Cette recherche a été financée en partie par la National Science Foundation (NSF 1227359), programme EPSCoR WVU financé par la National Science Foundation (EPS-1003907), bureau ADVANCE WVU parrainé par la National Science Foundation (1007978), et WVU PSCoR, respectivement. Les travaux de microfabrication a été fait dans WVU partagé des installations de recherche (équipements pour salles blanches) et de la recherche intégrative cellulaire microfluidique Laboratoire Chip (puce Lab) de l&#39;Université West Virginia. L&#39;imagerie confocale a été faite à WVU Imaging Facility de microscope.

1. Photolithographie Fabrication de Photoresist moule maître Le protocole suivant montre le processus pour fabriquer des microcanaux avec des diamètres compris entre 30-60 um. Pour obtenir un micro-canal avec un diamètre plus faible (inférieure à 30 pm), un seul dépôt par centrifugation de résine photosensible est nécessaire. <ol><li> Transférer la résine photosensible de refusion du réfrigérateur à 4 ° C à la salle blanche 24 heures avant de l&#39;utiliser et de le laisser se réchauffer à température ambiante. </li><li> Nettoyer une plaquette de silicium et faire cuire pendant une heure à 150 ° C pour lui permettre de se déshydrater. La déshydratation va aider l&#39;adhérence de résine photosensible sur le substrat de silicium. </li><li> Spin-couche de la première couche de résine photosensible en utilisant la formulation suivante: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Étape </td><td> Temps (en secondes) </td><td> Vitesse (rpm) </td><td> Accélération </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 &lt;/ Td&gt; <td> 300 </td><td> le plus haut </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 300 </td><td> le plus haut </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 60 </td><td> 600 </td><td> le plus haut </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td><td> 500 </td><td> le plus haut </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 600 </td><td> le plus haut </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Ensuite, cuire la plaquette sur une plaque chauffante à une température de 110 ° C pendant 90 sec. Après la cuisson douce de l&#39;épaisseur de la résine photosensible sera de 20 à 30 um. </li><li> Spin couche une seconde couche de résine photosensible suivant la même recette utilisée pour la première couche. </li><li> Doux cuire la galette à nouveau en le plaçant sur une plaque de cuisson avec une température de 110 ° C pendant 90 secondes. Après cette cuisson douce de l&#39;épaisseur de la résine photosensible sera de 40 à 60 um. </li><li> Générer les maîtres-modèles positifs en exposant le PhotoRESIST à la lumière UV avec une dose d&#39;exposition de 14 500 mJ / cm 2 à travers un masque de film. </li><li> Diluer le développeur avec déminéralisée (DI) de l&#39;eau (1:2 (v / v)). Rincer la plaquette à plusieurs reprises dans la solution jusqu&#39;à ce que le motif est complètement développée. Ensuite laver la plaquette avec de l&#39;eau DI et le sécher à l&#39;aide d&#39;azote gazeux. </li><li> Refusion: La place de la plaquette sur une plaque de cuisson avec une température de 120 ° C pendant 4 min et couvrir avec une boîte de Pétri en verre pour éviter l&#39;évaporation du solvant. Retirer la plaque de la plaque de cuisson et laisser refroidir à température ambiante. L&#39;épaisseur de résine photosensible après refusion sera 50-60 um. </li></ol> 2. Doux Lithographie Fabrication de PDMS Réseau Microchannel <ol><li> Préparer une solution de polydiméthylsiloxane (PDMS) sur le rapport en poids de 10:01 (base: agent de réticulation) et la mélanger à fond l&#39;aide d&#39;un malaxeur centrifuge planétaire. </li><li> Moulage la solution PDMS sur le moule maître de résine photosensible refondue. Placez le PDMS coulé dans un dessiccateur pendant 15 min pour dégazer. Utilisez de l&#39;azote gazeux pour éliminer les bulles restantes si nécessaire. </li><li> Cuire le PDMS dans un four à une température de 60 ° C pendant 3 heures pour lui permettre de guérir. Ensuite, retirer la couche de PDMS durci du moule maître. </li><li> Utilisation d&#39;un perforateur aiguisée pour créer d&#39;entrée / sortie par les trous des trous dans le réseau de canaux de perforation. Nettoyer la surface du PDMS en utilisant de l&#39;azote gazeux. </li><li> Traiter les deux couches PDMS avec un plasma d&#39;oxygène pendant 30 secondes à l&#39;intérieur d&#39;un filtre à plasma à une pression de service de 