Les auteurs remercient le professeur Paul Hooykaas d’avoir aimablement fourni le vecteur pCAMBIA1302 et Agrobacterium tumefaciens AGL1 de l’Institut de biologie de Leiden, Université de Leiden, Pays-Bas. Les auteurs tiennent également à remercier Eva Colic pour son aide dans la culture des transformants fluorescents. Ces travaux ont été financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada et le programme Mitacs Accélération.

Tous les milieux et solutions doivent être autoclavés avant utilisation, sauf indication contraire. Tous les tubes à centrifuger, les pointes de pipette, etc., doivent être stériles ou autoclavés avant utilisation. Pour faciliter la consultation, les recettes de médias utilisées dans ce protocole sont répertoriées dans le tableau 1.
1. Préparation des cellules électrocompétentes d’A. tumefaciens 
<ol><li>Inoculer Agrobacterium (AGL-1) dans un flacon agitateur stérile de 25 mL de milieu LB (supplémenté en rifampicine, 20 mg/L-1) à partir d’un stock de glycérol congelé et cultiver pendant la nuit à 28-30 °C et 150 tr/min. REMARQUE : La souche AGL-1 d’Agrobacterium est (voir le tableau des matériaux) résistante à la rifampicine, à l’ampicilline, au chloramphénicol et à la streptomycine et peut être obtenue auprès de plusieurs fournisseurs.</li>
	<li>Le lendemain, diluez la culture 1 00 000 fois en ajoutant 0,5 μL de la culture de nuit à 50 mL d’eau ultra-pure autoclavée et étalez 10 μL de cette culture diluée sur une plaque LB, puis incubez à 28-30 °C pendant 1 à 3 jours.</li>
	<li>Choisissez une colonie et commencez une culture de nuit de 20 ml dans LB avec de la rifampicine à 28-30 °C.</li>
	<li>Le lendemain, inoculer 500 mL de milieu LB (sans antibiotique) dans un flacon shaker avec 9 mL de culture de nuit et cultiver à 28-30 °C jusqu’à ce que la OD600 atteigne 0,5.</li>
	<li>Répartir la culture uniformément dans dix tubes à centrifuger de 50 ml et laisser refroidir sur de la glace pendant 30 minutes. Pré-refroidir la centrifugeuse à 4 °C.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 4 °C et 4000 x g pendant 15 min. Par la suite, retirez le plus de surnageant possible à l’aide d’une pipette et remettez en suspension la pastille dans chaque tube dans 50 ml d’eau glacée.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 4 °C et 4000 x g pendant 15 min. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 25 mL d’eau glacée dans chaque tube.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 4 °C et 4000 x g pendant 15 min. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de glycérol glacé à 10 % (p/v) dans chaque tube.</li>
	<li>Combinez tous les tubes en un tube de 50 mL et centrifugez les cellules à 4 °C et 4000 x g pendant 15 min. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 400 μL de glycérol glacé à 10 % (p/v). La concentration cellulaire doit être d’environ 1-3 x10 10 cellules/mL.</li>
	<li>Répartir les cellules sous forme d’aliquotes de 50 μL dans des microtubes stériles préréfrigérés. Congeler dans de l’azote liquide et conserver au congélateur à -80 °C.</li>
</ol>2. Électroporation d’A. tumefaciens
<ol><li>Ajouter 50 μL de cellules électrocompétentes AGL-1 A. tumefaciens dans une cuvette prérefroidie de 0,1 mm et ajouter 2 μL de pCAMBIA1302 ou de plasmide similaire (conc 15 ng/μL) (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Électroporer à 2400 V à l’aide d’un électroporateur (200 Ω, prolongateur de capacité 250 μFD, capacité 25 μFD, décroissance exponentielle, voir tableau des matériaux). La constante de temps doit être de >4,5 ms pour une électroporation réussie avec une décroissance exponentielle.</li>
	<li>Ajouter immédiatement 1 mL de milieu LB dans la cuvette et pipeter doucement de haut en bas pour mélanger. Transférez 1 mL de cellules remises en suspension dans un microtube de 1,5 mL et incubez-le à 28-30 °C pendant au moins 1 h pour qu’il se rétablisse.</li>
	<li>Plaquer les cellules sur de la gélose LB contenant l’antibiotique approprié (c.-à-d. 50 mg/L de kanamycine pour la pCAMBIA1302 pour la sélection procaryote).</li>
	<li>Incuber à 28-30 °C pendant 2-3 jours.</li>
	<li>Sélectionner une colonie, la cultiver pendant la nuit en LB avec la sélection appropriée (50 mg/L de kanamycine pour pCAMBIA1302) et cryoconserver la souche contenant le plasmide en utilisant 50 % de glycérol à -80 °C pour une utilisation future.</li>
</ol>3. AMT de C. vulgaris
