La méthode de plongée manuelle décrite ici est une méthode rentable et fiable pour préparer des échantillons pour la microscopie électronique à transmission. Dans cette vidéo, nous montrerons comment configurer le piston manuel, préparer le cryogène et effectuer un buvard et un plongeon manuels des grilles EM. Préparez l’environnement de plongée manuelle.
Cette procédure doit être effectuée dans une chambre froide maintenue à 40 degrés Celsius avec une humidité supérieure à 95%Nous vous recommandons d’utiliser les matériaux indiqués ici et comme décrit dans le protocole en ligne pour le buvard et le plongeon manuels. Préparez le cryogène Dewar et le piston manuel. Pour assembler le cryogène Dewar, installez d’abord la base de la plate-forme au fond de la mousse de polystyrène bleu Dewar, en vous assurant qu’elle est plate et plane.
Placez ensuite le porte-récipient à éthane sur le dessus de la base de la plate-forme et insérez le récipient en laiton et en éthane. Enfin, situez la plate-forme de stockage de grille tournante. Ensuite, localisez le Dewar plongeant à la base du piston manuel.
Centrez le récipient d’éthane sous le bras plongeant et fixez le Dewar plongeant à la base. Pour régler la hauteur de plongée manuelle, fixez d’abord du ruban adhésif frais à la base du bras plongeant. Ensuite, fixez une paire de pinces à pincer en enroulant solidement le ruban adhésif autour du bras plongeant et de la base de la pince.
Assurez-vous que les pinces à épiler sont fermement attachées en les tapotant légèrement. Tenez le bras plongeant et abaissez lentement la pince à épiler dans le récipient en laiton éthane en appuyant sur la pédale. Ajustez l’emplacement du Dewar plongeant de sorte que les pinces à épiler se situent au milieu du récipient en laiton éthane.
Les extrémités de la pince à épiler ne doivent pas entrer en contact avec la taille ou le fond du récipient en laiton éthane pour éviter d’endommager la pince à épiler et le piston manuel. Une fois la position réglée, réinitialisez le bras plongeant manuel. Préparez le cryogène.
La préparation du cryogène doit être effectuée dans une pièce bien ventilée et un équipement de protection individuelle approprié doit être porté en tout temps. Pour commencer, un mauvais azote liquide directement dans le Dewar plongeant, s’arrêtant lorsque le niveau d’azote liquide atteint le sommet du récipient d’éthane en laiton. Le système doit être assez froid pour continuer après que l’azote liquide cesse de bouillonner violemment.
Cela prendra environ cinq minutes. L’éthane se présente sous forme de gaz comprimé et doit être condensé. Pour régler le débit de gaz pour une condensation optimale de l’éthane, insérez l’extrémité de la conduite de gaz éthane dans un bécher d’eau de 250 mil et observez le bouillonnement.
Le flux de gaz doit produire un flux constant de bulles qui ne perturbe pas violemment la surface de l’eau. Pour commencer à condenser l’éthane, placez l’extrémité de la conduite de gaz éthane au fond du récipient en laiton ethane. Remuez lentement la pointe métallique et commencez à liquéfier l’éthane.
Dès que l’éthane commence à refroidir, il fait un bruit audible. Remplissez le récipient d’éthane en laiton aux trois quarts plein d’éthane liquide. Complétez le Dewar plongeant avec de l’azote liquide, en veillant à ce qu’il touche le récipient en laiton ethane mais ne s’y renverse pas.
L’ajout d’azote liquide est nécessaire pour une congélation uniforme de l’éthane. Placez le couvercle en mousse sur le Dewar plongeant bleu et laissez l’éthane se solidifier complètement. Redémarrez le flux de gaz éthane et placez soigneusement l’extrémité de la conduite de gaz dans l’éthane solide.
Il est important de placer la pointe verticalement dans le récipient et de distribuer de l’éthane au fond. Remuez lentement la pointe métallique pour faire fondre l’éthane et amener le niveau d’éthane liquide jusqu’au sommet du récipient. Fermez le couvercle pendant environ une minute et laissez l’éthane se solidifier autour des bords du récipient en laiton jusqu’à ce que deux à trois millimètres d’éthane solide soient visibles.
L’éthane est maintenant à une température idéale pour la congélation d’échantillons biologiques. Fixez soigneusement le Dewar plongeant à la base du piston manuel. Fixez une pince à épiler en enroulant solidement le ruban adhésif autour du bras plongeant et de la base de la pince.
