Nous étudions donc les glucides complexes, ou glycanes, dans le système immunitaire inné et les troubles liés au système immunitaire, en nous concentrant actuellement sur la septicémie et le cancer. Nos travaux portent sur des méthodes analytiques et la glycobiologie des systèmes, y compris des méthodes glycomiques et glycoprotéomiques, pour la caractérisation détaillée de la glycoprotéine humaine. La glycoprotéomique a connu d’énormes progrès au cours des dernières décennies, et les progrès ne sont plus limités par la pénurie de données de spectrométrie de masse de haute qualité disponibles.
Le défi consiste plutôt à interpréter et à générer des connaissances biologiques à partir des données spectrales. La méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique permet aux glycoscientifiques d’obtenir un aperçu profond et précis du glycoprotéome et des barrières dures avec des indices de santé humaine, la glycoprotéomique est capable de générer des informations spécifiques au site dans le glycoprotéome. Mais les taux de glycopeptides restent élevés.
Pour résoudre ces problèmes de reproductibilité, notre méthode glycoprotéomique glycomique permet un profilage précis du glycoprotéome en définissant des contraintes dans l’espace de recherche de glycanes grâce à l’étude glycomique du même échantillon. En fin de compte, il permet des recherches plus rapides et plus précises des glycopeptides. Notre méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique permet une cartographie complète de l’hétérogénéité et de la dynamique des indices de glycoprotéome à partir d’une variété d’échantillons humains différents.
Cette méthode peut donc nous aider à mieux comprendre la progression de la maladie et peut également nous aider à trouver de nouveaux biomarqueurs diagnostiques pour des cibles thérapeutiques contre une grande variété de maladies humaines. La méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique nous permet de déchiffrer la complexité du glycoprotéome humain, ce qui, à son tour, ouvre de nouvelles questions biologiques telles que la façon dont les structures glycanes affectent la fonction des protéines, la communication cellulaire ou les réponses immunitaires. Cela soulève également des questions sur comment et pourquoi le modèle de glycosylation a changé dans certaines maladies.
Et ces connaissances pourraient conduire à des découvertes, à de nouveaux marqueurs diagnostiques et à des thérapies personnalisées dans des maladies complexes. Pour immobiliser la protéine d’intérêt sur une membrane PVDF, à l’aide d’une ponction monotrou, coupez la membrane en fonction du nombre d’échantillons à repérer. Mouillez les membranes excisées avec du méthanol, puis transférez-les sur une plaque à fond plat à 96 puits.
Une fois que les membranes sont presque sèches, appliquez 2,5 microlitres d’échantillons de protéines par endroit. Faites sécher les membranes à l’air libre à 20 à 25 degrés Celsius pendant au moins trois heures, ou de préférence toute la nuit, en prenant soin d’éviter toute contamination. Ajouter 100 microlitres de 1 % de PDP-40 dans du méthanol dans chaque puits contenant les membranes tachetées.
Agitez la plaque dans la solution PDP-40 à 20 à 25 degrés Celsius. Après cinq minutes, jetez la solution PDP-40. Ensuite, lavez chaque puits contenant les taches protéiques bloquées avec 100 microlitres d’eau ultrapure et secouez la plaque pendant cinq minutes.
Ajouter 15 microlitres de solution PNGase F dans chaque puits. Pour éviter la déshydratation, ajoutez de l’eau dans les puits vides environnants. Fermez soigneusement la plaque avec un film transparent et incubez pendant au moins huit heures à 37 degrés Celsius.
Après l’incubation, faites tourner la plaque pendant cinq minutes pour aider les gouttelettes évaporées sur les côtés des puits à s’accumuler au fond. Transférez les échantillons de N-glycanes libérés dans des microtubes à centrifuger individuels de 1,5 millilitre. Lavez bien chaque échantillon deux fois avec 20 microlitres d’eau ultra-pure, en aspirant et en combinant tous les échantillons restants dans les nouveaux tubes.
Ensuite, ajoutez 10 microlitres d’acétate d’ammonium de 100 millimolaires pH 5 et incubez les échantillons pendant une heure à 20 à 25 degrés Celsius. Sécher les échantillons de N-glycanes dans un système de concentration sous vide. Pour préparer des micro-colonnes maison de carbone graphite poreux, ou PGC-C18, ou SPE, utilisez une seringue pour boucher et transférer les disques C18 dans des pointes de pipette de 10 microlitres.
Pipeter une boue de résine PGC de 10 microlitres en suspension dans 50 % de méthanol dans les micro-colonnes C18 SPE. Placez les micro-colonnes dans des tubes de 2 millilitres à l’aide d’adaptateurs de micro-centrifugeuse. Faites tourner les tubes pour créer des micro-colonnes SPE PGC-C18 d’une hauteur de colonne d’environ 0,5 centimètre.
