Cette recherche a été financée par les projets européens GRACIOUS (GA760840) et SUNSHINE (GA952924). Les auteurs tiennent également à souligner les efforts de tous ceux qui, d’une manière ou d’une autre, ont contribué à l’élaboration de ce protocole.

REMARQUE : Le protocole suivant a été conçu pour pouvoir être utilisé conjointement avec un dosage de la protéine de l’acide bicinchoninique (BCA) et un dosage de l’adénylate kinase (AK) pour normaliser les échantillons aux traitements. Assurez-vous que l’opérateur porte une tenue appropriée et l’équipement de sécurité nécessaire, comme une blouse de laboratoire Howie, des gants en nitrile et des lunettes de sécurité de classe I, tout au long de la préparation et de l’utilisation des matériaux. Le protocole est divisé en plusieurs étapes.
1. Préparation des stocks et des solutions de travail
<ol><li>Préparer des solutions mères d’étalon de 100 mM de GSH dans 1 mM de HCl (préparées à partir de 37 % de HCl dans de l’eau doublement distillée (ddH2O)). REMARQUE : En cas de dilution à partir d’un acide hautement concentré, tel que 37% HCl, assurez-vous du processus correct d’ajout d’acide à l’eau dans une hotte de classe I.</li>
	<li>Préparer un stock de 22,35 mM d’OPA en éthanol absolu. Effectuez cette étape dans une hotte de classe I. Préparez 25 mM de N-éthylmaléimide (NEM) dans du ddH2O. Effectuez cette étape dans une hotte de classe I. REMARQUE : Ces trois solutions peuvent être conservées à -20 °C jusqu’à 3 mois.</li>
	<li>Préparer 0,01 M de tris(2-carboxyéthyl) phosphine (PTCE) jusqu’à un volume total de 500 μL, nécessaire pour 100 puits. Préparer 100 μL d’étalon de 1 mM de GSH, dilué à partir d’un échantillon de 100 mM à l’aide de jdH2O.</li>
	<li>Utiliser soit un tampon de lyse par immunoprécipitation (IP), soit la formulation suivante : 394 mg de Tris-HCl (concentration finale de 25 mM), 877 mg de NaCl (concentration finale de 150 mM), 29 mg d’EDTA (concentration finale de 1 mM), soit 1 mL de NP-40 à 100 % ou d’IGEPAL CA-630 (concentration finale de 1 % V/V), 5 mL de glycérol (concentration finale de 5 % V/V), 84 mL de ddH2O. Mélanger les composants en agitant doucement et ajuster le pH à 7,4. Transvaser dans une fiole jaugée de 100 mL et ajouter le volume restant de ddH2O pour atteindre un volume final de 100 mL. Filtrer stérilement à travers un filtre de 0,22 μm et conserver à une température de 2 à 8 °C jusqu’à 6 mois. REMARQUE : Les solutions de lyse agissent comme un contaminant/interférent dans cet essai ; Par conséquent, les formulations ci-dessus sont spécifiées.</li>
	<li>Préparez 1 L de solution saline tamponnée au phosphate 0,1 M complétée par de l’acide éthylènediamine tétraacétique (PBS-EDTA) à 3 valeurs de pH différentes, à savoir 7,2, 8,5 et 9,0. Utiliser un tampon PBS commercial de 0,1 M complété par 1 mM d’EDTA (292,24 mg/L) ou la formulation 10x (1 L) suivante : 80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4, 800 mL de ddH2O. Ajouter et mélanger ; Complétez jusqu’à 1 L. Autoclavez la solution pour la stérilité et conservez-la pendant 12 mois à température ambiante. À partir de la solution mère 10x, préparez une solution de travail de PBS et complétez-la avec de l’EDTA (concentration comme indiqué précédemment). REMARQUE : Le pH est d’une importance cruciale ; assurez-vous que le pH est précis avant de commencer le protocole.</li>
	<li>Effectuer une dilution en série 1:2 de 1 mM de GSH à l’aide de ddH2O (1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM, 31,25 μM, 15,625 μM et 7,8125 μM). Ajouter 10 μL de chaque concentration dans les puits étalons (effectué en double). Les échantillons seront dilués dans un tampon de lyse ; par conséquent, les concentrations seront de 1/5e de leur concentration initiale par la suite (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625 μM). REMARQUE : Les concentrations finales pour l’étalonnage seront de 30 μm, 15 μm, 7,5 μm, 3,75 μm, 1,875 μm, 937,5 nm, 468,8 nm et 234,4 nm.</li>
</ol>2. Préparation du dosage
REMARQUE : Ce protocole utilise des lignées cellulaires humaines HepG2, A549 et J774, qui ont été achetées commercialement auprès de l’ATCC. Ces lignées cellulaires ont été utilisées conformément aux lignes directrices approuvées décrites dans les lois et règlements sur la culture animale et tissulaire de l’Université.
<ol><li>24 h avant le début de l’essai, les cellules de semence aux concentrations indiquées au tableau 1 ; Cependant, en fonction de la lignée cellulaire/du type de cellule et du traitement utilisé, ajustez la densité au besoin. Cultivez des cellules dans un milieu de croissance complet (milieu essentiel modifié Eagles (EMEM) avec 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (HIFS), 1 % de Penstrep (10 000 U/mL de pénicilline/10 mg/mL de streptomycine) et 1 % d’acides aminés non essentiels.</li>
	<li>Cellules d’ensemencement à l’aide de méthodes d’ensemencement cellulaire conventionnelles32. Cellules germées dans des plaques entièrement noires si elles n’utilisent pas la microscopie post-essai. Évaluer la confluence et l’état général des cellules dans le ballon T75 avant de les utiliser par microscopie.</li>
	<li>Dans une enceinte de sécurité biologique propre et stérile de classe II et en suivant une technique d’asepsie stricte, jeter les milieux cellulaires, laver délicatement les cellules avec ~15 mL de PBS stérile à température ambiante (RT) et jeter.</li>
	<li>Dans la fiole cellulaire, ajouter 5 mL de trypsine 1x stérile, secouer doucement pour assurer la couverture de la monocouche cellulaire et placer dans un incubateur à 37 °C pendant 5 minutes pour faciliter le détachement des cellules.</li>
	<li>Arrêter la trypsinisation par l’ajout d’un milieu de croissance contenant du sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (10 %), environ 10 mL.</li>
	<li>Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de 50 mL et granuler à 200 x g pendant 5 min. Jetez le support et remplacez-le par 5 mL du même support. Remettre les cellules en suspension dans le tube jusqu’à ce qu’elles soient homogènes et qu’il n’y ait plus d’agglutination.</li>
	<li>Retirer 20 μL de suspension cellulaire et les placer dans un hémocytomètre pour le comptage. Une fois que le nombre de cellules nécessaires a été calculé, effectuez une dilution pour obtenir une solution avec la bonne densité cellulaire.</li>
	<li>Supports de pipette contenant des cellules en plaques de 96 puits (capacité de 350 μL), avec un volume maximal de 200 μL par puits. Placez les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h pour qu’elles adhèrent à la surface de la plaque.</li>
	<li>Pour évaluer à la fois le glutathion total et le GSSG, traitez des échantillons pour les deux affections. Ensemencer et traiter 6 puits pour fournir 2 ensembles de GSH et de GSSG avec 3 répétitions techniques (la figure 1 montre la disposition).</li>
	<li>S’assurer que tous les réactifs sont préparés de manière appropriée avant le début de l’essai ; s’assurer que tous les composants et réactifs du tampon sont à la RT avant de commencer la construction des tampons ou l’utilisation dans l’essai, à l’exception du PBS à pH 7,4 (sans EDTA), qui doit être conservé sur de la glace ou réfrigéré jusqu’à l’utilisation. REMARQUE : Il est d’une importance cruciale que la formation de bulles soit limitée au minimum pour permettre aux réactions souhaitées de se produire dans le test et permettre une quantification précise via le lecteur de plaques.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lignée cellulaire</td>
			<td>Densité de semis (plaque de 96 puits)</td>
		</tr><tr><td>HepG2</td>
			<td>10 000 cellules / puits</td>
		</tr><tr><td>A549</td>
			<td>5 000 cellules / puits</td>
		</tr><tr><td>J774</td>
