Nous remercions les autres membres du laboratoire Javierre pour leurs commentaires sur le manuscrit. Nous remercions le programme CERCA, la Generalitat de Catalunya et la Fondation Josep Carreras pour leur soutien institutionnel. Ce travail a été financé par FEDER/Ministère espagnol de la Science et de l’Innovation (RTI2018-094788-A-I00), l’Association européenne d’hématologie (4823998) et l’Association espagnole contre le cancer (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ est financé par le projet Junior Leader de la Caixa Banking Foundation (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR est financé par une bourse AGAUR FI (2019FI-B00017) et LT-D est financé par une bourse FPI (PRE2019-088005). Nous remercions le programme de doctorat en biochimie et biologie moléculaire de l’Universitat Autònoma de Barcelona pour son soutien. Aucun des bailleurs de fonds n’a été impliqué à aucun moment dans la conception expérimentale ou la rédaction du manuscrit.

Une approche globale pour étudier l’interactome du promoteur dans les cellules rares

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

liCHi-C offre la capacité de générer des bibliothèques d’interactomes promoteurs haute résolution en utilisant un cadre expérimental similaire à celui de PCHi-C, mais avec un nombre de cellules considérablement réduit. Ceci est grandement réalisé en éliminant les étapes inutiles, telles que la purification du phénol et l’élimination de la biotine. Dans le protocole57 classique de ligature dans le noyau et sa technique dérivée ultérieure PCHi-C, la biotine est retirée des fra...