4,5 x 10 -2 Torr et d&#39;un débit d&#39;oxygène de 3,5 m 3 / min. Ensuite, aligner les surfaces du PDMS manuellement sous un microscope optique. Utilisez une goutte d&#39;eau si nécessaire pour un meilleur contrôle de l&#39;alignement. </li><li> Cuire le dispositif dans un four à 60 ° C pendant 30 min pour obtenir une liaison permanente. </li></ol> 3. Culture HUVEC et ensemencement dans la puce <ol><li> Culture des HUVECs avec un milieu de culture avec L-glutamine complété avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS). Pour èmee passages d&#39;expérience entre 2 et 5 ont été utilisés. </li><li> Une fois que les HUVEC sont confluentes, compter les cellules et les récolter en premier rinçage des cellules avec une solution saline tamponnée HEPES (HEPES-BSS), puis traiter les cellules avec de la trypsine / EDTA et incuber pendant 2-6 min à 37 ° C. Après le traitement à la trypsine est terminée, neutraliser la trypsine / EDTA avec une solution neutralisante trypsine. Centrifugeuse et les cellules en suspension dans un milieu de culture avec 8% de dextran pour les recueillir. Le dextran est utilisé pour augmenter la viscosité du milieu pour faciliter une meilleure ensemencement des cellules et d&#39;attachement. </li><li> Traiter le dispositif avec un plasma d&#39;oxygène pendant 5 min avec une pression de service de 4,5 x 10 -2 Torr et d&#39;un débit d&#39;oxygène de 3,5 m 3 / min. Puis charger l&#39;appareil avec de l&#39;eau DI et de traiter avec la lumière UV pendant 8 heures dans une hotte laminaire biosécurité pour la stérilisation. </li><li> Un jour avant que les cellules sont prêtes, laver l&#39;appareil avec 1x tampon phosphate salin (PBS 1x) puis les enrober avec la fibronectine (100 pg / ml, dilbué avec 1x PBS) et incuber dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Après le revêtement fibronectine, laver l&#39;appareil avec PBS 1x charger puis avec un milieu de culture. Incuber le dispositif à une température de 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Charger les cellules HUVEC dans un milieu de culture de 8% de dextran à une concentration de cellules de 10 6 cellules / ml 4.3 x. Placer une goutte de 20 pl de cellules à une entrée du dispositif et de l&#39;incliner pour introduire les cellules dans le canal microfluidique. Après 15 à 20 minutes, les cellules commencent à se fixer sur les parois latérales des canaux. Faites pivoter l&#39;appareil toutes les 15 minutes pour créer une distribution plus uniforme des cellules. Si nécessaire, une charge supplémentaire peut être effectuée. </li></ol> 4. Configuration de perfusion à long terme Après 5-6 h de culture statique, les HUVECs attachées vont commencer à se répandre pleinement. Mettre en place une perfusion à l&#39;aide d&#39;un système de pompe à seringue avec télécommande et un flux constant de 10 l / h. Perfusion peut être ajustée fou une vitesse d&#39;écoulement plus élevée, et qui peut durer pendant une période de temps entre 4 jours à 2 semaines. 5. coloration des cellules et caractérisation de microscope <ol><li> Lorsque les cellules atteignent la confluence intérieur de l&#39;appareil, d&#39;une part, laver l&#39;appareil avec 1x PBS pour éliminer complètement le milieu. Puis charger l&#39;appareil avec un colorant rouge dilué avec le diluant (4 pi-1 ml). Chargez le colorant similaire à la procédure de chargement de la cellule. Incuber le dispositif à l&#39;obscurité pendant 5 min à température ambiante, puis laver le dispositif à milieu de culture pour empêcher la formation de taches. Longue période d&#39;incubation de la teinture peut provoquer une toxicité cellulaire et disadhesion. </li><li> Chargez l&#39;appareil avec un colorant bleu dilué avec PBS 1x (2 gouttes par ml). Incuber dans l&#39;obscurité pendant 5 min à température ambiante, puis lavez soigneusement l&#39;appareil avec 1x PBS. </li><li> Examiner le marquage de cellules sous un microscope optique inversé. Si la coloration était bon, charger les microcanaux avec support de fixation (3,5% paraformaldéhyde dilué avec 1x PBS), puis plongezle dispositif de fixation à moyen et couvrir complètement avec du papier d&#39;aluminium. Stocker l&#39;appareil dans le réfrigérateur à une température de 4 ° C pour empêcher le dispositif de se dessécher et de photoblanchiment. Le dispositif fixe est maintenant prêt pour l&#39;imagerie confocale, ce qui peut être fait par un microscope confocal à balayage laser. </li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