			<td>10 000 cellules / puits</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Densités d’ensemencement suggérées pour les lignées cellulaires choisies. Des densités d’ensemencement différentes ont été démontrées pour trois lignées cellulaires différentes utilisées dans les données représentées, à savoir A549, J774 et HepG2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66267/66267fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma proposé pour l’ensemencement de 96 plaques de puits pour la détermination simultanée du glutathion total et du disulfure de glutathion. Des puits pour l’étalonnage et les contrôles sont également présentés. Les puits qui ne sont pas utilisés sont représentés par une croix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/66267fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
3. Traitement des nanomatériaux
<ol><li>Pesez les nanomatériaux (en particulier le ZnO, le TiO2, le CuO et l’Ag) dans une balance capable de μg. Effectuer un calcul pour atteindre une concentration initiale de 1 mg/mL par nanomatériau.</li>
	<li>Transférer des solutions de nanomatériaux dans un sonicateur et du sonicate pendant 16 min à l’aide d’un bain de sonication (38 W) pour produire une solution homogène. Effectuer une série de dilutions pour chaque nanomatériau à 125, 62,5, 31,25, 15,625 μg/mL.</li>
	<li>Retirez les cellules de l’incubateur et lavez-les légèrement avec RT PBS. Après s’être assuré que tout le PBS a été éliminé, ajouter 100 μL de traitements dans la plaque, avec des témoins (milieux de culture sans HIFS). Après l’application du traitement sur les cellules, incuber avec les nanomatériaux dans un incubateur à 37°C (5% de CO2) pendant 4 h ; ensuite, utilisez le protocole ci-dessous pour quantifier le GSH : GSSG, concentration en protéines et libération d’AK.</li>
</ol>4. Protocole d’analyse
<ol><li>Après l’exposition au traitement (Figure 2A), évaluer la viabilité par l’activité de l’adénylate kinase (AK) (facultatif). Utilisez un kit commercial pour ce test en suivant les instructions du fabricant.</li>
	<li>Tourner les plaques dans une centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min pour granuler légèrement le traitement et les débris cellulaires (figure 2B).</li>
	<li>Retirer doucement 20 μL de surnageant de milieu de chaque échantillon et puits témoin (comme indiqué ci-dessus) et pipeter dans une plaque blanche adjacente à 96 puits dans le même format de disposition (figure 2C).</li>
	<li>Ajoutez 100 μL de solution de travail du kit AK dans chaque puits, protégez la plaque de la lumière et laissez agir pendant 10 min à température ambiante. Enregistrez la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques à 1000 comptes/s.</li>
	<li>Pour les étalons de GSH, ajouter 40 μL de tampon de glutathion total dans chaque puits (figure 2D ; facultatif, requis pour la quantification).</li>
	<li>Aspirer le reste du milieu de la plaque et laver 3 fois avec du PBS 0,1 M glacé, pH 7,2, en jetant chaque lavage (figure 2E) à l’exception des étalons. Laissez le lavage final dans la plaque jusqu’à ce que l’étalonnage GSH ait été chargé dans la plaque.</li>
	<li>Ajouter 10 μL de chaque concentration de glutathion et blanc (ddH2O) dans les puits en trois exemplaires.</li>
	<li>Retirer le lavage final du PBS et ajouter les mélanges dans chaque puits conformément au tableau 2 pour la quantification cible souhaitée (figure 2E). Calculez les volumes requis avant de commencer cette étape en raison d’une perte d’activité urgente avec des tampons complets. Assurez-vous que ces mélanges de réactifs sont préparés avant de commencer le processus de test, mais ne les laissez pas reposer plus de 30 minutes avant de les utiliser.</li>
	<li>Placez-le sur un agitateur de plaque orbitale et laissez la plaque trembler à 300 tr/min pendant 2 min (Figure 2F).</li>
	<li>Retirer de l’agitateur et ajouter 5 μL de solution de PTCE 0,01 M dans chaque puits, à l’exclusion du puits de contrôle NEM. Remettez la plaque dans l’agitateur et laissez incuber pendant 10 min (Figure 2F).</li>
	<li>Transférer la plaque dans la centrifugeuse et tourner à 200 x g pendant 5 min. Transférer 25 μL de chaque puits d’échantillon dans une autre plaque de 96 puits (transparente) ; Celui-ci sera utilisé pour la concentration en protéines (voir étape 4.15 ; Figure 2G). Ne transférez pas d’étalons ou de contrôles d’essai.</li>
	<li>S’assurer que le volume final de chaque puits est de 30 μL ; retirer le volume des contrôles et des normes pour répondre à cette exigence (figure 2H).</li>
	<li>Ajouter 170 μL de solution d’OPA fonctionnelle dans chaque puits, protéger la plaque de la lumière et placer sur un agitateur pendant 15 minutes (figure 2I).</li>
	<li>Lire la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques à Ex340/Em450 (Figure 2J). S’assurer qu’il n’y a pas de bulles pendant l’étape de mesure ; Ils auront un impact néfaste à la fois sur la réaction et sur la quantification via le lecteur de plaques.</li>
	<li>Pour quantifier la teneur en protéines des cellules lysées, utilisez un kit de dosage BCA commercial. Transférez les échantillons prélevés à l’étape 4.12 sur une nouvelle plaque de 96 puits (transparente) à 25 μL par puits.</li>
	<li>Utiliser un étalon d’albumine sérique bovine (BSA) dilué dans un tampon de lyse IP et l’ajouter à la plaque en trois exemplaires à raison de 25 μL par puits. Les concentrations exactes sont définies dans le protocole du kit BCA.</li>
	<li>Préparez une solution de travail composée d’un rapport de 50:1 des réactifs A et B de la trousse BCA et ajoutez 200 μL à chaque puits contenant l’échantillon, l’étalon et le témoin. Protégez les plaques de la lumière et incubez à 37 °C pendant 30 min (Figure 2K).</li>
	<li>Retirer les échantillons de l’incubateur, laisser équilibrer à température ambiante pendant 5 min, puis lire l’absorbance via un lecteur de plaque à 562 nm (Figure 2L).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Concentration totale de glutathion mélange de réactifs de lyse</td>
		</tr><tr><td>Composant</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>Tampon de lyse</td>
			<td>50μL</td>
		</tr><tr><td>Volume total / puits</td>
			<td>50μL</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Mélange de réactifs de lyse de concentration de glutathion oxydé</td>
		</tr><tr><td>Composant</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>Tampon de lyse</td>
			<td>49,5 μL</td>
		</tr><tr><td>NEM (25 mM)</td>
			<td>0,5 μL</td>
		</tr><tr><td>Volume total / puits</td>
			<td>50μL</td>
		</tr><tr><td colspan="2">UTILISEZ LES DEUX SOLUTIONS DANS LES 30 MINUTES SUIVANT LA COMPOSITION DU MÉLANGE</td>
		</tr><tr><td>Composant de la solution de détection OPA</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>OPA 3mg/mL</td>
			<td>5μL</td>
		</tr><tr><td>PBS (pH 9,0)</td>
			<td>165μL</td>
		</tr><tr><td>Volume total / puits</td>
			<td>170μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Volumes de réactifs nécessaires à l’exécution du protocole. Volumes requis par puits pour la détermination du glutathion total, du disulfure de glutathion et du réactif de travail. Assurez-vous que les volumes requis sont calculés et qu’un excédent est inclus pour tenir compte de la perte de volume par transfert.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66267/66267fig02.jpg"> Figure 2 : Représentation schématique du protocole. (A) Ensemencement initial, incubation et traitement des cellules. (B) Centrifugation pour séparer les fluides des solides en suspension. (C) Transfert de milieu pour le dosage de l’adénylate kinase. (D) Ajout des concentrations de glutathion pour la plage d’étalonnage. (E) Étapes de lavage et ajout de réactifs de lyse. (F) Ajout de tampon et ajout de tris(2-carboxyéthyl) phosphine avec étape d’agitation. (G) Centrifugation de cellules lysées pour l’élimination des milieux pour l’analyse des protéines. (H) Retrait du support pour égaliser le volume sur la plaque. (I) Addition d’une solution de travail d’ortho-phtalaldéhyde avec incubation par agitation. (J) Mesure de la fluorescence de l’ortho-phtalaldéhyde par lecteur de plaques. (K) Étapes d’incubation pour le dosage de l’acide bicinchoninique pour la détermination des protéines. (L) Mesure de la concentration protéique, permettant la normalisation des valeurs de glutathion : disulfure de glutathion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/66267fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Mesure GSH/GSSG – Un test OPA raffiné pour la recherche sur les antioxydants

