La préparation d’échantillons cryogéniques est confrontée à des défis qui peuvent limiter son efficacité, en particulier la distribution inégale des particules. Ce problème conduit souvent à une mauvaise résolution et à une précision réduite dans les nouvelles structures protéiques construites. Diverses approches expérimentales sont utilisées pour surmonter la distribution inégale des particules, notamment l’ajout de détergents ou d’imitations de membranes à l’échantillon, la modification du film de support de la grille et l’inclinaison d’une étape spécifique lors de la collecte de données.
Ce protocole analyse une méthode pratique simple pour traiter la distribution inégale des particules en optimisant la préparation des échantillons, fournissant notre référence aux chercheurs pour illustrer efficacement les structures des macromolécules à l’aide de cryogène. Pour commencer, collectez les fractions protéiques regroupées contenant la petite protéine de choc thermique MJ 16.5. Utilisez des filtres centrifuges avec une coupure de poids moléculaire de 50 kilodaltons pour concentrer les fractions à quatre degrés Celsius à environ 65 milligrammes.
Après la concentration, centrifuger l’échantillon à 16 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les agrégats. Aliquote de volumes de 50 microlitres de surnageant dans des tubes PCR à paroi mince de 0,2 millilitre. Pour la microscopie électronique à transmission, décongelez deux tubes de protéines congelés sur de la glace.
Une fois décongelé, retournez le tube plusieurs fois pour mélanger. Ensuite, centrifugez la solution protéique à 16 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les agrégats. Ensuite, injectez le surnageant dans une colonne de chromatographie d’exclusion stérique et collectez des fractions d’élution de 0,5 millilitre.
Collectez les fractions éluciennes correspondant au pic, présentant l’absorbance ultraviolette la plus élevée à 280 nanomètres. Pour l’échange de tampon, à l’aide d’une paire de ciseaux, coupez une membrane de dialyse en morceaux de 30 x 30 millimètres. Incuber les morceaux dans de l’eau distillée ou des solutions tampons pour les équilibrer.
Ensuite, ajoutez 55 microlitres de solution protéique dans une chambre avec des boutons de microdialyse de 50 microlitres. Tenez la membrane de dialyse verticalement à l’aide d’une pince et touchez doucement un bord de la membrane contre du papier de soie pour drainer l’excès de liquide. Couvrez soigneusement le bouton de microdialyse avec la membrane.
Placez le joint torique sur la membrane de dialyse et roulez-le doucement dans la rainure sur le bord du bouton. Immergez chaque bouton de dialyse dans un bécher séparé contenant le tampon de destination, le côté de la membrane vers le haut. À l’aide d’une seringue munie d’une aiguille fine, percez soigneusement la membrane et récupérez la solution protéique de la chambre de microdialyse.
Chargez cinq microlitres de l’échantillon à une concentration de 20 à 120 nanogrammes par millilitre sur une grille de décharge luminescente. Préparez trois gouttes d’eau de 50 microlitres chacune sur une feuille de film de paraffine. Frottez la surface de la grille contre les gouttes d’eau pour laver l’échantillon.
Chargez maintenant cinq microlitres de solution d’acétate d’urinoir filtrée à 1 % sur la grille et pipetez immédiatement la solution d’acétate d’urinoir. Chargez encore cinq microlitres de la solution d’acétate d’urinoir sur la grille. Touchez doucement le côté pince à épiler de la grille avec du papier filtre pour éliminer l’excès de solution de coloration et laissez sécher la grille.
Montez la pince à épiler et la grille de décharge lumineuse sur l’instrument. Chargez ensuite quatre microlitres de l’échantillon sur le côté carbone de la grille. Lancez le processus de congélation par immersion.
Pour préparer les grilles à charger sur le microscope électronique à transmission, ou MET, placez d’abord une boîte de grille contenant des grilles vitrifiées dans la station d’assemblage de la grille automatique et dévissez le couvercle d’une boîte de grille contenant des grilles vitrifiées. Placez l’anneau de grille automatique dans l’espace de découpe désigné au poste d’assemblage. Déplacez avec précaution la grille vitrifiée de la boîte de grille et insérez-la dans l’anneau de grille automatique.
Alignez maintenant le disque pour positionner l’ouverture circulaire sur le dessus de l’anneau de grille automatique et de l’ensemble de grille. Pour fixer la grille dans l’anneau de grille automatique, placez l’outil d’insertion du clip C sur le dessus de la grille et appuyez doucement pour fixer le clip C à l’intérieur. Faites pivoter le disque vers l’arrière et déplacez les grilles assemblées dans la boîte de stockage à grille automatique.
Assemblez la station de chargement de la cassette et refroidissez-la avec de l’azote liquide. Placez la boîte de stockage à réseau automatique dans la station de chargement. Déplacez l’ensemble de grille de la boîte de rangement de la grille automatique vers la cassette.
À l’aide de la poignée, placez la cassette dans la capsule du chargeur automatique. Vérifiez la goupille du chargeur automatique pour confirmer sa liberté de mouvement et assurez-vous qu’elle n’est pas gelée. L’accumulation de particules en réseaux a été observée sur toutes les grilles testées, quelles que soient les conditions tampons ou les modifications de charge de surface.
Une concentration protéique plus élevée combinée à des grilles chargées négativement dans neuf millimolaires de mobstress, 50 millimolaires de chlorure de sodium et 0,1 millimolaire de tampon EDTA a permis d’obtenir la distribution souhaitée de particules uniques dans les trous de grille, réduisant ainsi la formation de réseaux de protéines. Cette condition optimisée a conduit à une valeur élevée de rapport de surface conique FSC de 0,80 et à une valeur SCF de 0,859, confirmant une distribution uniforme des particules.