<html> 1. Maître fabrication de moule L&#39;un des principes directeurs pour la conception et la morphométrie vasculaire est connue comme la loi de Murray 16, qui stipule que la distribution de diamètre des vaisseaux dans tout le réseau est régi par des considérations d&#39;énergie minimale. Il indique également que le cube des diamètres d&#39;un vaisseau mère à une bifurcation est égale à la somme des cubes des diamètres des vaisseaux fille ( <img alt="Équation 1" fo:c...

Microvaisseaux, comme une partie du système de circulation, la médiation des interactions entre le sang et les tissus, soutenir les activités métaboliques, définir microenvironnement tissulaire et jouent un rôle essentiel dans de nombreuses conditions pathologiques et de santé. Récapitulation des microvaisseaux fonctionnelles in vitro pourrait fournir une plate-forme pour l&#39;étude des phénomènes vasculaires complexes. Cependant, classique dans des essais microvaisseaux in vitro, tels que les tests endothéliales de cellules de migration, des tests de formation de tubes endothéliaux et des analyses d&#39;anneau aortique chez le rat et la souris, sont incapables de recréer in vivo microvaisseaux par rapport à trois dimensions géométrie (3D) et le contrôle de flux continu 1-8. Les études de microvaisseaux utilisant des modèles animaux et in vivo, comme test cornée de l&#39;angiogenèse, essai d&#39;angiogenèse de la membrane chorio poussin, et le dosage de Matrigel, sont plus de temps, un coût élevé, difficile en ce qui concerne l&#39;observation et quantifications, etsoulever des questions éthiques 1, 9-13. Les progrès de la microfabrication et technologies de puces microfluidiques ont permis à une variété de points de vue en sciences biomédicales tout en réduisant les coûts d&#39;expérimentation élevés et la complexité associés aux animaux et in vivo études 14, tels que les conditions biologiques contrôlées facilement et solidement et des environnements fluides dynamiques, qui n&#39;auraient pas été possible avec les techniques conventionnelles macroscopique. Ici, nous présentons une approche pour construire un endothélialisée microcanaux-on-a-chip qui imite la géométrie 3D in vivo microvaisseaux et fonctionne sous débit de perfusion continue contrôlée en utilisant la combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et la microfluidique.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflow Photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZP4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZ 400K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 131 Culture Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NacBlue Nuclei Staining</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH Red Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26 and PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffered Saline Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing Agent</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CGLDIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>BelArt Products</td>
			<td>999320237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Biosafety Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary Centrifugal Mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-246-516GAQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Invertoskop 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne Cimarec</td>
			<td>SP131635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure for the development of multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip

Des efforts ont été concentrés sur le développement des essais in vitro pour l&#39;étude des micro-vaisseaux parce que in vivo les études animales sont plus chronophage, coûteux, et l&#39;observation et la quantification sont très difficiles. Cependant, classique dans des essais in vitro microvaisseaux ont des limites lorsqu&#39;il s&#39;agit de représenter in vivo microvaisseaux par rapport à la géométrie en trois dimensions (3D) et fournir un flux continu de fluide. En utilisant une combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et microfluidique, nous avons développé une multi-profondeur endothélialisées transversales circulaires microcanaux-on-a-chip, qui imite la géométrie 3D in vivo microvaisseaux et fonctionne sous perfusion continue contrôlée écoulement. Une résine photosensible refusionnable positif a été utilisé pour fabriquer un moule maître à un réseau de microcanaux de section transversale semi-circulaire. Par l&#39;alignement et le collage des deux (PDMS) microcanaux polydiméthylsiloxane replicated du moule maître, un réseau de micro-canal cylindrique a été créé. Les diamètres des microcanaux peuvent être bien contrôlés. De plus, la veine ombilicale cellules endothéliales humaines primaires (HUVEC) ensemencées à l&#39;intérieur de la puce ont montré que les cellules alignées de la surface intérieure des micro-canaux sous perfusion contrôlée durant pendant une période de temps entre 4 jours à 2 semaines.

Notre méthode pour fabriquer le réseau de microcanaux à plusieurs profondeur imite les géométries 3D complexes in vivo des microvaisseaux, dans lequel les micro-canaux ont des sections transversales arrondies 15. En outre, les diamètres des parents canaux de dérivation et les canaux de fille d&#39;environ obéissent à la loi de Murray pour le maintien de l&#39;écoulement du fluide à un niveau requis de sorte que la résistance globale du canal est faible et les vitesses d&#39;écoulement so...

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Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Une plate-forme microcanaux-on-a-chip a été développé par la combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et la microfluidique. La plate-forme de micro-canaux endothélialisée imite la géométrie en trois dimensions (3D) des microvaisseaux in vivo, fonctionne sous débit de perfusion continue contrôlée, permet l&#39;imagerie de haute qualité et en temps réel et peut être appliqué pour la recherche microvasculaire.

Procédure à suivre pour le développement de la multi-profondeur circulaire transversale endothélialisées microcanaux-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K vues.  West Virginia University.  Une plate-forme microcanaux-on-a-chip a été développé par la combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et la microfluidique. La plate-forme de micro-canaux endothélialisée imite la géométrie en trois dimensions (3D) des microvaisseaux in vivo, fonctionne sous débit de perfusion continue contrôlée, permet l'imagerie de haute qualité et en temps réel et peut être appliqué pour la re...

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Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Procédure pour l&#39;ingénierie du poumon

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Recherche

Bio-ingénierie

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Microfluidique endothélialisée pour étudier les interactions microvasculaires dans Hémopathies

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based whole organ decellularization has recently gained interest in the field of tissue engineering as a means to create site-specific extracellular matrix scaffolds, while largely preserving the native architecture of the scaffold. To date, this approach has been utilized in a variety of organ systems, including the heart, lung, and liver 1-5. Previous decellularization methods for tissues without an easily accessible vascular network have relied upon prolonged exposure of tissue to solutions of detergents, acids, or enzymatic treatments as a means to remove the cellular and nuclear components from the surrounding extracellular environment6-8. However, the effectiveness of these methods hinged upon the ability of the solutions to permeate the tissue via diffusion. In contrast, perfusion of organs through the natural vascular system effectively reduced the diffusion distance and facilitated transport of decellularization agents into the tissue and cellular components out of the tissue. Herein, we describe a method to fully decellularize an intact porcine heart through coronary retrograde perfusion. The protocol yielded a fully decellularized cardiac extracellular matrix (c-ECM) scaffold with the three-dimensional structure of the heart intact. Our method used a series of enzymes, detergents, and acids coupled with hypertonic and hypotonic rinses to aid in the lysis and removal of cells. The protocol used a Trypsin solution to detach cells from the matrix followed by Triton X-100 and sodium deoxycholate solutions to aid in removal of cellular material. The described protocol also uses perfusion speeds of greater than 2 L/min for extended periods of time. The high flow rate, coupled with solution changes allowed transport of agents to the tissue without contamination of cellular debris and ensured effective rinsing of the tissue. The described method removed all nuclear material from native porcine cardiac tissue, creating a site-specific cardiac ECM scaffold that can be used for a variety of applications.

