de N 2 jusqu&#39;au développé convenablement. REMARQUE: La pureté de plus de 90% des globules rouges infectés doit veiller à RBC Ne pas contaminer les préparations mérozoïtes. </li><li> Traiter schizontes isolés avec 10 uM E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E64) pour 6 - 10 h REMARQUE:. Plus longs temps d&#39;incubation avec E64 sont possibles, mais les mérozoïtes produits ne seront plus invasive. </li></ol> 5. Isolement de P. falciparum mérozoïtes <ol><li> Après incubation avec E64, salir parasites, fixer les cellules dans 100% de méthanol, et la tache avec une solution de Giemsa à évaluer la formation de mérozoïtes membraneux. NOTE: Un bon rendement de mérozoïtes sera obtenu si plus de 50% des parasites ont formé membrane mérozoïtes clos. </li><li> Schizontes Pellet E64-traitée à 1900 g pendant 8 min. Laver avec 50 ml de RT du milieu RPMI-1640 (pH 7,4) supplémentée avec 25 mg / ml d&#39;HEPES, 50 ng / hypoxanthine ml, 2 mg / ml de bicarbonate de sodium, et 20 ug / ml de gentamycine (milieu de lavage) pour éliminer le restant du sérum humain . </li><li> Remettre en suspension le culot dans 2 ml de milieu de lavage. REMARQUE: L&#39;utilisation de FCS contenant THP-1 médias produira mousser lors de la filtration. </li><li> Filtrer les 2 ml de remise en suspension E64-schizontes à travers un filtre à seringue de 1,2 μm/32 mm. Recueillir le filtrat dans un tube de 10 ml. NOTE: Le filtrat contient mérozoïtes et des cristaux de hémozoïne, avec schizontes et les débris de l&#39;ONU-rupture recueillies dans le filtre. </li><li> Fixez une petite colonne magnétique d&#39;un aimant, et s&#39;équilibrer avec 500 pi THP-1 moyen. </li><li> Passer le filtrat sur la colonne magnétique. Recueillir l&#39;écoulement. NOTE: hémozoïne va se lier à la colonne, tandis que les mérozoïtes vont passer à travers. </li><li> Passez le flux continu sur la colonne deux fois de plus pour éliminer hemozoin, la collecte de l&#39;écoulement à travers chaque fois. </li><li> Rincer la colonne avec 2 ml de THP-1 RT moyen pour collecter des mérozoïtes restants. </li><li> Ajouter BET à 10 pg / ml (concentration finale) et la tache pendant 30 min à température ambiante. Protéger de la lumière pour éviter photoblanchiment. Remarque: Veiller à ce que tout le liquide et p BET contaminésdéchets Lastic est évacué d&#39;une manière appropriée pour les produits chimiques cytotoxiques. Mérozoïtes ne sont plus invasive la suite de cette incubation. </li><li> Isoler mérozoïtes à 4000 g pendant 10 min. </li><li> Rejeter le surnageant dans un contenant à déchets approprié. </li><li> Reprendre mérozoïtes culot dans 4 ml THP-1 moyen, et centrifuger à 4000 g pendant 10 min. </li><li> Ajouter THP-1 moyen jusqu&#39;à un volume de 15 ml, et protéger de la lumière. </li></ol> 6. Quantification Merozoite Concentration par cytométrie en flux <ol><li> Apportez compter perles à RT. </li><li> Préparer PBS avec 0,5% de BSA pour diluer les mérozoïtes. </li><li> Comptez mérozoïtes à 3 dilutions; 1 à 100; 1 à 50 et 1 à 25. Préparer tubes 3 FACS avec 940, 930 et 910 pi de PBS 0,5% de BSA, respectivement. Ajouter 10, 20 et 40 pi de mérozoïtes purifiés par tube, respectivement. </li><li> Vortex perles de comptage pour 30 secondes, et ajouter 50 ul de billes par tube FACS contenant les mérozoïtes dilué. </li><li> Exécutez les trois dilbué échantillons de mérozoïtes sur un cytomètre de flux équipé d&#39;un laser de 488 nm. Définir une grille rigoureuse pour mérozoïtes basées sur BET et fluorescence de la GFP double fluorescence, et des perles porte de comptage par fluorescence dans un canal séparé. Acquérir des événements jusqu&#39;à 2000 billes sont collectées. Remarque: Ces instructions se réfèrent à compter GFP + mérozoïtes qui ont été contre-colorées avec du BET. Si ce n&#39;est pas l&#39;utilisation de la GFP exprimant parasites alors fixés portes mérozoïtes basé sur la dispersion latérale et BET fluorescence. </li><li> Déterminer le rapport des mérozoïtes: perles en divisant le nombre d&#39;événements de mérozoïtes par les 2.000 comptage des événements de perles, de calculer un ratio pour chaque dilution. Utilisez les spécifications de lots comptage de perles pour déterminer le nombre de perles dans les 50 pi de billes ajoutées par tube. </li><li> Multiplier le nombre de perles dans 50 ul par le facteur de dilution et par le mérozoïte: rapport billes pour que le facteur de dilution. Ce nombre correspond à la concentration de mérozoïtes par ml. Effectuer eese étapes pour chaque dilution. </li><li> La moyenne des concentrations de mérozoïtes mesurées dans les trois dilutions. NOTE: Les écarts-types au-delà de 10% pour les concentrations déterminées pour 1 100, 1 sur 50, et 1 à 25 dilutions indiquent des inexactitudes techniques dans la préparation des échantillons de comptage. </li><li> Remettre en suspension les mérozoïtes à 8 x 10 6 / ml dans mérozoïtes THP-1 moyen pour