Ensuite, ajoutez 50 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 %, ou TFA, dans de l’acétonitrile dans les micro-colonnes et centrifugez à 2000 G pendant 60 secondes pour faciliter le passage des phases mobiles à travers les micro-colonnes. De même, laver et conditionner les micro-colonnes trois fois avec du TFA aqueux à 0,1 %. Appliquez les échantillons de N-glycane sur chaque micro-colonne dans des volumes de charge allant jusqu’à 40 microlitres.
Faites tourner la micro-colonne après chaque édition, en répétant jusqu’à ce que l’échantillon entier soit chargé. Lavez chaque micro-colonne avec 20 microlitres d’eau ultra-pure. Transférez les micro-colonnes dans de nouveaux tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Pour éluer les N-glycanes, ajoutez 40 microlitres de TFA à 0,1 % dans 50 % d’acétonitrile dans chaque micro-colonne. Faites tourner les tubes et combinez l’éluat de chaque rotation. Faites sécher les N-glycanes dessalés dans un système de concentrateurs sous vide.
Parcourez les données brutes LC-MS/MS générées à l’aide du logiciel approprié. Confirmez la haute qualité des données en évaluant la largeur étroite des pics LC, la séparation efficace des isomères N-glycanes, la précision MS élevée, la résolution et le rapport signal/bruit, ainsi que l’efficacité de fragmentation CID MS/MS élevée. Identifiez manuellement les N-glycanes dans l’échantillon en fonction de la masse des précurseurs monoisotopiques, des modèles de fragmentation CID MS/MS et des temps de rétention relatifs et absolus du PGC-LC.
Pour la quantification relative des N-glycanes, générer une liste de transition contenant le rapport masse/charge des précurseurs monoisotopiques pour tous les isomères de N-glycanes identifiés. Déterminez les valeurs de l’aire sous la courbe à partir des chromatogrammes ioniques extraits de tous les ions précurseurs de N-glycanes. Pour préparer les micro-colonnes ZIC-HILIC-C8-SPE, à l’aide d’une seringue, branchez et transférez les disques C8 dans des pointes de pipette de 10 microlitres.
Déposer une suspension de résine ZIC-HILIC dans du méthanol dans les micro-colonnes C8-SPE. Placez les micro-colonnes dans des tubes de 2 millilitres avec des adaptateurs de micro-centrifugeuse, en veillant à ce que les colonnes soient suspendues au centre. Tournez pour créer des micro-colonnes HPLC C8-SPE d’une hauteur d’environ un centimètre.
Ajoutez 50 microlitres de méthanol dans les micro-colonnes et centrifugez à 2000 G pendant 60 secondes, en laissant passer les phases mobiles à travers la colonne. De même, lavez les micro-colonnes trois fois, chacune avec 50 microlitres d’eau ultrapure suivie de 50 microlitres de 1 % d’AGZ dans 80 % d’acétonitrile. Remettre en suspension les mélanges de peptides séchés destinés à l’enrichissement en N-glycopeptides dans 50 microlitres de 1 % d’AGT dans 80 % d’acétonitrile, et bien mélanger.
Placez les micro-colonnes ZIC-HILIC-C8-SPE dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre avec des adaptateurs de micro-centrifugeuse. Appliquez les mélanges de peptides remis en suspension sur chaque micro-colonne et tournez à 2000 G pendant 60 secondes. Collectez les fractions d’écoulement et réappliquez chaque fraction sur la même micro-colonne ZIC-HILIC-C8-SPE.
Ensuite, éluez le N-glycopeptide avec l’ajout séquentiel de 50 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 25 millimolaires et de 50 microlitres d’acétonitrile à 50 %. Transférez les micro-colonnes dans de nouveaux tubes à micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre à faible liaison. Pour éluer séquentiellement le N-glycopeptide retenu, ajoutez 50 microlitres de TFA aqueux à 0,1 % dans les microcolonnes et centrifugez à 2000 G pendant 60 secondes.
Ensuite, éluez le N-glycopeptide avec l’ajout séquentiel de 50 microlitres de TFA aqueux à 0,1 %, suivis de 50 microlitres de bicarbonate d’ammonium à 25 millimolaires et de 50 microlitres d’acétonitrile à 50 %. Collectez, combinez et séchez les N-glycopeptides enrichis et le flux de peptides non modifiés à travers les fractions dans un système de concentration sous vide. L’analyse des données N-glycomiques a permis d’identifier 76 isomères N-glycanes dans les tissus cancéreux colorectaux avec 70 % de glycanes complexes/hybrides, 20 % d’oligomannose et 10 % de paucimannose.
Toutes les structures des N-glycanes ont été confirmées par des preuves spectrales, quantifiées à l’aide des valeurs de l’aire sous la courbe des chromatogrammes ioniques extraits.