A method to rapidly and completely remove cellular components from an intact porcine heart through retrograde perfusion is described. This method yields a site specific cardiac extracellular matrix scaffold which has the potential for use in multiple clinical applications.

Procédure de décellularisation de coeur de porc par perfusion coronaire rétrograde

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Méthodes de caractérisation de la Co-développement de biofilms et Habitat Hétérogénéité

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Solide Lipid nanoparticules (SLN) Applications pour le ciblage intracellulaire

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Caractérisation qualitative de la fraction aqueuse de hydrothermale Liquéfaction d&#39;algues Utilisation 2D chromatographie en phase gazeuse avec le temps de vol Spectrométrie de masse

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Développement d&#39;un modèle organotypique multicellulaire en trois dimensions de la muqueuse intestinale humaine Grown Sous microgravité

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Montage et suivi du développement de la communauté microbienne dans une plateforme de microwell Array

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the adhesive cure, and the effect of adhesive penetration on the wood interphase; thus, normal testing of a neat adhesive film is generally not useful. Most tests of wood adhesive bond strength are slow, laborious, can be strongly influenced by the wood and do not provide information on the kinetics of cure. Test method ASTM D 7998-19, however, can be used for fast evaluation of the strength of wood bonds. The use of a smooth, uniform, and strong wood surface, like maple face-veneer, and sufficient bonding pressure reduces the adhesion and wood strength effects on bond strength. This method has three main applications. The first is to provide consistent data on bond strength development. The second is to measure the dry and wet strengths of bonded lap shear samples. The third is to better understand the adhesive heat resistance by quickly evaluating thermal sensitivity and distinguishing between thermal softening and thermal degradation.

We present a procedure, ASTM D7998-19, for a rapid and more consistent evaluation of both dry and wet strength of adhesive bonds on wood. The method can also be used to provide information on strength development as a function of temperature and time or strength retention up to 250 &#176;C.

Méthode d’essai normalisée ASTM D 7998-19 pour le développement de la résistance à la cohésion des adhésifs pour bois

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and size distribution of nanoparticles is of utmost importance for various applications. The size range is also important, as it defines the most &#8220;active&#8221; component of a nanoparticle dose.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is a powerful technique for sizing of particles in suspension in the size range of approximately 1&#8211;1000 nm. There are several ways to derive size information from an AF4 experiment. Besides coupling AF4 online with size-sensitive detectors based on the principles of Multi-Angle Light Scattering or Dynamic Light Scattering, there is also the possibility to correlate the size of a sample with its retention time using a well-established theoretical approach (FFF theory) or by comparing it with the retention times of well-defined particle size standards (external size calibration).
We here describe the development and in-house validation of a standard operating procedure (SOP) for sizing of an unknown gold nanoparticle sample by AF4 coupled with UV-vis detection using external size calibration with gold nanoparticle standards in the size range of 20&#8211;100 nm. This procedure provides a detailed description of the developed workflow including sample preparation, AF4 instrument setup and qualification, AF4 method development and fractionation of the unknown gold nanoparticle sample, as well as the correlation of the obtained results with the established external size calibration. The SOP described here was eventually successfully validated in the frame of an interlaboratory comparison study highlighting the excellent robustness and reliability of AF4 for sizing of nanoparticulate samples in suspension.

This protocol describes the use of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with UV-vis detection for the determination of the size of an unknown gold nanoparticle sample.

Fractionnement asymétrique de flux de champ-flux pour le dimensionnement des nanoparticules d’or dans la suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...