assurer un rapport final de quatre mérozoïtes THP-1 par cellule. NOTE: Autre mérozoïtes de THP-1 ratios peuvent être utilisés, et les concentrations doivent être modifiés en conséquence. </li></ol> 7. Phagocytose Assay <ol><li> Ajouter 200 pi de chaleur FCS inactifs par puits de plaques 96 puits à fond en U, et laisser à température ambiante O / N pour bloquer plaques. Après incubation, enlever FCS et laver les puits deux fois avec 200 ul de PBS stérile. Retirer du PBS et les plaques de stocker à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Calculer le nombre de cellules THP-1 nécessaires pour tester les échantillons de plasma et des contrôles, permettant de trois puits par échantillon à 1 x 10 <sup&gt; 5 cellules THP-1 par puits. </li><li> Déterminer THP-1 la concentration de la culture en chargeant 10 ul de culture sur une lame d&#39;hémocytomètre. Compter le nombre de cellules présentes dans 4 séries de 16 cases de coins de la hémocytomètre sous un microscope, puis la moyenne des chiffres. Multiplier le nombre moyen de 10 000 pour calculer le nombre de cellules par ml. </li><li> Isoler le nombre requis de cellules THP-1 à 500 xg pendant 5 min, et remettre en suspension à 6,7 x 10 5 cellules / ml dans du milieu THP-1. </li><li> Ajouter 150 ul de cellules THP-1 en THP-1 moyen par puits à une plaque de 96 puits à fond en U FCS bloqué, résultant en 10 5 cellules / puits. Préparer 3 puits par échantillon qui seront testés. Retour plaque dans l&#39;incubateur jusqu&#39;à ce que prêt à ajouter mérozoïtes. </li><li> Ajouter 150 pi de préparation des mérozoïtes à 8 x 10 6 / ml par puits à un FCS bloqué plaque de 96 puits à fond en U séparée. Préparer un puits par échantillon testé </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;échantillons de plasma dilué préparés par puits, à til plaque qui contient les mérozoïtes, et bien mélanger pour assurer une solution homogène. </li><li> Retirer la plaque THP-1 de l&#39;incubateur, et ajouter 50 ul de la solution mérozoïtes / plasma par puits contenant cellules THP-1, avec trois puits par échantillon de plasma. </li><li> Bien mélanger et incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2, incubateur humidifié pendant 40 min. Couvrir de papier d&#39;aluminium pour protéger de la lumière. </li><li> Après 40 min, les échantillons de centrifugation pendant 5 min à 500 x g à 4 ° C une centrifugeuse préalablement refroidie à arrêter la phagocytose. </li><li> Retirer le surnageant et laver les cellules deux fois dans du PBS glacé 0,5% de BSA 2 mM d&#39;EDTA (tampon FACS). NOTE: EDTA va faciliter le maintien d&#39;une suspension de cellules isolées pour analyse par cytométrie en flux. </li><li> Fixer les cellules dans 90 ul de 2% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 0,5% BSA 2 mM d&#39;EDTA (FACS de fixateur). Laisser sur la glace jusqu&#39;à ce que l&#39;acquisition, à l&#39;abri de la lumière. </li></ol> 8. Cytométrie en flux <ol><li> Acquérir des échantillons en utilisant un cytomètre de flux wi équipéeth un laser 488 nm et un débit élevé fixation du lecteur de plaque. NOTE: Ceci permettra jusqu&#39;à 400 échantillons de plasma à tester d&#39;une préparation de mérozoïtes. Les cellules peuvent également être transférés dans des tubes pour le manuel chargement de l&#39;échantillon. </li><li> Porte viables cellules THP-1 par l&#39;avant et la diffusion latérale. </li><li> Réglez le porte positif BET basée sur les «cellules THP-1 avec mérozoïtes et aucun plasma &#39;contrôle. </li><li> Acquérir un minimum de 10 000 événements par échantillon. </li></ol> 9. Analyse des données <ol><li> Analyser les données en utilisant la cytométrie de flux logiciel d&#39;analyse, et mis portes strictes pour les événements positifs EtBr. </li><li> Calculer la phagocytose de pourcentage pour chaque échantillon: le% de EtBr + cellules de l&#39;échantillon moins de cellules positives% avec du plasma non-immunitaire. </li><li> Les résultats moyens à travers triple. NOTE: Les écarts-types pour un triple dans plus de 10% indiquent inexactitudes expérimentales. Certains fond événements BET positifs peuvent être observés à la suite de merozoite adhérence à la surface des cellules THP-1, mais il doit être uniforme dans tous les échantillons contenant des mérozoïtes. Réglage de la grille sur la base des «cellules THP-1 avec mérozoïtes et pas de plasma« contrôle, puis en soustrayant n&#39;importe quel fond des «cellules THP-1 avec des non-immunitaire plasma« contrôle se traduira par la phagocytose% qui reflète la fluorescence due à intériorisé / phagocytés seulement mérozoïtes. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+effect+of+monocytes+with+Papua+New+Guinea+sera+on+Plasmodium+falciparum+in+culture.">Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture.</a> International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).