<ol>
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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Comme indiqué, la nécessité de comprendre l’oxydoréduction cellulaire, de surveiller les états de stress oxydatif et la réponse antioxydante a toujours été cruciale pour comprendre et prévenir une myriade de maladies, telles que les cancers et la neurodégénérescence33,34. Il s’agit d’un moyen d’améliorer le paysage translationnel en augmentant l’accessibilité d’une détection précise de GSH : GSSG avec une préparation rapide et minimale.
Ce protocole démontre une séquence multiparamétrique de tests pour la détermination des espèces intracellulaires de glutathion/thiol (réduites et oxydées), avec 2 moyens de normalisation par dosage des protéines BCA et/ou dosage AK. Ce test peut également être modifié pour détecter divers autres marqueurs lors de l’étape initiale d’extraction du médiateur et peut être simplifié de manière à donner simplement un rapport thiol oxydé/réduit à l’exclusion de la plage d’étalonnage.
Lors de l’évaluation des analytes, les mBCI et les OPA ont été explorés et comparés pour leur utilisation. Bien que le mBCl ait initialement démontré un bon potentiel de signal, des limites importantes dans son utilisation ont été découvertes. Principalement, l’utilisation de cellules vivantes démontre la meilleure utilisation du mBCl ; cependant, après la lyse cellulaire, le signal s’est avéré éteint et est généralement diminué dans un format multipuits par rapport à l’OPA35. Un autre problème est la mesure du GSSG via mBCl, la littérature est rare à ce sujet, et grâce à l’optimisation / exploration du protocole, la détection précise du GSSG à travers mBCl n’a pas été obtenue.
Nous avons démontré que le test OPA présente des plages d’étalonnage significativement fiables, avec une moyenne R2 de 0,9932 ± 0,007 (N = 12) sur une plage de concentration de GSH de 0,234 à 30 μM. Cette fourchette a été choisie en raison des fourchettes de référence précédentes trouvées dans la littérature35. Il est théoriquement possible de détecter le glutathion en dehors de ces plages, mais il faudra modifier la concentration des réactifs, le temps d’incubation et éventuellement l’équipement utilisé pour la détection. Il convient de noter que chaque plaque nécessite sa propre plage standard pour la quantification ; La moindre variation de temps entre les plaques effectuée à des jours différents peut avoir un effet significatif sur les valeurs obtenues lors de la mesure.
L’obtention de données précises et fiables à partir de ce protocole dépend du strict respect de plusieurs étapes cruciales. Lors de la construction des différents tampons requis dans le protocole, il est crucial que le pH soit précis. Par conséquent, les tampons nécessitant un pH de 9 ne doivent pas présenter d’écart supérieur à ± 0,1 de cette valeur. Cela est dû au fait que les composants tampons peuvent précipiter hors de la solution dans un pH incorrect ; En suivant exactement ce protocole, vous éviterez ce problème.
L’élimination complète du traitement et un lavage précis avant la lyse sont également essentiels pour éviter les artefacts et l’acquisition de données inexactes pendant l’étape de lecture des plaques. Une fois que les cellules ont été lysées (étape 4.8), l’élimination du traitement n’est pas possible et la plaque ne sera pas récupérable. En raison des volumes de tampons/réactifs ajoutés tout au long du protocole variant entre les échantillons et les étalons, il est essentiel que l’utilisateur soit conscient des volumes variés, aux étapes 4.12 et 4.13. L’opérateur de test est également informé de ces volumes variés et doit s’assurer que tous les volumes sont identiques afin de permettre une mesure précise. Comme les volumes entre les échantillons et les étalons ne sont pas visiblement significatifs, il peut être facile de commettre une erreur en ce qui concerne la présence d’un excès de solution dans le puits de l’échantillon.
Ce protocole comporte des limites qui reposent sur des étapes cruciales, qui sont essentielles à l’acquisition de données précises et fiables. Les utilisateurs qui effectuent ce test doivent posséder un niveau raisonnable de compétences en laboratoire pour éviter des problèmes indésirables, tels que la formation de bulles. La formation de bulles a un impact drastique à la fois sur la capacité des réactions à se produire dans la microplaque et sur la mesure de la fluorescence. L’agent de lyse utilisé dans ce protocole contient un détergent, ce qui présente des difficultés pour un chercheur novice qui peut avoir du mal à empêcher la formation de bulles. Une centrifugation immédiate peut sauver cette erreur. Le protocole est également potentiellement limité en ce qui concerne le type de cellule ; les lignées cellulaires A549, J774 et HepG2 ont été utilisées pour optimiser et produire des données pour ce protocole. D’autres lignées cellulaires peuvent nécessiter des densités d’ensemencement différentes et une optimisation du protocole pour obtenir des données précises.
Ce protocole offre de nombreux avantages par rapport à plusieurs tests existants. Bien que la détection des thiols à l’aide de phtalaldéhyde ne soit pas un concept nouveau, l’utilisation dans un format d’essai combiné comme celui-ci, dans une microplaque, avec des matériaux et un équipement limités requis, offre un grand potentiel pour tous les laboratoires d’accéder à ce protocole. La plupart des kits Thiol/GSH des fournisseurs commerciaux ne divulguent pas la composition de leurs réactifs. Par conséquent, il peut être difficile de prévoir le potentiel d’incompatibilités/interférences. Ici, nous présentons chaque composant de tous les réactifs utilisés pour limiter ce potentiel.
Ce protocole est également exécuté assez rapidement à la fin de la période de traitement initiale. En tenant compte du traitement par l’utilisateur entre les étapes d’incubation, l’aspect quantification des thiols de ce protocole peut être effectué en moins de 1 h. Les échantillons sont simultanément lysés et liés pour empêcher l’auto-oxydation des échantillons, ce qui est optimal pour ces espèces réactionnelles. Bien que cela ne soit pas spécifié dans le protocole, les échantillons peuvent techniquement être lysés dans une plaque et scellés, ce qui permet de les congeler pour une analyse future. Cependant, cette modification du protocole n’a pas été explorée.