NOTE : Préparer les cultures de C. vulgaris (UTEX 395, voir le tableau des matériaux) et d’A. tumefaciens en parallèle pour la coculture. Les cultures de C. vulgaridoivent être commencées 3 jours avant la préparation des cultures d’A. tumefaciens. Le protocole a été modifié sur la base de celui publié par Kumar et al.7.
<ol><li>Préparer la culture de C. vulgaris <ol><li>C. vulgaris est traditionnellement entreposé en biais ou maintenu dans des cultures en phase logarithmique dans des conditions éclairées. À partir d’une culture en phase logarithmique àOD 600 = 1,0, étaler 0,5 mL sur une gélose au tris-acétate-phosphate (TAP, voir tableau 1) ( 1,2 % p/v gélose A) et laisser pousser pendant 5 jours à 25 °C avec éclairage (50 μE/m2s). Cela donnera environ 5 x 106 cellules.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer la culture d’A. tumefaciens <ol><li>Cultiver la souche AGL-1 pCAMBIA1302 d’A. tumefaciens dans un ballon agitateur en inoculant 10 mL de milieu LB additionné de 15 mM de glucose, 20 mg/L de rifampicine et 50 mg/L de kanamycine (voir le tableau des matériaux) à l’aide du stock de glycérol. Incuber à 28-30 °C et 250 tr/min pendant la nuit.</li>
		<li>Inoculer 1 mL de culture de nuit dans 50 mL de LB avec 15 mM de glucose, 20 mg/L de rifampicine et 50 mg/L de kanamycine et incuber à 28-30 °C et 250 tr/min jusqu’à ce que la DO600 atteigne 1,0.</li>
	</ol></li>
	<li>Cocultiver C. vulgaris et A. tumefaciens
	<ol><li>Pour préparer la culture d’A. tumefaciens à la co-culture, transvaser la culture cultivée dans un tube de 50 mL et centrifuger à 4000 x g pendant 30 min à température ambiante. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et lavez les cellules deux fois avec le milieu d’induction. REMARQUE : Le milieu d’induction utilisé est un milieu TAP ajusté à un pH de 5,5 et complété par des métaux traces moyens F/2 et des vitamines avec 200 μM d’acétosyringone (AS, voir le tableau des matériaux). Remettre les cellules en suspension dans un milieu d’induction tel que OD600 = 0,5.</li>
		<li>Pour préparer la culture de C. vulgaris en vue de la coculture, ajouter 25 mL de milieu d’induction dans la plaque de C. vulgaris contenant ~ 5 x 106 cellules. Transférer dans un tube de 50 ml. Centrifuger les cellules à 4000 x g pendant 15 min à température ambiante et jeter le surnageant.</li>
		<li>Mélanger la pastille de cellules d’algues avec 200 μL de suspension bactérienne (OD600 : 0,5) et les incuber dans un agitateur rotatif à 21-25 °C à 150 tr/min pendant 1 h.</li>
		<li>Étaler la culture mixte (200 μL) sur des plaques de milieu d’induction additionnées de 15 mM de glucose et incuber à 21-25 °C dans l’obscurité pendant 3 jours.</li>
		<li>Après 3 jours, utiliser 10 mL de milieu TAP additionné de 400 mg/L de céfotaxime ou de 20 mg/L de tétracycline (voir le tableau des matériaux) pour recueillir les microalgues et incuber dans l’obscurité à 21-25 °C pendant 2 jours afin d’éliminer A. tumefaciens de la culture.</li>
		<li>Plaquer 500 μL de la culture sur un milieu sélectif, par exemple un milieu TAP complété par 20 à 70 mg/L d’hygromycine B (en cas d’utilisation de pCAMBIA1302) et 400 mg/L-1 de céfotaxime ou 20 mg/L de tétracycline. Incubez-les à 21-25 °C dans l’obscurité pendant 2 jours avant de les placer dans une chambre éclairée. REMARQUE : Les colonies résistantes apparaîtront 5 à 7 jours après l’exposition à la lumière.</li>
		<li>Prélever des colonies individuelles dans la plaque de transformation et les rééstrier sur des plaques de gélose TAP additionnées de 400 mg/L de céfotaxime ou de 20 mg/L de tétracycline et de 20 à 70 mg/L d’hygromycine B.</li>
	</ol></li>
</ol>4. PCR de colonie (cPCR) pour confirmer l’intégration des gènes chez les transformants de C. vulgaris 
<ol><li>Extraire l’ADN génomique d’un transformant de C. vulgaris après avoir été sous-cultivé au moins deux fois à partir d’une seule colonie à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN génomique végétal (voir le tableau des matériaux). À l’aide de ce modèle pour la PCR, concevez des amorces pour la région mgfp5 de l’ADN-T (mgfp5-Fwd : 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' et M13-Rev : 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').