</li><li>Schofield, L., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+immunity+to+malaria.">Clinical immunity to malaria.</a> Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).</li><li>Hill, D. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+proteolytic+activity+of+a+membrane+protein+in+Plasmodium+falciparum+by+phosphatidyl+inositol-specific+phospholipase.">Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase.</a> C. Nature. 332, 457-459 (1988).</li><li>Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemozoin+induces+macrophage+chemokine+expression+through+oxidative+stress-dependent+and+-independent+mechanisms.">Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms.</a> J Immunol. 174, 475-484 (2005).</li><li>Schofield, L., Tachado, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+host+cell+function+by+glycosylphosphatidylinositols+of+the+parasitic+protozoa.">Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa.</a> Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).</li><li>Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Plasmodium+falciparum+merozoite+phagocytosis+by+monocytes+from+immune+individuals.">Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals.</a> Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).</li><li>Lunov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+uptake+of+functionalized+polystyrene+nanoparticles+by+human+macrophages+and+a+monocytic+cell+line.">Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line.</a> ACS. 5, 1657-1669 (2011).</li><li>Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro.">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li><li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonopsonic+monocyte/macrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes:+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance.">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Pour mesurer mérozoïtes phagocytose, la maîtrise de deux techniques est nécessaire: la purification de mérozoïtes et THP-1 essai de phagocytose. Les étapes les plus importantes pour la combinaison de ces deux techniques sont les suivantes: 1) les parasites hautement synchronisés; 2) Ajout E64 au bon moment pour donner membrane mérozoïtes clos; 3) Retrait hemozoin pour éviter agrégats; 4) mérozoïtes précis comptage par cytométrie de flux; 5) la dilution de plasma utilisé; et 6) le maintien de faible densité cellulaire et le nombre de passage de cellules THP-1. Un examen attentif de ces aspects clés sera d&#39;assurer des réponses de phagocytose robustes sont observées. Bien que décrite ici est la préparation de mérozoïtes pour l&#39;évaluation de la phagocytose, la technique peut être utilisée pour une large gamme d&#39;applications. Quelle que soit la méthode d&#39;aval, les préparations de mérozoïtes optimales dépendent de synchronisation correctement outre E64 afin de générer des mérozoïtes. Le procédé décrit ci-E64 a été montré pour yIELD mérozoïtes envahissantes pour une utilisation en microscopie à haute résolution des événements d&#39;invasion et des essais de sensibilité aux médicaments 15-20. Bien que mérozoïte viabilité n&#39;est pas essentiel pour la phagocytose, l&#39;intégrité de la couche de surface du mérozoïte est nécessaire. Par conséquent, la méthode décrite ici E64 permet mérozoïtes de haute qualité à produire pour évaluer les réponses des anticorps à la couche de surface. Comme indiqué dans la figure 1, si E64 est ajouté trop tôt ou trop tard membrane mérozoïtes clos ne sont pas formés. Pour cette raison, les cultures de parasites très synchrones sont nécessaires. Ici, l&#39;utilisation de traitements de sorbitol et l&#39;héparine pour synchroniser hermétiquement D10-GFP cultures parasitaires d&#39;une fenêtre de 2 heures est décrite. L&#39;héparine peut favoriser gamétocytogénèse dans d&#39;autres laboratoire isole, et devrait donc être utilisé avec précaution. Méthodes de synchronisation de substitution tels que l&#39;alanine peuvent également être utilisés, à condition que les parasites étroitement synchronisés sont produites 29. Si E64 est ajouté aux parasites asynchrones, un accessoire inférieureortion des mérozoïtes membraneux sera produit et restant parasités RBC soit rompre normalement ou développer une morphologie anormale. La présence de parasites qui n&#39;ont pas développé dans la membrane fermée mérozoïtes va entraîner le colmatage du filtre et de réduire de façon significative le rendement du mérozoïte obtenu. Pendant la filtration des mérozoïtes membraneux, hemozoin est libéré des vacuoles digestives et est présent sous forme de cristaux libres en solution. Hemozoin est très pro-inflammatoire et a été rapporté pour moduler des monocytes et des macrophages phagocytose des réponses 30, 31. En plus de la modulation de la phagocytose, comme le montre la figure 2, hemozoin peut former des agrégats avec des mérozoïtes dans la solution. Comme cellules THP-1 peuvent phagocyter