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont l’un des principaux inducteurs du stress oxydatif. Le stress oxydatif a été bien établi dans la génération de mutations de l’ADN, le vieillissement / la mort cellulaire, divers cancers, le diabète, les maladies neurologiques (telles que Parkinson et Alzheimer) et plusieurs autres conditions débilitantes de la vie 1,2,3,4,5. Les antioxydants thioliques non enzymatiques, capables de réduire les oxydants ou les radicaux en agissant comme donneurs de protons, constituent une défense clé contre les ROS 6,7. Le glutathion (GSH) et la cystéine sont les deux thiols les plus répandus chez les mammifères8, tandis qu’il existe divers autres thiols de faible poids moléculaire (tels que l’ergothionéine), le GSH et la cystéine sont les antioxydants non enzymatiques les plus couramment mesurés dans la littérature 9,10,11 et sont les plus pertinents pour lutter contre les ROS 8,12,13,14.
Lorsque le GSH est utilisé comme antioxydant, deux molécules de GSH sont liées de manière covalente par une liaison disulfure pour former du disulfure de glutathion (GSSG). L’épuisement du GSH est souvent utilisé comme indicateur de stress oxydatif 15,16. Cette évaluation peut également être combinée à la détection du GSSG, bien que les augmentations du GSSG dans les cellules soient souvent limitées par des processus d’exportation actifs, car le GSSG peut être relativement réactif dans les cellules, conduisant à la formation de liaisons disulfure avec d’autres thiols protéiques16.
Les méthodes traditionnelles de mesure du GSH et du GSSG ne sont pas des processus simples et nécessitent de nombreuses étapes, y compris l’extraction cellulaire à l’aide de réactifs lytiques17,18. Le protocole décrit ici simplifie ces méthodes et permet la mesure précise des thiols non enzymatiques et la normalisation à l’aide de la teneur en protéines cellulaires ou de la libération d’adénylate kinase. De plus, il est possible de mesurer la viabilité cellulaire avant l’extraction du GSH/GSSG. Plusieurs méthodes ont déjà tenté de cibler et de quantifier efficacement les thiols non enzymatiques réduits et oxydés ; méthodes comprenant l’utilisation de la HPLC 19,20,21, le dosage sur plaque (biochimique)22,23,24,25, et qui utilisent des réactifs courants pour la conjugaison des thiols, tels que le 5,5-dithio-bis-(acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB/réactif d’Ellman)19, le monochlorobimane (mBCI)26,27,28. Plusieurs entreprises ont également préparé des kits exclusifs pour la détection du glutathion ; Cependant, ils ne publient pas les incompatibilités de réactifs, ce qui pose des problèmes dépendants des traitements utilisés29.
Ce protocole décrit un test multiparamétrique qui détecte les thiols réduits (tels que le GSH) via la conjugaison ortho-phtalaldéhyde (OPA) pour produire un signal fluorescent détectable à 340/450 Ex/Em, respectivement. Ce dosage facilite la détection simultanée du GSH et du GSSG (dans la plaque), grâce à l’utilisation d’agents masquants (N-éthylmaléimide) et d’agents réducteurs du GSSG (tris(2-carboxyéthyl)phosphine). Ce protocole multi-biomarqueurs offre également l’opportunité, au cours de l’étape de lyse cellulaire, de quantifier les protéines via un dosage de l’acide bicinchoninique pour la normalisation des échantillons à la fin de la mesure finale ou via un dosage de l’adénylate kinase à partir du milieu cellulaire. Ce test peut être effectué à l’aide de plusieurs réactifs facilement disponibles dans la plupart des laboratoires et ne nécessite que quelques produits chimiques supplémentaires peu courants. Le processus est simple, accessible et peut être réalisé sans étapes laborieuses en moins de 2 h.
Dans ce protocole, divers nanomatériaux ont été choisis qui induisaient auparavant des ROS ou qui étaient soupçonnés d’induire un stress oxydatif30,31. Une gamme de concentration a été explorée pour voir les effets de l’exposition à ces nanomatériaux sur diverses lignées cellulaires et l’efficacité du test pour quantifier les thiols antioxydants.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m filter (optional-For lysis buffer)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12561259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mL volumetric flask</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15290866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Volumetric flask&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15230876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mL beaker (optional-For lysis buffer)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15409083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel micropipette (20-200&#181;L)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>FA10011D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel micropipette (2-20&#181;L)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>B2B06492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates - black with clear bottom, TC treated</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10000631</td>
			<td>Preferred plate for seeding and fluoresence, use TC treated clear if unavailable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates - clear (TC treated and untreated)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10141161</td>
			<td>If black plates with clear bottom is not available/ suitable use TC treated clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates - white, Not TC treated</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11457009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549 (lung carcinoma) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>1.08543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11779408</td>
			<td>For protecting plates from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge (with 96 plate rotor)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione (GSH)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione disulfide (GSSG)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>G4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>258148</td>
			<td>Dilute to 1mM for GSH stock, pH adjustment also</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 (Hepatocarcinoma) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL&#160;CA-630&#160;</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>18896</td>
			<td>Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP lysis buffer&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11825135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774 (monocyte, macrophage) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (20-200&#181;L)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>B2B06482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (2-20&#181;L)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>B2B06478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH, 10M</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>72068</td>
			<td>For pH adjustment only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethylmaleimide (NEM)&#160;</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>E3876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>492016</td>
			<td>Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both. NP-40 alternative suggested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ortho -Phthaldialdehyde (OPA)</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 0.1M</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>P2272</td>
			<td>PBS can either be acquired pre-made or made in house, see notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader (with fluoresence capacity)</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>SPARK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar (optional-For lysis buffer)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>16265731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toxilight bioassay kit (AK assay)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT17-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) 0.5M&#160; in H2O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H51864</td>
			<td>Can also be purchased crystalised and suspended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCl</td>
			<td>Merck (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X100 phosphatase and protease cocktail&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10025743</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid quantification of oxidized and reduced forms of glutathione using ortho -phthalaldehyde in cultured mammalian cells in vitro