<ol><li>À l’aide d’un kit de mélange maître d’ADN polymérase haute fidélité Q5 (voir le tableau des matériaux), effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour valider l’intégration du transgène. NOTE : Les conditions suivantes ont été utilisées pour la présente étude : 98 °C pendant 3 min ; 35 cycles (98 °C pendant 10 s, 57 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 1 min) ; 72 °C pendant 5min. Utiliser pCAMBIA1302 comme témoin positif et l’ADN génomique de C. vulgaris de type sauvage comme témoin négatif.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour confirmer qu’il n’y a pas de pCAMBIA1302 présent dans l’échantillon en raison d’une contamination résiduelle par A. tumefaciens, utiliser la PCR de colonie. Ajouter une petite quantité de cellules transformantes à 10 μL d’eau stérile et faire bouillir à 98 °C pendant 15 min. Utilisez-le comme modèle pour la PCR.<ol><li>Amorces de conception pour une région à l’extérieur de l’ADN-T sur pCAMBIA1302 (B1-Fwd : 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' et B1-Rev : 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3'). NOTE : Les conditions suivantes ont été utilisées pour la présente étude : 94 °C pendant 3 min ; 30 cycles (94 °C pendant 30 s, 48 °C pendant 30 s, 68 °C pendant 5 min) ; 68 °C pendant 7 min. Utiliser une colonie bouillie d’A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) comme témoin positif et une colonie bouillie de C. vulgaris de type sauvage comme témoin négatif.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour confirmer qu’il n’y a pas de contamination par A. tumerfaciens dans l’échantillon, utilisez la PCR de la colonie. Ajouter une petite quantité de cellules transformantes à 10 μL d’eau stérile et faire bouillir à 98 °C pendant 15 min. Utilisez-le comme modèle pour la PCR.<ol><li>Amorces de conception pour le gène virE2 contenu sur le plasmide de virulence AGL-1 (virE2-Fwd : 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' et virE2-Rev : 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3'). NOTE : Les conditions suivantes ont été utilisées pour la présente étude : 94 °C pendant 3 min ; 30 cycles (94 °C pendant 30 s, 53 °C pendant 30 s, 68 °C pendant 3 min) ; 68 °C pendant 7 min. Utiliser une colonie bouillie d’A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) comme témoin positif et une colonie bouillie de C. vulgaris de type sauvage comme témoin négatif.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer des prélèvements PCR sur un gel d’ADN d’agarose avec une échelle (échelle d’ADN de 1 Kbp, voir le tableau des matériaux) pour confirmer la taille des fragments obtenus16.</li>
</ol>5. Mesure de la fluorescence des transformants
<ol><li>Inoculer chaque transformant à partir d’une culture d’entretien en phase logarithmique ou d’une gélose TAP oblique dans 50 mL de TAP additionné de 200 mg/L-1 de céfotaxime et de 25 mg/L-1 d’hygromycine B de sorte que la DO de départ600 = 0,1. Inoculer une culture avec le C. vulgaris de type sauvage et seulement 200 mg/L-1 de céfotaxime comme témoin négatif. Incuber à 25 °C à 150 tr/min avec 150 μmol/m2s de lumière photosynthétiquement active (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Toutes les 24 h, prélever un échantillon de 300 μL et mesurer l’absorbance et la fluorescence (excitation 488 nm, émission 526 nm) dans un lecteur de plaques à 96 puits ou un spectromètre UV/Vis et un fluorimètre (voir Tableau des matériaux). Utilisez une plaque noire avec un fond transparent pour des mesures simultanées.</li>
</ol>6. Extraction de protéines brutes, purification de protéines et électrophorèse SDS-PAGE
<ol><li>Inoculer le transformant (#50) d’une culture d’entretien en phase logarithmique dans 300 mL de TAP additionné de 200 mg/L-1 de céfotaxime et de 25 mg/L-1 d’hygromycine B pour atteindre la DO680 = 0,1. Inoculer une culture avec le C. vulgaris de type sauvage et seulement 200 mg/L-1 de céfotaxime comme témoin négatif. Incuber à 25 °C à 150 tr/min avec 150 μmol/m2s de lumière photosynthétiquement active.</li>
	<li>Extraire l’échantillon de protéines brutes des souches transformantes (#50) et sauvages à l’aide d’un tampon de lyse de 5 mL (voir le tableau 1), suivi d’une sonication pendant 4 minutes.</li>
	<li>Purifier l’échantillon de protéines brutes à l’aide d’une résine Ni-NTA à travers des colonnes de polypropylène de 5 ml (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Lyophiliser les échantillons de protéines purifiées de 15 mL et les remettre en suspension dans un tampon de lyse de 1 mL pour l’analyse SDS-PAGE17.</li>
</ol>