ces agrégats, cela peut être un facteur de confusion important pour la résolution des anticorps médiée par phagocytose. Par conséquent, la suppression de hemozoin est nécessaire dans ce test AVoid complexité supplémentaire de hemozoin sur phagocyte biologie. En outre, le défaut de retirer hemozoin peut également être néfaste pour l&#39;utilisation de cette technique pour générer des mérozoïtes libres pour d&#39;autres applications, en particulier là où les mérozoïtes quantification est nécessaire. Comme présenté sur la figure 4, le nombre de mérozoïtes ajouté à l&#39;essai peuvent influencer le degré de la phagocytose par les cellules THP-1. Bien que la cytométrie en flux permet de recensement de la concentration des mérozoïtes, pipetage soigneux et reproduire les chiffres de mérozoïtes sont nécessaires pour améliorer la précision. Cela est particulièrement important si plusieurs lignes de parasites doivent être testés côte à côte. Il a précédemment été démontré que le plasma à partir d&#39;enfants semi-immuns de PNG peut être dilué de façon significative avant que diminuent les réponses 23. Décrit ici est la dilution optimale de plasma (1/120, 000 dilution finale de plasma) pour une cohorte de 5 - enfants de 12 ans PNG qui a produit la large gamme de phagocyt. réponses de TSO décrites dans la Figure 5 Cette gamme autorisés pour la stratification des réponses en quatre groupes (0-19%, 20-39%, 40-59% et 60-79% phagocytose), et la modélisation de régression ont révélé que les réponses opsonisants ont été associés à protection contre la maladie clinique et de haute densité parasitémie 10 Pour cohorte différentes études, il peut être nécessaire d&#39;ajuster la dilution de plasma afin d&#39;assurer le phagocytose par les cellules THP-1 non saturé ou en dessous du niveau de détection. Débit permet cytométrie phagocytose rapide et quantifiable avec une précision améliorée sur la microscopie. Ce protocole est un débit élevé, plaque base et l&#39;acquisition de plaques à 96 puits pour étudier l&#39;immunité humorale acquise naturellement automatisé. La méthode nécessite des mérozoïtes coloration avec du bromure d&#39;éthidium, les taches d&#39;ADN cependant alternatifs tels que SybrGreen, DAPI et l&#39;iodure de propidium, des taches ou des taches de la membrane de la protéine pourraient être utilisés. Ce test serait prête à PRIMARmonocytes ou neutrophiles y, et pourraient être adaptés si phagocyte ou FcR biologie était d&#39;intérêt. Les cellules primaires ou cellules THP-1 différenciées in vitro avec de la PMA peuvent être utilisés pour étudier la phagocytose dans le paludisme et d&#39;autres agents pathogènes 12, 32-34. Cependant, l&#39;utilisation de cellules primaires peut être difficile car ces cellules sont adhérentes et affichent également non-anticorps médiée par phagocytose 35. En outre, la variabilité de la pureté, la viabilité et la fonctionnalité sont certaines limitations principales à l&#39;utilisation des cellules phagocytaires primaires. Les récepteurs Fc impliqués dans la phagocytose mérozoïte restent non caractérisé, et donc en utilisant des anticorps bloquants de récepteurs Fc spécifiques pourrait élucider la contribution de chacun des récepteurs Fc à la phagocytose mérozoïte. Comme THP-1 phagocytose est FcR charge, ce qui permet une interprétation simple de la phagocytose observée. Ce dosage se prête également à traiter la spécificité antigénique des anticorps opsonisants qui pourraient être obtenus par utilizing parasites knock-out pour les antigènes de surface mérozoïtes, ou en utilisant des anticorps humains purifiés par affinité sur les protéines de surface des mérozoïtes. En outre, dans des études approfondies de la réponse des cytokines suivantes mérozoïtes phagocytose font défaut, et pourraient être obtenus par ce test. Ces deux techniques constituent des progrès considérables à l&#39;étude des anticorps antimerozoite fonctionnels. La purification des mérozoïtes de haute qualité est avantageux d&#39;utiliser les mérozoïtes cryoconservés, ou des microsphères fluorescentes recouvertes d&#39;antigènes de mérozoïtes. Bien que ce test a été utilisé comme un outil d&#39;évaluation de l&#39;immunité naturellement acquise, il peut s&#39;avérer un outil important pour faire face à l&#39;acquisition de l&#39;immunité en réponse à la vaccination. Alors qu&#39;il a été montré récemment que la phagocytose ou mérozoïtes opsonisées est associée à une protection contre un paludisme clinique, il n&#39;est pas possible de tirer des conclusions directes in vitro à partir de cellules THP-1 de la phagocytose in vivo phagocytosesis mérozoïtes de la phagocytose dans ce dosage se produit dans des conditions statiques et en l&#39;absence de globules rouges en compétition. Les adaptations possibles de ce test peuvent ainsi fournir un outil polyvalent pour une meilleure compréhension du paludisme et mérozoïtes phagocytose.