Le glutathion a longtemps été considéré comme un biomarqueur clé pour déterminer la réponse antioxydante de la cellule. Par conséquent, il s’agit d’un marqueur primaire pour l’étude des espèces réactives de l’oxygène. La méthode utilise l’ortho-phtalaldéhyde (OPA) pour quantifier la concentration cellulaire du ou des glutathion(s). Les conjugués de l’OPA avec du glutathion réduit (GSH) par liaison au sulfhydryle forment ensuite un isoindole, ce qui donne un conjugué hautement fluorescent. Pour obtenir un résultat précis à la fois pour le glutathion oxydé (GSSG) et le GSH, une combinaison d’agents masquants et d’agents réducteurs, qui ont été mis en œuvre dans ce protocole, est nécessaire. Les traitements peuvent également avoir un impact sur la viabilité cellulaire. Par conséquent, la normalisation par dosage des protéines est présentée dans ce test multiparamétrique. Le dosage démontre une plage de détection pseudo-linéaire de 0,234 à 30 μM (R2 = 0,9932±0,007 (N = 12)) spécifique au GSH. L’essai proposé permet également de déterminer la présence de glutathion oxydé à l’aide de l’agent masquant N-éthylmaléimide pour lier le glutathion réduit, et l’introduction de l’agent réducteur tris(2-carboxyéthyl) phosphine pour cliver la liaison disulfure dans le GSSG afin de produire deux molécules de GSH. Le test est utilisé en combinaison avec un test validé d’acide bicinchoninique pour la quantification des protéines et un test d’adénylate kinase pour l’évaluation de la cytotoxicité.