Intégration génique stable chez Chlorella vulgaris à l’aide d’Agrobacterium tumefaciens

<ol>
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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

L’efficacité de la transformation est associée à plusieurs paramètres différents. Le choix des souches d’A. tumefaciens utilisées pour l’AMT est crucial. L’AGL-1 est l’une des souches les plus invasives découvertes et, pour cette raison, a été couramment utilisée dans l’AMT des plantes. La supplémentation du milieu d’induction avec du glucose (15-20 mM) est également importante pour l’efficacité de l’AMT. Étant donné que C. vulgaris peut se développer dans des condition...

Agrobacterium tumefaciens, une bactérie à Gram négatif transmise par le sol, possède une capacité unique de transfert de gènes entre règnes, ce qui lui a valu le titre d'« ingénieur génétique naturel »1. Cette bactérie peut transférer l’ADN (ADN-T) d’un plasmide inducteur de tumeur (Ti-Plasmide) dans les cellules hôtes par le biais d’un système de sécrétion de type IV, ce qui entraîne l’intégration et l’expression de l’ADN-T dans le génome de l’hôte 1,2,3,4. Dans le cadre naturel, ce processus conduit à la formation de tumeurs chez les plantes, communément appelée maladie de la galle du collet. Cependant, Agrobacterium peut également transférer l’ADN-T dans divers autres organismes, y compris les levures, les champignons, les algues, les embryons d’oursins et même les cellules humaines dans des conditions de laboratoire 5,6,7,8.
Exploitant ce système naturel, la transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) permet l’intégration aléatoire de gènes d’intérêt dans le génome nucléaire d’une cellule hôte en modifiant la région de l’ADN-T du plasmide Ti. À cette fin, un vecteur d’expression de l’AMT largement utilisé est pCAMBIA13029. Les chercheurs peuvent utiliser des processus de clonage simples chez E. coli avant de transférer le vecteur souhaité dans A. tumefaciens pour un transfert ultérieur à l’hôte d’intérêt.
Les microalgues vertes sont des eucaryotes qui partagent de nombreuses similitudes avec les plantes terrestres mais qui sont très récalcitrantes aux modifications génétiques. Cependant, la transformation génétique joue un rôle crucial dans la recherche fondamentale et biotechnologique sur les microalgues. Chez plusieurs espèces de microalgues, en particulier Chlamydomonas reinhardtii, la transformation génétique via l’AMT a permis d’introduire avec succès des transgènes tels que l’interleukine-2 humaine (hIL-2), le domaine de liaison au récepteur du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2 RBD) et deux peptides antimicrobiens (AMP)10,11,12,13. Parmi celles-ci, Chlorella vulgaris, une espèce d’algue verte moins exigeante et à croissance rapide, présente un potentiel important pour la production durable de glucides, de protéines, de nutraceutiques, de pigments et d’autres composés de grande valeur14. Cependant, le manque d’outils fiables pour créer des souches transgéniques de C. vulgaris entrave son progrès commercial. Étant donné qu’il n’y a eu qu’un nombre limité de travaux publiés utilisant l’AMT chez C. vulgaris15, et compte tenu des différences considérables entre la culture des plantes et celle des microalgues, l’optimisation du protocole AMT devient essentielle.
Dans cette étude, les chercheurs ont inséré une protéine fluorescente verte (mGFP5) en aval du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CamV) et ont ajouté un marqueur d’histidine pour l’utiliser comme gène rapporteur pour l’expression des protéines. Les transformants ont été sélectionnés à l’aide de l’hygromycine B, et après une sous-culture pendant plus de vingt générations, la transformation est restée stable. Le plasmide pCAMBIA1302 utilisé dans ce travail peut être facilement adapté pour contenir n’importe quel gène d’intérêt. De plus, la méthode et les matériaux présentés peuvent être ajustés pour d’autres espèces d’algues vertes avec un promoteur actif CamV35S, car ce promoteur est utilisé pour la sélection de l’hygromycine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>DM015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D26665G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas</td>