L’expression génique temporelle entraîne la différenciation cellulaire et, en fin de compte, le développement de l’organisme, et son altération est étroitement liée à une large pléthore de maladies 1,2,3,4,5. La transcription des gènes est finement régulée par l’action d’éléments régulateurs, qui peuvent être classés comme proximaux (promoteurs de gènes) et distaux (par exemple, amplificateurs ou silencieux), ces derniers étant fréquemment situés loin de leurs gènes cibles et interagissent physiquement avec eux par boucle de chromatine pour moduler l’expression des gènes 6,7,8.
L’identification des régions régulatrices distales dans le génome est une question qui fait l’objet d’un large consensus, puisque ces régions abritent des modifications spécifiques des histones 9,10,11 et contiennent des motifs spécifiques de reconnaissance des facteurs de transcription, agissant comme des plates-formes de recrutement pour eux12,13,14. En outre, dans le cas des amplificateurs et des super-amplificateurs 15,16, ils ont également une faible occupation des nucléosomes 17,18 et sont transcrits en ARNe non codants 19,20.
Néanmoins, les gènes cibles de chaque élément régulateur distal sont plus difficiles à prédire. Le plus souvent, les interactions entre les éléments régulateurs distaux et leurs cibles sont de type cellulaire et spécifiques au stimulus 21,22, couvrent des centaines de kilobases, reliant d’autres gènes dans n’importe quelle direction 23,24,25, et peuvent même être situées à l’intérieur des régions introniques de leur gène cible ou d’autres gènes non intermédiaires 26,27. De plus, les éléments régulateurs distaux peuvent également contrôler plus d’un gène à la fois, et vice versa28,29. Cette complexité positionnelle empêche de déterminer les associations régulatrices entre eux et, par conséquent, la plupart des cibles de chaque élément régulateur dans chaque type de cellule restent inconnues.
Au cours des dernières années, il y a eu un essor significatif dans le développement des techniques de capture de conformation chromosomique (3C) pour étudier les interactions de la chromatine. Le plus utilisé d’entre eux, Hi-C, permet de générer une carte de toutes les interactions entre chaque fragment du génome d’une cellule30. Cependant, pour détecter des interactions significatives au niveau des fragments de restriction, Hi-C s’appuie sur le séquençage ultra-profond, interdisant son utilisation pour étudier systématiquement le paysage régulateur des gènes individuels. Pour surmonter cette limitation économique, plusieurs techniques 3C basées sur l’enrichissement ont émergé, telles que-PET31, HiChIP 32 et son homologue à faible intrant HiCuT33. Ces techniques dépendent de l’utilisation d’anticorps pour enrichir les interactions à l’échelle du génome médiées par une protéine spécifique. Néanmoins, la caractéristique unique de ces techniques 3C est également le fléau de leur application; Les utilisateurs comptent sur la disponibilité d’anticorps de haute qualité pour la protéine d’intérêt et ne peuvent pas comparer les conditions dans lesquelles la liaison de la protéine est dynamique.
Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) est une autre technique 3C basée sur l’enrichissement qui contourne ces limitations34,35. En utilisant un système d’enrichissement de sonde à ARN biotinylé, PCHi-C est capable de générer des bibliothèques à haute résolution à l’échelle du génome de régions génomiques interagissant avec 28 650 promoteurs de gènes annotés par des humains ou 27 595 souris, également connus sous le nom d’interactome promoteur. Cette approche permet de détecter des interactions significatives à longue distance à la résolution au niveau des fragments de restriction des promoteurs actifs et inactifs, et de comparer de manière robuste les interactomes promoteurs entre n’importe quelle condition, indépendamment de la dynamique des modifications des histones ou de la liaison aux protéines. Le PCHi-C a été largement utilisé ces dernières années pour identifier les réorganisations d’interactomes promoteurs au cours de la différenciation cellulaire 36,37, identifier le mécanisme d’action des facteurs de transcription38,39 et découvrir de nouveaux gènes et voies potentiels dérégulés dans la maladie par des variantes non codantes 40,41,42,43,44,45,46,47,48, aux côtés de nouvelles mutations non codantes49,50. En outre, en modifiant simplement le système de capture, cette technique peut être personnalisée en fonction de la question biologique pour interroger n’importe quel interactome (par exemple, l’interactome amplificateur 51 ou l’interactome d’une collection d’altérations non codantes41,52).
Cependant, PCHi-C s’appuie sur un minimum de 20 millions de cellules pour effectuer la technique, ce qui empêche l’étude de populations cellulaires rares telles que celles souvent utilisées en biologie du développement et dans les applications cliniques. Pour cette raison, nous avons développé le Capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C), une nouvelle méthode rentable et personnalisable basée sur le cadre expérimental de PCHi-C pour générer des interactomes promoteurs à haute résolution avec une entrée cellulaire faible. En effectuant l’expérience avec un minimum de changements de tube, en échangeant ou en éliminant des étapes du protocole PCHi-C original, en réduisant considérablement les volumes de réaction et en modifiant les concentrations de réactifs, la complexité de la bibliothèque est maximisée et il est possible de générer des bibliothèques de haute qualité avec aussi peu que 50 000 cellules53.
Le Hi-C à capture à faible entrée (liCHi-C) a été comparé au PCHi-C et utilisé pour élucider le recâblage de l’interactome promoteur au cours de la différenciation des cellules hématopoïétiques humaines, découvrir de nouveaux gènes et voies potentiellement associés à la maladie dérégulés par des altérations non codantes et détecter des anomalies chromosomiques53. Le protocole étape par étape et les différents contrôles de qualité à travers la technique sont détaillés ici jusqu’à la génération finale des bibliothèques et leur analyse informatique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mM Biotin-14-dATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x T4 DNA ligase reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg/mL Bovine Serum Albumin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock Gel Light tubes</td>
			<td>Qiuantabio</td>
			<td>2302820</td>
			<td>For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters and PCR primers for library amplification</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>Bought as individual primers with PAGE purification for NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHiCAGO R package</td>
			<td>1.14.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanNGS beads</td>
			<td>CleanNA</td>
			<td>CNGS-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U120A, U121A, U122A, U123A</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind tube, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65602</td>
			<td>For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiCUP</td>
			<td>0.8.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII, 100 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow EXO- 5000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-retention filter tips&#160;(10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L and 1000 &#181;L)</td>
			<td>ZeroTip</td>
			<td>PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>For sonication in section 6 (sonication)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF, 100 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3131M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers for quality controls</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips&#160;and caps</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>410022, 401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531L</td>
			<td>For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) 
			and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td>For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutsmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS - Solution 10% for molecular biology</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect custom 3-5.9 Mb library</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-4831</td>
			<td>Custom designed mouse or human capture system, used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Target Enrichment Box 1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-8645</td>
			<td>Used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>931107</td>
			<td>Used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224025</td>
			<td>For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 2000000/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td>For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK 10000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 4200 instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and 
			section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,</td>
			<td>For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and 
			section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 for molecular biology</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated workflow to study the promoter-centric spatio-temporal genome architecture in scarce cell populations