Reactive oxygen species (ROS) are a primary inducer of oxidative stress; oxidative stress has been well established in the generation of DNA mutations, cellular aging/ death, various cancers, diabetes, neurological diseases (such as Parkinson&#39;s and Alzheimers), and several other life-debilitating conditions1,2,3,4,5. A key defense against ROS are thiolic, non-enzymatic antioxidants, which are capable of reducing oxidants or radicals by acting as proton donors6,7. Glutathione (GSH) and cysteine are the two most prevalent thiols found in mammals8, while various other low molecular weight thiols exist (such as ergothioneine), GSH and cysteine are the most commonly measured non-enzymatic antioxidants found in literature9,10,11 and hold greatest relevance for combatting ROS8,12,13,14.
When GSH is utilized as an antioxidant, two molecules of GSH are covalently linked together via a disulfide bond to make glutathione disulfide (GSSG). Depletion of GSH is often used as an indicator of oxidative stress15,16. This assessment can also be combined with the detection of GSSG, although increases in GSSG in cells are often limited by active export processes since GSSG can be relatively reactive in cells, leading to disulfide bond formation with other protein thiols16.
Traditional methods for measuring GSH and GSSG are not simple processes and require numerous steps, including cellular extraction using lytic reagents17,18. The protocol outlined here simplifies these methods and allows the accurate measurement of non-enzymatic thiols and normalization using the cellular protein content or adenylate kinase release. In addition, it is possible to measure cellular viability prior to GSH/GSSG extraction. Several methods have previously attempted to target and quantify reduced and oxidized non-enzymatic thiols efficiently; methods including the use of HPLC19,20,21, plate assay (biochemical)22,23,24,25, and which use common reagents for thiol conjugation, such as 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB/ Ellman&#39;s reagent)19, Monochlorobimane (mBCI)26,27,28. Several companies have also prepared proprietary kits for the detection of glutathione; however, they do not publish reagent incompatibilities, which presents issues dependent on the treatments used29.
This protocol outlines a multiparametric assay that detects reduced thiols (such as GSH) via ortho-phthalaldehyde (OPA) conjugation to produce a fluorescent signal detectable at 340/450 Ex/Em, respectively. This assay facilitates the detection of both GSH and GSSG simultaneously (in plate), through the use of masking agents (N-ethylmaleimide) and GSSG reducing agents (tris(2-carboxyethyl) phosphine). This multi-biomarker protocol also provides an opportunity during the cellular lysing stage to quantify proteins via bicinchoninic acid assay for the normalization of samples on completion of the final measurement or via an adenylate kinase assay from the cell media. This assay can be performed utilizing several reagents readily available in most laboratories and only requires a few additional uncommon chemicals to perform. The process is simple, accessible, and can be performed without laborious stages in less than 2 h.
In this protocol, various nanomaterials were chosen that were either previously shown to induce ROS or suspected to induce oxidative stress30,31. A concentration range was explored to see the effects of exposure of these nanomaterials on various cell lines and the effectiveness of the assay in quantifying antioxidant thiols.