L&#39;importance de l&#39;anticorps de l&#39;immunité au paludisme à Plasmodium falciparum a été montré il ya 40 ans, quand immunoglobulines des adultes hyperimmuns été transférés passivement aux enfants souffrant de paludisme grave entraînant une maladie allégé 1. Par conséquent, des efforts considérables ont cherché à identifier les cibles de l&#39;immunité antipaludique de protection, la plupart du temps par la mesure des titres d&#39;anticorps à des peptides ou des protéines exprimées par des bactéries par ELISA. Sérologie ELISA à base s&#39;est également révélée très variable entre les études, et ne traite pas la fonctionnalité d&#39;anticorps 2. De nombreux antigènes du paludisme induisent une IgG1 et IgG3 cytophile profil d&#39;anticorps, en particulier les mérozoïtes antigènes de surface 3. Ce biais de la sous-classe indique que l&#39;anticorps-récepteur Fc (FcR) les interactions avec les phagocytes sont importantes pour les fonctions effectrices des anticorps opsonisants antimerozoite 4. Plusieurs vaccins antigène mérozoïte en cours de développement sont conçus poursusciter des fonctions effectrices phagocytaires 5, 6 et bien des preuves significatives de l&#39;importance des interactions anticorps-FcR dans des modèles de rongeurs paludisme existe 7-9, et quelques études récentes corroborent l&#39;importance d&#39;anticorps fonctionnels et fonctions phagocyte effectrices de l&#39;immunité au paludisme chez l&#39;homme 10, 11, ce domaine reste peu étudiée. Étude en anticorps spécifiques opsonisants mérozoïtes a été limitée par deux facteurs; la difficulté à isoler bonnes mérozoïtes de qualité; et les variables des réponses de phagocytose de cellules primaires. Jusqu&#39;à récemment, la centrifugation à grande vitesse ou de densité Percoll gradients ont été utilisés pour isoler les mérozoïtes de surnageants de culture de la rupture des schizontes cultures. Ces mérozoïtes étaient rarement viable, et souvent davantage manipulés par centrifugation de densité et lavage plusieurs étapes 12, 11 ou cryoconservation avant utilisation dans des essais. Ce processes potentiellement détachent de nombreuses protéines associées à la périphérie de la surface du mérozoïte, des protéines connues pour être des cibles antigéniques de l&#39;immunité antipaludique 13. Récemment, le inhibiteur de la cystéine protéase trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E64) a été utilisé pour générer les mérozoïtes viables. E64 empêche la rupture des schizontes, générant membrane clos mérozoïtes 14, qui peut être perturbé par filtration pour libérer mérozoïtes viables 15, 16. Cette technique a conduit à la résolution spatiale de nombreuses protéines au cours de l&#39;invasion des érythrocytes 15, 17 à 19 et a clarifié l&#39;effet spécifique de la phase de plusieurs médicaments antipaludiques 16, 20. Toutefois, la génération de mérozoïtes viables demeure un défi technique. Pour aider à la diffusion de cette technique et l&#39;application de tests fonctionnels de l&#39;immunité, un protocole détaillé pour la purification des mérozoïtes viable et leur utilisation dans undosage fonctionnel standardisé de l&#39;anticorps: la coopération cellulaire dans l&#39;opsonisation et de la phagocytose est décrit ici. Cette technique démontre une avancée significative par rapport analyses précédentes in vitro de mérozoïtes opsonisation, comme rafale neutrophiles respiratoire, dépendante des anticorps cellulaire Inhibition (ADCI), et d&#39;autres essais mérozoïtes de phagocytose. Ces dosages sont peu reproductibles à cause de variations dans les entrées de parasites et l&#39;activité des cellules phagocytaires primaires 11, 21. Hemozoin contamination peut également affecter profondément la fonction phagocytaire 22. Un essai de phagocytose mérozoïte robuste et reproductible récemment rapporté 23 utilise la lignée cellulaire promonocytaire THP-1 24. Il s&#39;agit d&#39;un type de cellule idéale pour des analyses de cytométrie de flux à haut débit car il est non adhérente et réalise Fc Receptor phagocytose médiée 25, 26 spécifiquement. Une complexité supplémentaire pendant investisseurstigating phagocytose est que le degré de la phagocytose est dépendante du nombre de mérozoïtes par rapport aux cellules THP-1 et la concentration plasmatique. Pour assurer la reproductibilité entre les expériences, les mérozoïtes doivent être énumérés et une concentration définie utilisés. En raison de leur petite taille, le débit quantification par cytométrie est nécessaire. Le procédé décrit ici élimine hemozoin et génère des mérozoïtes viables, et décrit une application de ces mérozoïtes pour cytométrie en flux dénombrement des mérozoïtes suivie d&#39;opsonisation et de la phagocytose. Bien que techniquement exigeante, les techniques décrites peuvent s&#39;avérer utiles dans la compréhension de la contribution des réponses d&#39;anticorps spécifiques de la surface des mérozoïtes de naturellement acquise et l&#39;immunité induite par le vaccin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">THP-1 cell line</td>
			<td style="width:225px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">TIB-202</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31800-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:225px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercapthoethanol&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td>Use in Fume Hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pen/Strep Solution (100x)</td>
			<td style="width:225px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">HEPES</td>
			<td style="width:225px;">SAFC</td>
			<td style="width:119px;">90909C</td>
			<td style="width:373px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hypoxanthine</td>
			<td style="width:225px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Human Serum&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Donation from Autralian Red Cross</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available commercially (i.e. Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06329.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentamycin</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;">61022027</td>
			<td style="width:373px;">Injection Quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin Sodium BP (5000IU/mL)</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>procine origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S-hydrochloride</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-sorbitol</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">&#160;50-70-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E64 Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">98281-100G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4.2H20</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10383.4G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:317px;">Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1.09204.0500</td>
			<td style="width:373px;">1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrodisc Syringe Filters 1.2-&#956;m/32-mm</td>
			<td style="width:225px;">Pall Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">4656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">QuadroMACS Separator (for small column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td>Interchangeable with MidiMACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">VarioMACS Separator (for large columns)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-090-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Column (small magnetic column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">large magnetic column</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:225px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1510433</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:225px;">Invitogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader</td>
			<td style="width:225px;">BD Biopsciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">FlowJo cytometry analysis software</td>
			<td style="width:225px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays

Plasmodium falciparum antigènes de mérozoïtes sont en cours de développement en tant que vaccins potentiels contre le paludisme. Un aspect de l&#39;immunité contre la malaria est l&#39;élimination des mérozoïtes libres du sang par les cellules phagocytaires. Cependant l&#39;évaluation de l&#39;efficacité fonctionnelle des anticorps spécifiques de mérozoïtes opsonisation est difficile en raison de la courte demi-vie de mérozoïtes et la variabilité des cellules phagocytaires primaires. Décrit en détail est ici un procédé pour générer des mérozoïtes viables en utilisant l&#39;inhibiteur de la protéase E64, et un dosage de mérozoïte opsonin phagocytose dépendante en utilisant la lignée cellulaire pro-monocytaire THP-1. E64 empêche la rupture des schizontes tout en permettant le développement de mérozoïtes qui sont libérés par filtration de schizontes traités. Le bromure d&#39;éthidium mérozoïtes marqués sont opsonisés avec des échantillons de plasma humain et ajoutés aux cellules THP-1. La phagocytose est évaluée par un protocole à haut débit normalisé. Mérozoïtes viables sont une ressource précieuse pour évaluer numeraspects UO de P. biologie falciparum, y compris l&#39;évaluation de la fonction immunitaire. Les niveaux d&#39;anticorps mesurés par ce test sont associés à l&#39;immunité clinique de paludisme chez les individus exposés naturellement. Le dosage peut également être utile pour l&#39;évaluation des anticorps induits par la vaccination.