La transcription des gènes spatio-temporels est étroitement régulée par des éléments régulateurs distaux, tels que les amplificateurs et les silencieux, qui s’appuient sur la proximité physique avec leurs promoteurs de gènes cibles pour contrôler la transcription. Bien que ces éléments régulateurs soient faciles à identifier, leurs gènes cibles sont difficiles à prédire, car la plupart d’entre eux sont spécifiques au type cellulaire et peuvent être séparés par des centaines de kilobases dans la séquence linéaire du génome, ignorant d’autres gènes non cibles. Depuis plusieurs années, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) est l’étalon-or pour l’association d’éléments régulateurs distaux à leurs gènes cibles. Cependant, PCHi-C repose sur la disponibilité de millions de cellules, interdisant l’étude de populations de cellules rares telles que celles couramment obtenues à partir de tissus primaires. Pour surmonter cette limitation, une méthode de capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C), une méthode rentable et personnalisable pour identifier le répertoire d’éléments régulateurs distaux contrôlant chaque gène du génome, a été développée. liCHi-C s’appuie sur un cadre expérimental et informatique similaire à celui de PCHi-C, mais en utilisant des changements de tube minimes, en modifiant la concentration et les volumes de réactifs, et en échangeant ou en éliminant les étapes, il tient compte des pertes de matériaux minimales lors de la construction de la bibliothèque. Collectivement, liCHi-C permet l’étude de la régulation des gènes et de l’organisation spatio-temporelle du génome dans le contexte de la biologie du développement et de la fonction cellulaire.

Temporal gene expression drives cell differentiation and, ultimately, organism development, and its alteration is closely related to a wide plethora of diseases1,2,3,4,5. Gene transcription is finely regulated by the action of regulatory elements, which can be classified as proximal (i.e., gene promoters) and distal (e.g., enhancers or silencers), the latter of which are frequently located afar from their target genes and physically interact with them through chromatin looping to modulate gene expression6,7,8.
The identification of distal regulatory regions in the genome is a matter which is widely agreed upon, since these regions harbor specific histone modifications9,10,11 and contain specific transcription factor recognition motifs, acting as recruiting platforms for them12,13,14. Besides, in the case of enhancers and super-enhancers15,16, they also have low-nucleosome occupancy17,18 and are transcribed into non-coding eRNAs19,20.
Nonetheless, each distal regulatory element&#39;s target genes are more difficult to predict. More often than not, interactions between distal regulatory elements and their targets are cell-type and stimulus specific21,22, span hundreds of kilobases, bridging over other genes in any direction23,24,25, and can even be located inside intronic regions of their target gene or other non-intervening genes26,27. Furthermore, distal regulatory elements can also control more than one gene at the same time, and vice versa28,29. This positional complexity hinders pinpointing regulatory associations between them, and therefore, most of each regulatory element&#39;s targets in every cell type remain unknown.
During recent years, there has been a significant boom in the development of chromosome conformation capture (3C) techniques for studying chromatin interactions. The most widely used of them, Hi-C, allows to generate a map of all the interactions between every fragment of a cell&#39;s genome30. However, to detect significant interactions at the restriction fragment level, Hi-C relies on ultra-deep sequencing, prohibiting its use to routinely study the regulatory landscape of individual genes. To overcome this economic limitation, several enrichment-based 3C techniques have emerged, such as ChIA-PET31, HiChIP32, and its low-input counterpart HiCuT33. These techniques depend on the use of antibodies to enrich for genome-wide interactions mediated by a specific protein. Nonetheless, the unique feature of these 3C techniques is also the bane of their application; users count on the availability of high-quality antibodies for the protein of interest and cannot compare conditions in which the binding of the protein is dynamic.
Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) is another enrichment-based 3C technique that circumvents these limitations34,35. By employing a biotinylated RNA probe enrichment system, PCHi-C is able to generate genome-wide high-resolution libraries of genomic regions interacting with 28,650 human- or 27,595 mouse-annotated gene promoters, also known as the promoter interactome. This approach allows one to detect significant long-range interactions at the restriction fragment level resolution of both active and inactive promoters, and robustly compare promoter interactomes between any condition independently of the dynamics of histone modifications or protein binding. PCHi-C has been widely used over recent years to identify promoter interactome reorganizations during cell differentiation36,37, identify the mechanism of action of transcription factors38,39, and discover new potential genes and pathways deregulated in disease by non-coding variants40,41,42,43,44,45,46,47,48, alongside new driver non-coding mutations49,50. Besides, by just modifying the capture system, this technique can be customized according to the biological question to interrogate any interactome (e.g., the enhancer interactome51 or the interactome of a collection of non-coding alterations41,52).
However, PCHi-C relies on a minimum of 20 million cells to perform the technique, which prevents the study of scarce cell populations such as the ones often used in developmental biology and clinical applications. For this reason, we have developed low input Capture Hi-C (liCHi-C), a new cost-effective and customizable method based on the experimental framework of PCHi-C to generate high-resolution promoter interactomes with low-cell input. By performing the experiment with minimal tube changes, swapping or eliminating steps from the original PCHi-C protocol, drastically reducing reaction volumes, and modifying reagent concentrations, library complexity is maximized and it is possible to generate high-quality libraries with as little as 50,000 cells53.
Low input Capture Hi-C (liCHi-C) has been benchmarked against PCHi-C and used to elucidate promoter interactome rewiring during human hematopoietic cell differentiation, discover potential new disease-associated genes and pathways deregulated by non-coding alterations, and detect chromosomal abnormalities53. The step-by-step protocol and the different quality controls through the technique are detailed here until the final generation of the libraries and their computational analysis.