Pleins feux sur l’auteur : Quantification innovante des thiols et détection de biomarqueurs pour la recherche sur le stress oxydatif 

Quantification rapide des formes oxydées et réduites de glutathion à l’aide de l’ortho-phtalaldéhyde dans des cellules de mammifères en culture in vitro

We aim to offer a novel means to quantify thiol concentration with a specific focus on the GSH and GSSG concentrations of the various cell lines that can be performed in situ. We consider this a useful protocol for the scientific community. Numerous efforts have been made to detect niche and specific biomarkers of interest of reactive oxygen species, and several have found great interest in detecting short-lived reactive oxygen species, such as radical detection and small molecules such as hydroxyls and singlet oxygen.One key challenge for several institutions has been the ability to accurately and specifically detect biomarkers of interest without the need of expensive equipment or laborious processes. This protocol allows for multiparametric analysis, allowing for normalization of data without the need for separate protocols, and remove several stages found in other assays that are highly time consumptive, present incompatible reagents, or use reagents hazardous to health. The Nanomaterial Safety Group will continue to assess various nanomaterials and polymers for the effect they may have on human health.We consider this protocol an essential part of our toolkit in achieving this goal as this protocol can potentially be multiplexed to detect additional biomarkers.

Selon ce protocole, les lignées cellulaires A549 et J774 ont été ensemencées à des densités de 5 000 cellules/puits et 10 000 cellules/puits, respectivement, et cultivées à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant 48 h. L’analyse de l’AK après traitement des nanomatériaux est présentée dans le tableau supplémentaire 1, et la concentration en protéines est indiquée dans le tableau supplémentaire 2.
Graphique d’étalonnage La figure 3 montre trois étalonnages utilisant la plage de concentration indiquée (0,234 à 30 μM de concentration finale) à partir de trois plaques distinctes de trois types de cellules différents (bien que cela ne devrait pas avoir d’impact sur l’étalonnage) sur trois jours différents, non consécutifs. Bien que 3 échantillons soient présentés, un N de 12 a été observé et a démontré des régressions linéaires similaires avec une valeur moyenne de R2 de 0,9932 ± 0,007.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66267/66267fig03.jpg"> Figure 3 : Graphiques d’étalonnage du glutathion pour le dosage. Trois graphiques d’étalonnage provenant de plages d’étalonnage distinctes du glutathion dans la plaque, chacun effectué à une semaine d’intervalle ; barres d’erreur ± SD (n = 3, N = 12), n = répétitions techniques, N = répétitions biologiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/66267fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Résultats de l’échantillon Les cellules HepG2, A549 et J774 ont été utilisées dans l’évaluation de divers nanomatériaux soupçonnés d’induire des modifications des mécanismes cellulaires via le stress oxydatif. Le protocole de détection et de quantification décrit a été utilisé.
Les données reçues des 3 mesures (AK, BCA et GSH/GSSG) ont été traitées comme suit. Les tests AK et BCA ont été mis en œuvre pour la normalisation ; le test AK, à l’aide du kit recommandé, fournira les données les plus rapides et les plus simples sur la quantité d’AK libérée dans le milieu cellulaire. Une augmentation des valeurs AK est attendue pour augmenter la mort cellulaire. Par conséquent, un contrôle -ve (Vivant) et +ve (Mort) est requis. Cela permettra une normalisation basée sur le pourcentage.
Le dosage des BCA est un processus plus long, mais il permet d’obtenir des résultats quantifiables par quantification des protéines (mg/mL). Cela ne nécessite pas de contrôle -ve ou +ve comme dans l’AK, mais nécessitera tout de même un contrôle -ve général (cellules non traitées) pour permettre la normalisation des valeurs à réaliser.
Dans cette section de résultats représentatifs, il a été constaté que le traitement (nanomatériaux) avait le potentiel de causer des interférences avec le test AK. Par conséquent, toute la normalisation a été effectuée à l’aide des données de l’ACB. Par conséquent, l’information est présentée sous forme de concentration des espèces détectées (GSH ou GSH+GSSG (cependant, une soustraction de la concentration de GSH de la concentration totale de GSH+GSSG est effectuée pour obtenir la concentration de GSSG) par mg/mL de protéine (au moyen d’un test BCA). Si vous le souhaitez, cela peut ensuite être converti en un rapport pour évaluer la variation de GSH :GSSG par rapport au traitement souhaité.
La figure 4 montre les données sur le rapport GSH :GSSG de trois lignées cellulaires différentes (A549, J774 et HepG2) acquises à l’aide du protocole OPA et normalisées à l’expression des protéines via BCA (μg/mL), d’autres données spécifiant des valeurs supplémentaires de GSH et de GSSG se trouvent dans la figure supplémentaire 1.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66267/66267fig04.jpg"> Figure 4 : Rapport glutathion : disulfure de glutathion lors de la réalisation du dosage. On y voit les rapports glutathion/disulfure de glutathion de 3 lignées cellulaires, à savoir (A) A549, (B) J774 et (C) HepG2. Les cellules ont été incubées avec des traitements (divers nanomatériaux dans des milieux sans sérum) pendant 4 h. Les cellules ont été traitées à l’aide de ce protocole pour quantifier les changements dans le glutathion et le disulfure de glutathion et normalisées par la quantification des protéines, les barres d’erreur ± SE (n = 3, N = 3) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/66267fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
La plaque contient également une série de contrôles pour s’assurer que le test s’est déroulé correctement. NEM est ajouté en tant que composant individuel pour démontrer un manque d’interaction avec les supports de détection OPA. L’étalon d’étalonnage démontre une augmentation linéaire de la concentration de GSH, ce qui démontre la capacité effective du réactif de détection OPA à se lier efficacement à des concentrations croissantes de GSH.
Il convient de noter que ce test cible spécifiquement les groupes sulfhydryles libres couramment trouvés dans les thiols (tels que le GSH, qui sont généralement considérés comme des antioxydants). Une interaction potentielle est la liaison de l’OPA aux thiols protéiques, ce qui entraînerait une collecte de données inexacte. Par conséquent, le dosage des BCA est une étape cruciale pour normaliser les données en protéines et permettre une réflexion précise du GSH libre.
Figure supplémentaire 1 : Figures démontrant le glutathion, le disulfure de glutathion et le rapport glutathion : disulfure de glutathion de 3 lignées cellulaires, à savoir (A) A549, (B) J774 et (C) HepG2. Les cellules ont été incubées avec des traitements (divers nanomatériaux dans des milieux sans sérum) pendant 4 h. Les cellules ont été traitées à l’aide de ce protocole pour quantifier les changements dans le glutathion et le disulfure de glutathion et normalisées par la quantification des protéines, les barres d’erreur ± SE (n = 3, N = 3) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/Supplemetary%20Figure%201_RE.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Métadonnées des valeurs d’adénylate kinase pour les cellules A549 et J774. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/Supplementary%20data%201_AK%20values_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 2 : Métadonnées des valeurs d’acide bicinchoninique avec étalonnage pour les cellules A549, J774 et HepG2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/Supplementary%20data%202_BCA%20values_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