Le stade de la maturation des parasites avant le traitement E64 est essentiel pour générer mérozoïtes membraneux. Figure 1Ai montre l&#39;étape appropriée de la maturation des schizontes pour ajouter E64. Les parasites doivent être grandes et de remplir pratiquement le globule rouge. Un aspect tacheté de Giemsa indique mérogonie a commencé, et E64 devrait être ajouté pour donner mérozoïtes membraneux (Figure 1Aii). Si E64 est ajouté précédemment à trophozoite parasites au stade, la membrane mérozoïtes clos ne sont pas générés, même après 12 heures de E64. Au lieu de prendre des parasites sur la morphologie anormale tels que l&#39;élargissement de la vacuole digestive (Figure 1BI et 1Bii), et les mérozoïtes sont pas formées. Si E64 est ajouté plus tard à schizontes, les mérozoïtes de membrane clos ne sont pas générés comme schizonte rupture est désinhibée (Figure 1Ci et 1Cii). Un niveau élevé de parasite synchronie est nécessaire, d&#39;autressage une gamme de trois résultats décrits verra après le traitement E64. Retrait de hemozoin est une autre étape critique pour les mérozoïtes de purification. Si les mérozoïtes sont pas purifiés à partir hemozoin alors grappes de mérozoïtes-hemozoin forment qui ne peut être délogé par pipetage. Ces agrégats s&#39;exécutent sur ​​le cytomètre comme des événements uniques, mais avec différents avant-diffusion et dispersion latérale caractéristiques que les mérozoïtes isolés, ce qui inexacte mérozoïtes comptage par cytométrie de flux (figure 2A). Comme cellules THP-1 peuvent aussi phagocyter hemozoin, ces grappes mérozoïtes-hémozoïne peuvent également être phagocytées (figure 2B). Ces agrégats sont fluorescentes très BET, car ils contiennent de multiples mérozoïtes. La phagocytose d&#39;agrégats se traduit par une THP-1 le profil de fluorescence de EtBr équivalente à celle observée pour la phagocytose des mérozoïtes individuels multiples. Par conséquent, si hemozoin n&#39;est pas retiré, la fluorescence du BET de cellules THP-1 sera un overestimate du potentiel d&#39;opsonisation pour le plasma à tester. Hémozoïne est également signalé à modifier considérablement la fonction des phagocytes. Mérozoïtes GFP-positives sont contre-colorées avec BET pour augmenter la visualisation des mérozoïtes phagocytés par cellules THP-1. En utilisant les conditions décrites dans le présent protocole, toutes les mérozoïtes GFP-positives sont contre-BET qui a une intensité de fluorescence lumineuse (figure 3A). évaluation de la phagocytose par BET fluorescence permet une résolution supérieure de mérozoïtes phagocytose de fluorescence de la GFP (figure 3B). Le nombre de mérozoïtes ajoutées à l&#39;essai module la quantité de phagocytose observé. Pour cette raison, le comptage précis par cytométrie de flux est critique. L&#39;augmentation des rapports de mérozoïtes: THP-1 entraîne une augmentation de l&#39;adhérence des mérozoïtes de cellules THP-1 en l&#39;absence de plasma (Figure 4A). L&#39;augmentation de mérozoïtes: THP-1 ratios se traduit également par une augmentation du pHRéponses de agocytosis lorsque mérozoïtes sont opsonisés (Figure 4B). A 04h01 mérozoïtes: THP-1 ratio est recommandé pour les réponses robustes phagocytaires. L&#39;utilisation de ce rapport, et la dilution de plasma indiqué, ce test est capable de résoudre les niveaux d&#39;anticorps opsonisants faible, intermédiaire et élevé. Entre 0 et 78 pour cent des réponses de phagocytose ont été observés en utilisant des échantillons de plasma PNG et les autres conditions décrites. Ces réponses sont présentés récemment à associer naturellement acquis une immunité clinique de paludisme 10. Figure 5 montre des exemples des quatre quartiles de réponses de phagocytose de personnes PNG. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Moment de plus E64 est essentiel pour générer mérozoïtes membraneux. (A) maturatio appropriée. étape n de parasites i) avant le traitement E64, et ii) la membrane mérozoïtes clos produits après 6 h de traitement (B) E64 membrane mérozoïtes fermés ne sont pas générés si E64 est ajouté à des parasites immatures; i) trophozoïtes de stade tardif, et ii) après 12 heures de E64 (C) schizontes rupture n&#39;est pas inhibée si E64 est ajouté à la fin de schizontes segmenté.; i) schizontes stade tardif, et ii) après 6 heures de E64. La barre d&#39;échelle représente 10 um. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> Hémozoïne enlèvement Figure 2. Est essentiel pour générer une suspension des mérozoïtes seule cellule. Agrégats Merozoite-hémozoïne formulaire suivant filtration des membranes mérozoïtes clos, à moins que hemozoin est séparée magnétiquement mérozoïtes. (A) vers l&#39;avant dispersion et côté-dispersion des parcelles de mérozoïtes avec hemozoin retiréet hemozoin retenu. (b) Les agrégats de hémozoïne-mérozoïtes peuvent être phagocytés par les cellules THP-1. Colorées Diff-Quick diapositives cyto-spin de THP-1 cellules incubées avec PNG plasma opsonisés préparations mérozoïtes avec ou sans hemozoin. La barre d&#39;échelle représente 10 um. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3. Bromure d&#39;éthidium coloration permet une résolution supérieure de mérozoïtes phagocytose. D10-GFP mérozoïtes purifiés sont contre-BET à améliorer l&#39;intensité de fluorescence. (A) La cytométrie en flux histrogram de mérozoïtes purifiés avec déclenchement sur ​​mérozoïtes GFP-positives, et une dot blot montrant BET fluorescence sein de cette population positif GFP fermée. (B) avant diffusion par rapport à la GFP et diffusion vers l&#39;avant par rapport BET de cellules THP-1 suivant la phagocytose de la GFP et EtBr double mérozoïtes fluorescentes. Portes ont été; d<html> rawn sur la base des cellules THP-1 avec mérozoïtes et pas de contrôle de plasma. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4 des mérozoïtes. THP-1 rapport influe sur le degré de phagocytose observée. (A) Cinq mérozoïtes: THP-1 ratios sont représentés; 50:1, 20:1, 10:01, 04:01, 01:01. Cellules commande indique seulement la fluorescence de fond due à des cellules THP-1. THP-1 EtBr fluorescence pour chaque rapport est indiqué pour les mérozoïtes opsonisées avec un pool de PNG plasma ou de plasma australien non immune (B) Mean fluorescence d&#39;intensité de cellules THP-1 pour mérozoïte différent:. THP-1 ratios, et opsonisation avec un pool de PNG plasma ou plasma australien non immune (moyenne + SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> ove_content &quot;fo: keep-together.within page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5. Une large gamme d&#39;anticorps opsonisants peut être mesurée. Mérozoïtes ont été opsonisées avec le plasma de personnes PNG et incubées avec cellules THP-1. Quatre réponses de phagocytose représentatifs sont présentés. Portes ont été établis sur la base des cellules THP-1 avec mérozoïtes et pas de contrôle de plasma, et chiffres indiquent le% phagocytose après soustraction des cellules THP-1 avec contrôle du plasma non-immunitaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Fonction de mesure d&#39;anticorps est la clé de la compréhension de l&#39;immunité au paludisme à Plasmodium falciparum. Cette méthode décrit la purification de mérozoïtes viables, et la mesure de la phagocytose dépendante de l&#39;opsonisation par cytométrie de flux.

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Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

22.7K vues.  Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research.  Fonction de mesure d'anticorps est la clé de la compréhension de l'immunité au paludisme à Plasmodium falciparum. Cette méthode décrit la purification de mérozoïtes viables, et la mesure de la phagocytose dépendante de l'opsonisation par cytométrie de flux. 

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Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Sélection des Plasmodium falciparum Parasites des Cytoadhesion aux cellules du cerveau endothéliales humaines

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Recherche

Immunologie et infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infection modèle pour étudier<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 dans les interactions de l&#39;homme primaires dérivées de monocytes cellules immunitaires

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

Un protocole simple pour agglutination des plaquettes induite par des<em&gt; Plasmodium falciparum</emLes érythrocytes&gt; infectées dans une ressource Mauvais réglage

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Séparation de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Phase érythrocytes infectés par des moyens magnétiques

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Méthodes pour étudier le rôle de réglementation de petits ARN ribosomal et l&#39;occupation des<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Une méthode de rendement efficace et haute pour l&#39;isolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

Par électrochimiluminescence dosages pour îlots pancréatiques humains autoanticorps

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

Purification d'une protéine de masse moléculaire élevée chez Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Purification des préparations extracellulaires de vésicule à haut rendement loin du virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...