Pleins feux sur l’auteur : Un flux de travail intégré pour étudier l’architecture spatio-temporelle du génome centrée sur le promoteur dans des populations cellulaires rares  

Un flux de travail intégré pour étudier l’architecture spatio-temporelle du génome centrée sur le promoteur dans des populations cellulaires rares

With liCHi-C, the main question that we are trying to answer is how the chromatin interacts in the nucleus, and therefore, to understand a new layer of gene regulation. We have proven with liCHi-C that we can explore the genome organization of a given sample, link the non-coding mutation associated with disease with potential genes affected, and detect chromosomal rearrangements, such as translocation, for example, in tumor samples. Now we can explore the 3D chromatin organization of scar cell types, such as primary stem cells or relevant clinical samples.Our protocol reduces the input materials and the time and cost needed to obtain quality data to explore the genome organization at the restriction fragment resolution. liCHi-C is expanding the reach of the 3D chromatin organization field, allowing us to explore new cell types previously impossible to analyze. Thanks to liCHi-C, the scientific community can explore the special regulation of gene expression.For example, in malignant transformation only in a specific clonal sub-population inside a tumor.

liCHi-C offre la possibilité de générer des bibliothèques d’interactomes promoteurs de haute qualité et à résolution à l’échelle du génome avec aussi peu que 50 000 cellules53. Ceci est accompli en supprimant les étapes inutiles du protocole d’origine des volumes de réaction et l’utilisation de produits en plastique à faible liaison de l’ADN tout au long du protocole. Il s’agit notamment de la purification du phénol après réticulation, de l’élimination de la biotine,...

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations at JoVE.com

L’expression des gènes est régulée par les interactions des promoteurs de gènes avec les éléments régulateurs distaux. Ici, nous décrivons comment la capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C) permet l’identification de ces interactions dans des types de cellules rares, qui étaient auparavant non mesurables.

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity ...

Avec liCHi-C, la principale question à laquelle nous essayons de répondre est de savoir comment la chromatine interagit dans le noyau, et donc, de comprendre une nouvelle couche de régulation des gènes. Nous avons prouvé avec liCHi-C que nous pouvons explorer l’organisation du génome d’un échantillon donné, relier la mutation non codante associée à la maladie aux gènes potentiels affectés et détecter les réarrangements chromosomiques, tels que la translocation, par exemple, dans les échantillons tumoraux. Nous pouvons maintenant explorer l’organisation chromatique 3D des types de cellules cicatricielles, telles que les cellules souches primaires ou les échantillons cliniques pertinents.Notre protocole réduit les matériaux d’entrée ainsi que le temps et le coût nécessaires pour obtenir des données de qualité afin d’explorer l’organisation du génome à la résolution du fragment de restriction. liCHi-C étend la portée du champ d’organisation de la chromatine 3D, ce qui nous permet d’explorer de nouveaux types de cellules auparavant impossibles à analyser. Grâce au liCHi-C, la communauté scientifique peut explorer la régulation particulière de l’expression génique.Par exemple, dans la transformation maligne uniquement dans une sous-population clonale spécifique à l’intérieur d’une tumeur.