La quantification des formes oxydées et réduites du glutathion (GSSG et GSH, respectivement) a été réalisée grâce à l’utilisation d’ortho-phtalaldéhyde (OPA). L’OPA devient très fluorescent une fois conjugué au GSH, mais il est incapable de conjuguer le GSSG jusqu’à ce qu’il soit réduit. Ici, nous décrivons un test multiparamétrique pour quantifier les deux en utilisant la quantification des protéines pour la normalisation.

Glutathione has long been considered a key biomarker for determining the antioxidant response of the cell. Hence, it is a primary marker for reactive ...

Notre objectif est de proposer un nouveau moyen de quantifier la concentration de thiols, en mettant l’accent sur les concentrations de GSH et de GSSG des différentes lignées cellulaires qui peuvent être réalisées in situ. Nous considérons qu’il s’agit d’un protocole utile pour la communauté scientifique. De nombreux efforts ont été déployés pour détecter des biomarqueurs de niche et spécifiques d’intérêt des espèces réactives de l’oxygène, et plusieurs ont révélé un grand intérêt pour la détection des espèces réactives de l’oxygène à courte durée de vie, telles que la détection radicalaire et les petites molécules telles que les hydroxyles et l’oxygène singulet.L’un des principaux défis pour plusieurs institutions a été de détecter avec précision et précision les biomarqueurs d’intérêt sans avoir besoin d’équipement coûteux ou de processus laborieux. Ce protocole permet une analyse multiparamétrique, ce qui permet de normaliser les données sans avoir besoin de protocoles distincts, et de supprimer plusieurs étapes trouvées dans d’autres tests qui prennent beaucoup de temps, présentent des réactifs incompatibles ou utilisent des réactifs dangereux pour la santé. Le Groupe sur la sécurité des nanomatériaux continuera d’évaluer l’effet qu’ils peuvent avoir sur la santé humaine de divers nanomatériaux et polymères.Nous considérons ce protocole comme une partie essentielle de notre boîte à outils pour atteindre cet objectif, car il peut potentiellement être multiplexé pour détecter des biomarqueurs supplémentaires.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid Quantification of Oxidized and Reduced Forms of Glutathione Using Ortho -phthalaldehyde in Cultured Mammalian Cells In Vitro

694 vues.  Teesside University. Notre objectif est de proposer un nouveau moyen de quantifier la concentration de thiols, en mettant l’accent sur les concentrations de GSH et de GSSG des différentes lignées cellulaires qui peuvent être réalisées in situ. Nous considérons qu’il s’agit d’un protocole utile pour la communauté scientifique. De nombreux efforts ont été déployés pour détecter des biomarqueurs de niche et spécifiques d’intérêt des espèces réactives de l’oxygène, et plusieurs ont rév?...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Quantification innovante des thiols et détection de biomarqueurs pour la recherche sur le stress oxydatif 

Glutathione has long been considered a key biomarker for determining the antioxidant response of the cell. Hence, it is a primary marker for reactive oxygen species studies. The method utilizes Ortho-phthalaldehyde (OPA) to quantify the cellular concentration of glutathione(s). OPA conjugates with reduced glutathione (GSH) via sulfhydryl binding to subsequently form an isoindole, resulting in a highly fluorescent conjugate. To attain an accurate result of both oxidized glutathione (GSSG) and GSH, a combination of masking agents and reducing agents, which have been implemented in this protocol, are required. Treatments may also impact cellular viability. Hence, normalization via protein assay is presented in this multiparametric assay. The assay demonstrates a pseudo-linear detection range of 0.234 - 30&#181;M (R2=0.9932&#177;0.007 (N=12)) specific to GSH. The proposed assay also allows for the determination of oxidized glutathione with the addition of the masking agent N-ethylmaleimide to bind reduced glutathione, and the reducing agent tris(2-carboxyethyl) phosphine is introduced to cleave the disulfide bond in GSSG to produce two molecules of GSH. The assay is used in combination with a validated bicinchoninic acid assay for protein quantification and an adenylate kinase assay for cytotoxicity assessment.

Quantification of both oxidized and reduced forms of glutathione (GSSG and GSH, respectively) has been achieved through the use of Ortho-phthalaldehyde (OPA). OPA becomes highly fluorescent once conjugated to GSH but is unable to conjugate GSSG until reduced. Here, we describe a multiparametric assay to quantify both using protein quantification for normalization.