			<td>Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>89151-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>J90010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorella vulgaris</td>
			<td>University of Texas at Austin Culture Collection of Algae</td>
			<td>Strain: UTEX 395</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8661-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CX2185-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9234-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652662</td>
			<td>Main unit equipped with PC module.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plant Genome Purification Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH3093-2.2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6068103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gold Biotechnologies</td>
			<td>K-250-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9268-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>BAKR2540-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7971-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA&#183;2H2O</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>8993-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>BAKR3764-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7257-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CA80058-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4574-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBExpress Ni Resin</td>
			<td>NewEngland BioLabs</td>
			<td>NEB #S1427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9208-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAMBIA1302</td>
			<td>Leiden University</td>
			<td>Gift from Prof. Paul Hooykaas</td>
			<td>pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 mL)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SunBlaster LED Strip Light 48 Inch&#160;</td>
			<td>SunBlaster</td>
			<td>210000000906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer&#160;</td>
			<td>BioTEK</td>
			<td>S4MLFPTA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>CAAAJ61714-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>T0181-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>TG217(G211)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12 (cyanocobalamin)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>89151-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>G0961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4382-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium tumefaciens-mediated genetic engineering of green microalgae, chlorella vulgaris

La transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) est un outil largement utilisé pour manipuler les génomes des plantes. Cependant, A. tumefaciens présente la capacité de transférer des gènes à un large éventail d’espèces. De nombreuses espèces de microalgues ne disposent pas de méthodes bien établies pour intégrer de manière fiable les gènes d’intérêt dans leur génome nucléaire. Pour exploiter les avantages potentiels de la biotechnologie des microalgues, des outils de manipulation du génome simples et efficaces sont essentiels. Dans ce document, un protocole AMT optimisé est présenté pour l’espèce de microalgue industrielle Chlorella vulgaris, en utilisant la protéine fluorescente verte rapporteuse (mGFP5) et le marqueur de résistance aux antibiotiques pour l’hygromycine B. Les mutants sont sélectionnés par placage sur un milieu de tris-acétate-phosphate (TAP) contenant de l’hygromycine B et du céfotaxime. L’expression de mGFP5 est quantifiée par fluorescence après plus de dix générations de sous-culture, ce qui indique la transformation stable de la cassette d’ADN-T. Ce protocole permet de générer de manière fiable plusieurs colonies transgéniques de C. vulgaris en moins de deux semaines, en utilisant le vecteur d’expression végétale pCAMBIA1302 disponible dans le commerce.