an-integrated-workflow-to-study-promoter-centric-spatio-temporal

Research

JoVE Journal

Genetics

An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations

968 vues.  Josep Carreras Leukaemia Research Institute. Avec liCHi-C, la principale question à laquelle nous essayons de répondre est de savoir comment la chromatine interagit dans le noyau, et donc, de comprendre une nouvelle couche de régulation des gènes. Nous avons prouvé avec liCHi-C que nous pouvons explorer l’organisation du génome d’un échantillon donné, relier la mutation non codante associée à la maladie aux gènes potentiels affectés et détecter les réarrangements chromosomiques, tels que la translocation, par exemple, ...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Un flux de travail intégré pour étudier l’architecture spatio-temporelle du génome centrée sur le promoteur dans des populations cellulaires rares  

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity with their target gene promoters to control transcription. Although these regulatory elements are easy to identify, their target genes are difficult to predict, since most of them are cell-type specific and may be separated by hundreds of kilobases in the linear genome sequence, skipping over other non-target genes. For several years, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) has been the gold standard for the association of distal regulatory elements to their target genes. However, PCHi-C relies on the availability of millions of cells, prohibiting the study of rare cell populations such as those commonly obtained from primary tissues. To overcome this limitation, low input Capture Hi-C (liCHi-C), a cost-effective and customizable method to identify the repertoire of distal regulatory elements controlling each gene of the genome, has been developed. liCHi-C relies on a similar experimental and computational framework as PCHi-C, but by employing minimal tube changes, modifying&#160;the reagent concentration and volumes, and swapping or eliminating steps, it accounts&#160;for minimal material loss during library construction. Collectively, liCHi-C enables the study of gene regulation and spatiotemporal genome organization in the context of developmental biology and cellular function.

Gene expression is regulated by interactions of gene promoters with distal regulatory elements. Here, we descirbe how low input Capture Hi-C (liCHi-C) allows the identification of these interactions in rare cell types, which were previously unmeasurable.

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Génétique

Lysis and Digestion of Scarce Cells

To begin, take an aliquot of frozen scarce cells and add 1 milliliter of cold lysis buffer to disrupt the cell membrane. Incubate the cells on ice for 30 minutes, mixing by inversion every five minutes. Centrifuge the nuclei for 10 minutes at 1, 000 G.Remove the supernatant and re-suspend the nuclei in 500 microliters of cold 1.25X restriction buffer 2.Then add 5.5 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate, mix by vortexing and incubate in a thermo block. Then quench the SDS by adding 37.5 microliters of 10%Triton X-100. Mix and incubate the sample as demonstrated earlier.Add 7.5 microliters of Hind III to digest the chromatin mix the solution and incubate overnight at 37 degrees Celsius.

Lyse et digestion de cellules rares

Ligation and Decrosslinking of Scarce Cell DNA

To begin, take the digested scarce cell's DNA and place it on ice. Prepare a master mix by using the reagents required to fill in and biotinylate the restriction fragment overhangs. Incubate the sample at 37 degrees Celsius for 75 minutes, mixing by inversion every 15 minutes.Chill the sample on ice, and ligate the filled-in DNA ends by preparing a master mix using the reagents required for ligation. Finally, incubate the sample for four to six hours at 16 degrees Celsius, and then for 30 minutes at room temperature. Add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter of Proteinase K to decrosslink the chromatin.Mix the solution, and incubate overnight at 65 degrees Celsius.

Ligature et réticulation de l’ADN cellulaire rare

Sonication and Biotin Pull-Down of Scarce Cells DNA

After purifying the DNA, begin by taking ligated and decross-linked digested chromatin of the scarce cells. Set the water bath sonicator at a duty factor of 20%peak incidence power of 50 to 200 cycles per burst for 65 seconds, and a temperature range of 6 to 10 degrees Celsius, and sonicate the ligated and decross-linked digested chromatin. After end repairing the sample, transfer 150 microliters of C1 streptavidin beads per sample to a 1.5 milliliter tube.Place them on a 1.5 milliliter tube magnet and wait until all the beads are stuck to the wall. Then remove the supernatant, leaving the beads behind. Next, wash the beads by adding 400 microliters of Tween buffer and resuspending them with soft vortexing.Place the tube back in the magnet until all the beads are stuck to the wall. Then remove the supernatant, leaving the beads behind. After resuspending the beads, in 300 microliters of 2X No-Tween buffer or NTB, combine them with the 300 microliters of the sample.Finally, incubate for 15 minutes rotating at room temperature to pull down the informative DNA fragments with biotin.