Tenez le bras plongeant et abaissez lentement la pince à épiler dans l’éthane liquide en appuyant sur la pédale. Ajustez l’emplacement du Dewar plongeant de sorte que les pinces à épiler se situent au milieu de l’éthane liquide, en évitant tout contact avec l’anneau éthane solide. Préparez les matériaux et accessoires de plongée.
Préparez le papier buvard en découpant chaque papier filtre circulaire en bandes d’environ un centimètre de large. Évitez de toucher le centre du papier buvard et jetez les plus petits embouts. Il est important de s’assurer que les bandes de papier buvard sont sèches, propres et exemptes de contaminants.
Avant de plonger, placez les boîtes de grille dans le Dewar plongeant dans les fentes appropriées. Assurez-vous que la grille couvre notre libre de rotation. Préparer les échantillons CryoEM par congélation par immersion.
En raison de la diversité des préparations de grille et de grille, suivez les protocoles recommandés pour rendre les grilles hydrophiles. Pour manipuler correctement les grilles, utilisez une pince à épiler propre et sèche pour ramasser les grilles hydrophiles au niveau de l’anneau extérieur. Faites glisser la pince en plastique pour fixer la grille et appuyez doucement sur la pince à épiler pour vous assurer que la grille est correctement serrée.
Appliquez trois microlitres d’échantillon à l’avant de la grille maintenue dans la pince à épiler. Fixez fermement la pince à épiler au bras plongeant manuel en enroulant le ruban adhésif autour de la base de la pince. L’échantillon est maintenant prêt à être effacé et plongé congelé.
Tenez chaque extrémité d’une bande propre de papier buvard entre vos index et vos pouces. Posez vos mains sur le bord du Dewar plongeant pour établir une position stable. Le papier buvard doit se trouver à environ un centimètre de la surface de la grille.
Pliez le papier buvard jusqu’à ce que le centre entre en contact avec la grille. Il est important que le papier buvard soit parallèle à la surface de la grille pour permettre un contact uniforme et éviter d’endommager la grille. Lorsque le front de liquide mobile cesse de se propager, commencez à compter.
Épongez la grille pendant cinq secondes. Écartez vos doigts, en tendant le papier buvard et en le retirant rapidement de la surface de la grille. Simultanément, appuyez sur la pédale pour relâcher le bras plongeant manuel, plongeant les pinces à épiler qui maintiennent la grille dans l’éthane liquide.
En gardant la grille fraîchement congelée dans l’éthane liquide, détachez soigneusement la pince à épiler du bras plongeant manuel. Débranchez soigneusement la pince à épiler pour que la grille soit amovible. Déplacez la grille dans le réservoir d’azote liquide sous le récipient d’éthane en laiton en un mouvement rapide de l’éthane à l’azote liquide.
Placez la grille dans la zone de grille. Résultats représentatifs. À partir de cette vidéo, les chercheurs devraient être en mesure de préparer des grilles CryoEM, comme celle-ci, avec de nombreux carrés contenant de minces films de glace vitrée pour l’imagerie à haute résolution.
La concentration de l’échantillon et le temps de buvage peuvent être ajustés pour optimiser la densité des particules. Ici, nous allons démontrer le flux de travail complet pour la congélation des échantillons CryoEM en utilisant la méthode de transfert et de plongée. Utilisez une pince à pince propre pour ramasser une grille fraîche et fixer la grille en place.
Appliquez trois microlitres d’échantillon sur le côté hydrophile de la grille et fixez la pince à épiler sur le bras de plongée manuelle en enroulant le ruban adhésif autour de la poignée de la pince. Placez le papier buvard parallèlement à la surface de la grille et pliez doucement le papier buvard vers la grille pour initier le buvard. Après le temps souhaité, déplacez le papier buvard dans un mouvement d’accrochage loin de la surface de la grille tout en appuyant sur la pédale pour libérer le bras plongeant, plongeant la grille dans l’éthane liquide.
Déroulez soigneusement le ruban adhésif autour de la pince à épiler et du bras plongeant manuel. D’un seul mouvement rapide, transférez rapidement la grille du récipient d’éthane dans le réservoir d’azote liquide. Placez la grille dans la boîte de rangement de la grille et enveloppez la pince à épiler dans une lingette Kim pour sécher;répétez.