Agrobacterium tumefaciens, a gram-negative soil-borne bacterium, possesses a unique interkingdom gene transfer ability, earning it the title &#34;natural genetic engineer&#34;1. This bacterium can transfer DNA (T-DNA) from a tumor-inducing plasmid (Ti-Plasmid) into host cells through a Type IV secretion system, resulting in the integration and expression of the T-DNA within the host genome1,2,3,4. In the natural setting, this process leads to tumor formation in plants, commonly known as crown gall disease. However, Agrobacterium can also transfer T-DNA into various other organisms, including yeast, fungi, algae, sea urchin embryos, and even human cells under laboratory conditions5,6,7,8.
Exploiting this natural system, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) enables the random integration of gene(s) of interest into a host cell&#39;s nuclear genome by modifying the T-DNA region of the Ti-plasmid. For this purpose, a widely used AMT plant expression vector is pCAMBIA13029. Researchers can employ simple cloning workflows in E. coli before transferring the desired vector into A. tumefaciens for subsequent transfer to the host of interest.
Green microalgae are eukaryotes that share many similarities with land plants but are highly recalcitrant to genetic modification. However, genetic transformation plays a crucial role in both fundamental and biotechnological research of microalgae. In several microalgae species, particularly Chlamydomonas reinhardtii, genetic transformation via AMT has successfully introduced transgenes such as human interleukin-2 (hIL-2), the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 receptor-binding domain (SARS-CoV-2 RBD), and two antimicrobial peptides (AMPs)10,11,12,13. Among these, Chlorella vulgaris, a less fastidious and fast-growing green algae species, holds significant potential for the sustainable production of carbohydrates, proteins, nutraceuticals, pigments, and other high-value compounds14. However, the lack of reliable tools for creating transgenic strains of C. vulgaris hampers its commercial progress. Since there have been only a limited number of published works utilizing AMT in C. vulgaris15, and given the considerable differences between plant and microalgae cultivation, optimizing the AMT protocol becomes essential.
In this study, researchers inserted green fluorescent protein (mGFP5) downstream of the Cauliflower Mosaic Virus (CamV) 35S promoter and added a histidine tag to use it as a reporter gene for protein expression. Transformants were selected using Hygromycin B, and after subculturing for over twenty generations, the transformation remained stable. The pCAMBIA1302 plasmid employed in this work can be readily adapted to contain any gene of interest. Furthermore, the method and materials presented can be adjusted for other green algae species with an active CamV35S promoter, as this promoter is used for Hygromycin selection.

Pleins feux sur l’auteur : Protocole de transformation optimisé de Chlorella vulgaris à l’aide d’Agrobacterium tumefaciens 

Agrobacterium tumefaciens-Médié par le génie génétique des microalgues vertes, Chlorella vulgaris

The scope of the research focused on the development and optimization of a protocol for the transformation of chlorella vulgaris. We aimed to create a stable transgenic strains of chlorella vulgaris using agrobacterium tumefaciens and a specific plasmid, pCAMBIA1302, that allowed them to insert gene of interest and the potential for bio technological applications. Metabolic engineering and synthetic biology, microscopy and imaging, CRISPR-Cas9 gene editing, bioinformatics, computational modeling, remote sensing and satellite imaging, nanotechnology, bioprocessing, and downstream processing.This study introduces an optimized agrobacterium tumefaciens media transformation protocol for the microalgae chlorella vulgaris using a specific plasmid and marker. It lays groundwork for enhancing microalgae by technology, overcoming previous limitations in reliable transformation tools for C.vulgaris.

Pour montrer la réussite de la transformation à l’aide de la méthode ci-dessus, C. vulgaris a été cocultivé avec AGL-1 contenant le plasmide pCAMBIA1302 ou sans le plasmide (de type sauvage et plaqué sur gélose TAP complétée par de l’hygromycine B et du céfotaxime (Figure 1A). La plaque la plus à gauche montre les colonies transformées capables de se développer sur les plaques d’hygromycine B/céfotaxime, et la plaque du milieu montre que l’AGL-1 de type sauvag...

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Ce protocole décrit l’utilisation de la transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) pour intégrer le(s) gène(s) d’intérêt dans le génome nucléaire de la microalgue verte Chlorella vulgaris, conduisant à la production de transformants stables.

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit ...

