Cette méthode permet d’étudier comment l’état redox mitochondrial est affecté dans des conditions physiopathologiques. Il peut également être utilisé pour évaluer l’efficacité des stratégies de traitement qui visent à protéger les mitochondries. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une évaluation organique et spécifique des changements dynamiques et traçant les changements sur l’état redox des mitochondries en temps réel.
Cette méthode peut être combinée avec des indicateurs supplémentaires pour enregistrer simultanément, par exemple, le potentiel de la membrane mitochondriale ou les concentrations de calcium en plus de l’état redox. Ce protocole peut être appliqué aux cellules de culture, aux explantes tissulaires et aux cultures en tranches. Commencez par optimiser les paramètres du microscope confocal à balayage.
Pour ce faire, réglez le détecteur sur 12 bits ou 16 bits, activez le mode de balayage séquentiel et ajoutez une deuxième séquence/piste. Pour les deux couches, sélectionnez une table de choix pseudo couleur qui indique les pixels sur et sous-exposés, puis sélectionnez un objectif adapté à l’objet d’intérêt. Montez un couvercle avec des cellules dans la chambre d’imagerie.
Ajouter un millilitre de tampon d’imagerie et placer la chambre sur le microscope. Utilisez l’oculaire et la lumière transmise pour focaliser les cellules. Enregistrez des images avec différents formats de pixels et tailles de sténopés.
Enregistrez ensuite des images avec différentes intensités laser et ajustez en conséquence le gain et le seuil du détecteur. Enfin, enregistrez des images avec différentes vitesses de numérisation et différents nombres de moyennes d’images. Pour l’imagerie en direct, définissez l’intervalle de timelapse sur 30 secondes et la durée sur 25 minutes.
Ensuite, montez les cellules, placez la chambre sur le microscope et concentrez les cellules comme démontré précédemment. Passez en mode de numérisation et utilisez le canal de 488 nanomètres dans la vue en direct pour faire la mise au point et localiser les cellules pour l’imagerie. Si vous le souhaitez, pour augmenter le nombre de cellules enregistrées par exécution, utilisez la fonction multipoint pour imager deux à trois champs de vision par glissement de couverture.
Démarrez l’acquisition timelapse et enregistrez cinq images en tant qu’enregistrement de base de deux minutes. Ajoutez 500 microlitres de solution NMDA 3X à la chambre pour atteindre la concentration finale de 30 micromolaires et enregistrez 20 images supplémentaires sous forme de réponse NMDA de 10 minutes. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution 4X DA à la chambre et enregistrez six autres images.
Aspirer le tampon de la chambre d’imagerie et le remplacer par un millilitre de solution TNT. Après avoir enregistré 10 autres images, terminez l’enregistrement et enregistrez la série d’images. Pour importer les données dans le logiciel d’analyse d’images, cliquez sur plugins, sélectionnez les formats bio, puis l’importateur de formats bio.
Dans la boîte de dialogue, choisissez hyperstack dans la pile de vues avec, définissez le mode de couleur par défaut et sélectionnez Mise à l’échelle automatique. Changez le format d’image en 32 bits en cliquant sur l’image, en sélectionnant le type, puis dans les options, choisissez 32 bits. Pour diviser les couches de couleur en fenêtres séparées, cliquez sur l’image, accédez à la couleur et sélectionnez les couches fractionnées.
Ajustez le seuil pour sélectionner les mitochondries à analyser en cliquant sur l’image, en sélectionnant ajuster et seuil. Dans la boîte de dialogue, sélectionnez l’arrière-plan rouge foncé par défaut et empilez l’histogramme. Lorsque les pixels sélectionnés apparaissent en rouge, cliquez sur Appliquer.
Sélectionnez ensuite définir les pixels d’arrière-plan pour que NAN traite toutes les images et effectue la même procédure pour le canal deux. Pour visualiser le rapport de 405 à 488 nanomètres, créez une image de rapport en cliquant sur le calculateur de processus et d’image. Dans la boîte de dialogue, sélectionnez la couche un dans l’image un diviser dans l’opération canal deux dans l’image deux.
Sélectionnez ensuite Créer une nouvelle fenêtre et traiter toutes les images. Modifiez la table de choix de l’image de ratio en pseudo couleur en cliquant sur l’image, en sélectionnant les tables de choix, puis en lançant. Pour analyser l’image, dessinez des rois autour de cellules individuelles ou de mitochondries sur l’image de ratio.
Pour ajouter les ROI au gestionnaire de retour sur investissement, allez dans Analyser, cliquez sur les outils, sélectionnez Gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Ajouter et sélectionnez Tout afficher. Pour mesurer les rapports de 405 à 488 nanomètres des cellules individuelles, cliquez sur le gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez tous les retours sur investissement en appuyant sur Contrôle A, accédez à plus et sélectionnez multi-mesure. Dans la boîte de dialogue, sélectionnez Mesurer toutes les tranches et une ligne par tranche.
Après avoir exporté les mesures vers le tableur, sélectionnez l’image de 405 nanomètres, mesurez les intensités de tous les retours sur investissement et exportez à nouveau les mesures vers le tableur. De même, mesurez les intensités de retour sur investissement de l’image de 488 nanomètres. Pour enregistrer les rois pour référence ultérieure, sélectionnez tous les retours sur investissement en appuyant sur Contrôle A, accédez à plus et sélectionnez Enregistrer.
Ces instantanés représentatifs d’un enregistrement timelapse montrent des images de ratio de neurones avant et après le traitement NMDA et après l’étalonnage max/min avec DA et DTT. Le traitement des neurones avec 30 NMDA micromolaires a induit l’oxydation des mitochondries en quelques minutes. L’analyse des canaux de fluorescence individuels a révélé que l’acidose mitochondriale induite par le NMDA provoquait une baisse de la fluorescence GFP sur une excitation de 405 et 488 nanomètres.
Dans une expérience de contrôle, le prétraitement avec DA a empêché toute oxydation ultérieure des mitochondries par NMDA. Et par conséquent, le rapport 405 à 488 n’a pas changé malgré une trempe considérable de l’intensité de fluorescence GFP2 sensible à l’oxydoréduction. Cette expérience a confirmé que le rapport de 405 à 488 nanomètres n’est pas affecté par les changements de pH.
Dans une expérience distincte, le potentiel de la membrane mitochondriale, l’état redox et la morphologie ont été évalués en parallèle. Le traitement des neurones avec 60 NMDA micromolaires a entraîné la perte de tétraméthylrhodamine ou de signal TMRE et une augmentation du rapport rho GFP de 405 à 488 nanomètres, suivie d’un certain arrondi retardé des mitochondries. Lorsque vous commencez à utiliser cette méthode, il est très important de prendre le temps d’optimiser soigneusement les paramètres microscopiques.
Cela aidera à garder les neurones en bonne santé pendant vos expériences. Il est également très important de toujours respecter les règles de sécurité laser. Assurez-vous de ne pas être exposé au rayonnement laser lorsque vous ajoutez des médicaments à falsifier pendant les enregistrements en direct.
