Notre groupe multidisciplinaire tente de comprendre comment une protéine infectieuse, un prion, peut effectuer des tâches biologiques complexes. Nous nous intéressons également à la façon dont les prions peuvent persister dans l’environnement pendant des années, voire des décennies. À la suite des procédures de décontamination des prions, il n’existait pas de méthode robuste pour déterminer l’efficacité de l’inactivation des prions.
Nous essayons d’aborder cette question dans le cadre de nos recherches. La méthode d’écouvillonnage, associée à la méthode RT-QuIC, permet d’échantillonner un large éventail de surfaces pour détecter les activités d’ensemencement des prions. Il peut être utilisé pour détecter les prions associés à la surface en laboratoire, en clinique ou dans l’environnement.
Je m’intéresse à la façon dont les prions interagissent avec les surfaces et aux exigences des prions liés aux surfaces pour établir l’infection. Pour commencer, identifiez et étiquetez les zones de surveillance appropriées pour l’écouvillonnage. Préparez deux microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre pour chaque zone identifiée et ajoutez 250 microlitres de DPBS dans le premier tube, en laissant le second vide.
Récupérez les écouvillons à bout de mousse de l’entreposage dans un endroit exempt de contamination par des prions. Préparez les contrôles positifs et négatifs en utilisant des homogénats cérébraux appropriés ou BH dans DPBS. À l’aide de gants propres, récupérez le nombre requis d’écouvillons en mousse de l’emballage et placez-les côté poignée vers le bas dans un support à tubes.
Assurez-vous que les pointes n’entrent pas en contact avec d’autres surfaces. En tenant un écouvillon à mousse propre par la poignée, appliquez 50 microlitres des échantillons de contrôle positifs et négatifs respectifs sur les pointes de l’écouvillon. À l’aide de ciseaux, coupez l’excès de poignée de l’écouvillon à environ la moitié de sa longueur et placez l’écouvillon dans le tube de micro-centrifugeuse préchargé pour immerger l’embout en mousse dans le DPBS.
En tenant un écouvillon à embout en mousse propre par la poignée, pré-mouillez l’embout en mousse avec de l’eau de qualité moléculaire et secouez l’excès d’eau. Placez l’embout en mousse humidifiée sur la zone choisie pour la surveillance et écouvillonnez la zone d’avant en arrière environ 10 fois tout en tournant simultanément l’embout de l’écouvillon sur la surface. À l’aide de ciseaux, coupez l’excédent de poignée de l’écouvillon à environ la moitié de sa longueur et placez l’écouvillon dans le tube de micro-centrifugeuse préchargé pour immerger l’embout en mousse dans le DPBS, en veillant à ce que le couvercle puisse se fermer complètement.
Jetez les gants et remplacez-les par des neufs avant de passer au prochain site d’écouvillonnage afin de minimiser la contamination croisée. Pour l’extraction par écouvillonnage, placez le tube de micro-centrifugeuse dans un support de tube circulaire et immergez le support dans le bain-marie de sonicater à corne de tasse. Assurez-vous que l’écouvillon en mousse dans le DPBS à l’intérieur du tube se trouve sous la surface de l’eau, en laissant les parties de la poignée non immergées.
Sonicez l’échantillon pendant 15 secondes au total avec des cycles de marche et d’arrêt de cinq secondes. Après la sonication, centrifugez le tube pendant environ 15 secondes pour recueillir les DPBS au fond du tube avant le transfert. À l’aide d’une pipette P 1000 réglée à 250 microlitres, collectez soigneusement tout l’extrait d’écouvillon liquide du fond dans le tube vide pré-étiqueté correspondant.
Jetez le tube usagé contenant l’écouvillon. Concentrez l’échantillon dans un concentrateur sous vide, en vous assurant que le capuchon du tube est ouvert, à la fin du cycle, assurez-vous que l’échantillon est complètement concentré avec seulement une pastille restante. Conservez le granulé à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement.
Pour l’analyse RT-QuIC, préparez une plaque de contrôle négative et positive avec les homogénats cérébraux correspondants dilués dans une solution de dilution tissulaire. Décongelez maintenant la pastille d’extrait d’écouvillon stockée du congélateur à moins 80 degrés Celsius et remettez en suspension l’extrait d’écouvillon séché avec 50 microlitres d’eau de qualité moléculaire par pipetage. Vortex brièvement et laissez l’échantillon reposer à température ambiante.
Chargez deux microlitres de commandes de plaques négatives et positives, suivies d’extraits d’écouvillons, dans les puits de plaque RT-QuIC respectifs. Les écouvillons de contrôle négatif n’ont pas franchi le seuil de fluorescence positif, confirmant l’absence de contamination pendant les procédures. Les extraits d’écouvillons témoins positifs ont montré un ensemencement uniforme dans tous les puits répliqués, démontrant une sensibilité de détection appropriée.
Les échantillons prélevés à la surface des zones non contaminées n’ont pas montré d’ensemencement au-dessus du seuil, ce qui confirme la négativité des prions. Les surfaces contaminées par des prions présentaient un ensemencement supérieur au seuil, avec des rapports de points maximaux et des temps de fluorescence variables par rapport aux témoins. Les surfaces contaminées par des prions traitées à l’eau de Javel n’ont pas réussi à ensemencer le RT-QuIC, ce qui démontre l’efficacité de la désinfection.
Certains artefacts de surface présentaient des courbes cinétiques modifiées et des temps de fluorescence plus longs, indiquant des faux positifs potentiels, probablement dus à la présence de poussière ou de produits chimiques résiduels sur une surface.