Le champ de la recherche s’est concentré sur le développement et l’optimisation d’un protocole de transformation de la chlorella vulgaris. Nous avons cherché à créer une souche transgénique stable de chlorella vulgaris à l’aide d’Agrobacterium tumefaciens et d’un plasmide spécifique, pCAMBIA1302, qui leur a permis d’insérer un gène d’intérêt et le potentiel d’applications biotechnologiques. Ingénierie métabolique et biologie synthétique, microscopie et imagerie, édition de gènes CRISPR-Cas9, bioinformatique, modélisation informatique, télédétection et imagerie satellitaire, nanotechnologie, bioprocédés et traitement en aval.Cette étude présente un protocole optimisé de transformation du milieu d’Agrobacterium tumefaciens pour la microalgue chlorella vulgaris à l’aide d’un plasmide et d’un marqueur spécifiques. Il jette les bases de l’amélioration des microalgues par la technologie, en surmontant les limites précédentes des outils de transformation fiables pour C. vulgaris.

agrobacterium-tumefaciens-mediated-genetic-engineering-green

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris

2.2K vues.  University of Waterloo. Le champ de la recherche s’est concentré sur le développement et l’optimisation d’un protocole de transformation de la chlorella vulgaris. Nous avons cherché à créer une souche transgénique stable de chlorella vulgaris à l’aide d’Agrobacterium tumefaciens et d’un plasmide spécifique, pCAMBIA1302, qui leur a permis d’insérer un gène d’intérêt et le potentiel d’applications biotechnologiques. Ingénierie métabolique et biologie synthétique, microscopie et imageri...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Protocole de transformation optimisé de Chlorella vulgaris à l’aide d’Agrobacterium tumefaciens 

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit the capacity for gene transfer to a diverse array of species. Numerous microalgae species lack well-established methods for reliably integrating genes of interest into their nuclear genome. To harness the potential benefits of microalgal biotechnology, simple and efficient genome manipulation tools are crucial. Herein, an optimized AMT protocol is presented for the industrial microalgae species Chlorella vulgaris, utilizing the reporter green fluorescent protein (mGFP5) and the antibiotic resistance marker for Hygromycin B. Mutants are selected through plating on Tris-Acetate-Phosphate (TAP) media containing Hygromycin B and cefotaxime. Expression of mGFP5 is quantified via fluorescence after over ten generations of subculturing, indicating the stable transformation of the T-DNA cassette. This protocol allows for the reliable generation of multiple transgenic C. vulgaris colonies in under two weeks, employing the commercially available pCAMBIA1302 plant expression vector.

This protocol outlines the utilization of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) for integrating gene(s) of interest into the nuclear genome of the green microalgae Chlorella vulgaris, leading to the production of stable transformants.

Recherche

Bio-ingénierie

Preparation of Electrocompetent Agrobacterium tumefaciens Culture for Microalgal Genetic Engineering

Preparation of Electrocompetent  Agrobacterium tumefaciens  Culture for Microalgal Genetic Engineering  

Start by diluting 0.5 microliters of the overnight cultures of Agrobacterium tumefaciens culture with 50 milliliters of autoclaved ultrapure water. Spread 10 microliters of this diluted culture on a lysogeny broth or LB plate. Incubate the plate at 28 to 30 degrees Celsius for one to three days.Now, inoculate a single colony in 20 milliliters of LB media supplemented with rifampicin. Incubate the culture overnight at 28 to 30 degrees Celsius. The next day, inoculate 500 milliliters of plain LB media in a shaker flask with nine milliliters of overnight culture.Place the cultures on a shaker at 28 to 30 degrees Celsius. Following incubation and dividing the cultures into tubes, centrifuge the chilled tubes at four degrees Celsius and 4, 000 G for 15 minutes. Using a pipette, remove the supernatant and resuspend each pellet in 50 milliliters of ice cold water.After centrifuging and discarding the supernatant, resuspend the pellet in 25 milliliters of ice cold water in each tube. Centrifuge as before, then resuspend the pellet in one milliliter of ice cold 10%glycerol. Now, combine the contents of all the tubes into a single 50-milliliter tube before centrifuging.Finally, after discarding the supernatant, resuspend the pellet in 400 microliters of ice cold glycerol.