Sonication et extraction de biotine de cellules rares ADN

dATP-Tailing, Adapter Ligation, and PCR Amplification of Scarce Cell DNA

DATP-Tailing, Adapter Ligation, and PCR Amplification of Scarce Cell DNA  

To begin, take the scarce cell's DNA fragments pulled with biotin. Prepare a master mix by adding the reagents for dATP tailing and incubate the sample for 30 minutes at 37 degrees Celsius. Then, inactivate Klenow exo-minus by incubating the sample for 10 minutes at 65 degrees Celsius and cooling it on ice.After washing the beads with 300 microliters each of TB, NTB, and 100 microliters of ligation buffer, resuspend them in 50 microliters of ligation buffer. Add four microliters of 15 micromolar pre-annealed adapter mix and one microliter of 2000 units per microliter T4 DNA ligase to the sample. Wash the beads with 400 microliters of TB, 200 microliters of NTB, and 100 microliters of restriction buffer two.After amplifying the library by PCR, pool all the 50 microliter reactions from the same sample into a 1.5 milliliter DNA low binding tube. Place it on a tube magnet and wait until all the beads are stuck to the wall. Transfer the supernatant containing the library to a new 1.5 milliliter DNA low binding tube and top up with TLE buffer to 500 microliters.To perform a double-sided selection using paramagnetic bead purification, add 200 microliters of stock beads to the library, mix by vortexing, and incubate for 10 minutes, rotating at room temperature. Then, place the library on a magnet and wait until all the beads are stuck to the wall. Transfer the supernatant containing the library to a new 1.5 milliliter DNA low binding tube.Concentrate the beads by taking 750 microliters of stock beads and placing them in a 1.5 milliliter tube on a magnet. Once all the beads are stuck to the wall, remove the supernatant and resuspend the beads by vortexing in 300 microliters of new stock beads. Add 300 microliters of concentrated beads to the sample.Mix by vortexing and incubate for 10 minutes, rotating at room temperature. Place on a magnet. Wait until all the beads are stuck to the wall and remove the supernatant.Wash the beads by adding one milliliter of 70%ethanol to the tube with the beads still on the magnet. Allow the beads to air dry and resuspend them in 21 microliters of TLE buffer by vortexing. To elute the library from the beads, incubate the sample for 10 minutes at 37 degrees Celsius in a thermoblock.Place the tube in a magnet and transfer the supernatant containing the library to a new 1.5 milliliter DNA low binding tube.

dATP-Tailing, ligature de l’adaptateur et amplification PCR de l’ADN cellulaire rare

Library Capture, Biotin Pull-Down, and PCR Amplification Using Scarce Cell DNA Library

Begin by taking 500 to 1000 nanograms of the scarce cell DNA library. Dry the DNA with a vacuum concentrator and resuspended it in 3.4 microliters of nuclease-free water. After adding the blockers, and while on the thermocycler, at 65 degrees Celsius, transfer the hybridization solution with the biotinylated RNA to the blocked library.After closing the tube lid firmly, incubate in the thermocycler overnight at 65 degrees Celsius. Then transfer 50 microliters of T1 Streptavidin beads per sample to a 1.5 milliliter DNA low binding tube and place them on a 1.5 milliliter tube magnet. Once all the beads are stuck to the wall, remove the supernatant leaving the beads behind.Now wash the beads thrice with 200 microliters of the binding buffer from the target enrichment kit and resuspend the beads in 200 microliters of binding buffer. Transfer the sample to the resuspended beads while on the thermocycler and incubate for 30 minutes. After washing the beads with 200 microliters of wash buffer 1, incubate them for 15 minutes, rotating at room temperature.Then wash the beads thrice with 200 microliters of wash buffer 2 heated to 65 degrees Celsius and incubate in a thermo block. Finally, after amplifying the library by PCR, perform a DNA purification using paramagnetic beads by adding 270 microliters of stock beads to the sample and mixing by vortexing. An automated electrophoresis profile from a library, just before capture, provided 49.7 nanograms per microliter of DNA in 20 microliters reaction volume.However, 3.06 nanograms per microliter of DNA is obtained from a high sensitivity automated electrophoresis profile from a finished leachic library.