Préparation d’une culture électrocompétente d’Agrobacterium tumefaciens pour le génie génétique des microalgues

Electroporation of Agrobacterium tumefaciens for Genetic Engineering of Microalgal Cells

Electroporation of  Agrobacterium tumefaciens  for Genetic Engineering of Microalgal Cells  

Begin by adding 50 microliters of electrocompetent Agrobacterium tumefaciens cells into a pre-chilled 0.1-millimeter Q-vet. Add two microliters of pCAMBIA1302 to the Q-vet. now use an electroporator at 2, 400 volts to eelectroporate the cells.Immediately add one milliliter of LB media to the Q-vet and pipette the solution up and down to mix gently. Next, transfer the resuspended cells into a 1.5-milliliter microtube. Then incubate it at 24 to 30 degrees Celsius for a minimum of one hour to recover.Now plate the cells on antibiotic supplemented LB auger. Incubate the plates at 28 to 30 degrees Celsius for two to three days. Finally, inoculate a single colony in LB broth.Allow the culture to grow overnight. Then cryopreserve the plasmid-containing strain with a 50%glycerol solution at 80 degrees Celsius for future use.

Électroporation d’Agrobacterium tumefaciens pour le génie génétique de cellules de microalgues

Agrobacterium-Mediated Transformation of Chlorella vulgaris and Confirmation of Gene Integration via Colony PCR (cPCR)

Agrobacterium-Mediated Transformation of Chlorella vulgaris  and Confirmation of Gene Integration via Colony PCR (CPCR)  

Begin by pipetting out 0.5 milliliters of a log phase culture of chlorella vulgaris. Spread the culture on at Tris-Acetate-Phosphate or TAP Agar plate. Grow the culture for five days at 25 degrees Celsius.Next, inoculate 10 milliliters of supplemented LB broth with a loop full of electroporated agrobacterium tumefaciens culture in a shaker flask. Incubate the flask at 28 to 30 degrees Celsius and 250 RPM overnight. The next day, inoculate one milliliter of the overnight culture into 50 milliliters of supplemented LB.Incubate the flask at 28 to 30 degrees Celsius and 250 RPM.To co-cultivate the algal and bacterial cultures. First, transfer the agrobacterium culture into a 50 milliliter tube. Centrifuge the tube at 4, 000 G for 30 minutes at room temperature.Then, pipette out the supernatant to discard it and wash the cells twice using the induction medium. Next, add 25 milliliters of induction media onto the Chlorella Vulgaris culture plate. Transfer the cells into a 50 milliliter tube, then centrifuge at 4, 000 G for 15 minutes at room temperature.After disposing of the supernatant, combine the algal cell pellet with 200 microliters of the bacterial suspension. Shake the combined culture in a rotary incubator at 21 to 25 degrees Celsius, said at 150 RPM for one hour. Spread 200 microliters of the mixed culture onto induction medium plates, supplemented with 15 millimoles of glucose and incubate the plates in the dark at 21 to 25 degrees Celsius for three days.After three days, collect the microalgae into a flask using 10 milliliters of TAP media. Supplemented with 20 milligrams per liter of tetracycline. Incubate the flask in the dark for two days, maintaining a temperature between 21 to 25 degrees Celsius.Plate 500 microliters of the culture onto selective media supplemented with 20 milligrams per liter of tetracycline. Incubate the plates at 21 to 25 degrees Celsius in darkness for two days, before shifting them into an illuminated chamber. Select single colonies from the transformation plate and streak them onto TAP agar plates.To perform colony PCR, start by adding a small volume of the transformant algal cells to 10 microliters of sterile water. Boil the solution at 98 degrees Celsius for 15 minutes. Similarly process another PCR template for the confirmation of agrobacterium absence in the sample.Run the PCR samples on a DNA agarose gel with a ladder, to verify the size of the resulting fragments. Transformed colonies were able to grow on plates containing hygromycin with cefotaxime. The wild type colonies did not grow on the plates.Colonies resistant up to 70 milligrams per liter of cefotaxime were obtained. Colony PCR Amplicon of pCAMBIA1302 was absent in the algal samples. However MGFP5G in amplicon was detected in all three algal samples.Algal cultures that were repeatedly subcultures of Cefotaxime showed the absence of the virulence protein E2, indicative of plasmid absence. A significant difference in algal growth of the transformants and wild type strains were observed. Despite lower growth, the transformant had higher fluorescence levels when normalized for cell density.