Ce travail a été financé par le Fonds autrichien pour la science (FWF) accorder P18820-B13. Déclaration d&#39;éthique: L&#39;étude a été approuvée (PLUS_Ethik_090514) par le Comité d&#39;éthique pour l&#39;expérimentation avec des êtres humains et / ou les animaux à l&#39;Université de Salzbourg se conformer aux Declaraction Helsinki révisée de 1983 et tous les patients participant ont donné leur consentement éclairé écrit.

1. Préparation des conjugués de drogue <ol><li> Dissolvez 10 mg dans 1 ml de dH O 2 DF dans un tube de 1,5 ml de réaction. Dans la procédure utilisation ultérieure 95 ul de cette solution DF. Pour conjuguer PP à la HSA dissoudre 30,4 mg PP dérivés (304 g / mol) dans 500 pi 0,3 M d&#39;hydroxyde de sodium (NaOH). </li><li> Ajouter 430,6 ul dH 2 O et 100 ul 0,5 m 2 - (N-morpholino) éthanesulfonique (MES) tampon pH 6,5 à 95 ul de DF dissous. Ajouter 33,1 ul dH 2 O et 140 ul de 2 M MES tampon pH 2,9 à l&#39;échantillon PP. </li><li> Ajouter 57,5 ul d&#39;une solution fraîchement préparée de N-éthyl-N &#39;- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide solution mère (EDC) dissous dans dH 2 O avec une concentration de 100 mg / ml à l&#39;échantillon DF, ou une solution de 10 ul d&#39;EDC l&#39;échantillon PP. Vortex les échantillons pendant 1 minute. </li><li> Ajouter 16,9 pi de solution de HSA avec une concentration de 118 mg / ml à chaque échantillon. </li><li> Incuber les échantillons pendant 2 heures à température ambiante tout en agitant à 300 tours / min. </li><li> Dialyser le DF et les échantillons de PP 3 fois contre 2 litres de tampon phosphate salin (PBS) à pH 7,4 pendant plusieurs heures chacune. Effectuez toutes les étapes de dialyse à 4 ° C. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon de 10 minutes à 14000 xg et recueillir les DF surnageant contenant ou PP conjugué à la HSA. </li><li> Vérifiez surnageant pour les protéines en effectuant une SDS-PAGE, utilisant des gels à 12%. Charge d&#39;environ 12 mg de HSA conjugué dans un slot de gel. </li></ol> 2. Déterminer le taux de couplage de la drogue conjugués (figure 2) <ol><li> Pour l&#39;analyse du taux de couplage de DF et PP conjugués par HPSEC utiliser un 100 mM tampon phosphate de sodium pH 6,5 contenant 150 mM de NaCl et de l&#39;azide de sodium à 0,05%. Utilisez un x 7,8 à 300 mm TSK-Gel-G2000 colonne SWXL. </li><li> Effectuer la détection des signaux en utilisant une ligne couplée RI et le système de détecteur UV. </li><li> Préparer un échantillon standard HSA avec une concentration de 1 mg / ml dans dH 2 O. Pour étalonnage du détecteur d&#39;injecter 50 ul HSA solution standard. </li><li> Calculer la RI RI k constante et l&#39;UV UV k constant pour le détecteur. Utilisez la zone de formules RI = RI k * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] et la zone UV UV = k * [(DA / DC) HSA * c (HSA)] avec (dn / dc) = HSA 0,185 et (DA / DC) = 0.518 HSA 5. </li><li> Préparer DF et PP standards dérivés à des HPSEC que les montants de 5, 10 et 30 nmol de ces deux normes peuvent être facilement injectées. </li><li> Calculer les valeurs moyennes de (dn / dc) et de la drogue (DA / DC) des médicaments pour les deux normes. Pour DF, un (dn / dc) de 0,235 ± 0,010 et un (DA / DC) de 39,000 ± 0,493 a été déterminé. Pour PP, un (dn / dc) de 0,328 ± 0,016 et un de (DA / DC) ± 2,464 53,155 a été déterminée. </li><li> Injecter conjugués drogue sur HPSEC et de déterminer leur RI et UV domaines de pointe. </li><li> Calculer la concentration de DF, dérivé PP, et HSA en résolvant les équations deux zones RI = RI k * [(dn / dc) des médicaments * c (médicament) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] UV région et UV = k * [(DA / DC) de drogue * c (médicament) + (DA / DC) HSA * c (HSA)] pour les inconnues. </li></ol> 3. BAT à l&#39;aide de médicaments conjugués <ol><li> Préparer sept coupes cytométrie de flux et de les étiqueter selon leur contenu: le contrôle sans tache, le contrôle négatif, contrôle positif, et conjugués de drogue. </li><li> Pipeter 50 pi de tampon de stimulation B-CCR-STB (Flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) dans les flacons réservés pour le contrôle sans tache et négatifs. Comme contrôle positif, utiliser 50 ul d&#39;une solution anti-FceRI fournies par le kit Flow2 CAST. Ajouter la quantité appropriée de solution de conjugué à l&#39;flacons réservés pour les conjugués de drogue en créant une série de dilution 1:10 de 0,02 -20 pg / ml DF et PP conjugué conjugué (concentrations finales dans un volume d&#39;essai de 200 pi). Ces expériences de titration doit être réalisée pour déterminer la concentration d&#39;activation des basophiles optimale pour chaque échantillon de patient. </li><li> Ajouter 100 ul de tampon de stimulation à chaque tube de sang EDTA et 50 patients ul du tout. Mélanger les échantillons soigneusement. </li><li> Pipeter 20 ul Flow2 réactif de révélation CAST contenant des anti-CCR3 anticorps marqués à la phycoérythrine (PE) et des anticorps anti-CD63 marqué à l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) à chaque tube et mélanger à nouveau. Ne pas pipeter réactif de révélation dans l&#39;échantillon non coloré! </li><li> Incuber les échantillons pendant 45 minutes dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Arrêtez la réaction sur la glace pendant 5 minutes. </li><li> Lyse érythrocytes en ajoutant 2,0 ml de réactif CAST Flow2 lyse à chaque flacon et le vortex doucement. Incuber les échantillons dans l&#39;obscurité pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Centrifuger les échantillons pendant 5 minutes à 500 xg et le surnageant décanter avec précaution. </li><li> Resuspendre les cellules dans 500 ul de tampon de lavage Flow2 CAST et de stocker la glace jusqu&#39;à la cytométrie de flux. </li><li> Ajustez la tension s le cytomètre en flux dearam è tres de diffusion vers l&#39;avant et de côté (FSC, SSC) tout en acquérant de l&#39;échantillon non colorées. </li><li> Porte des cellules prédit que les lymphocytes de la parcelle SSC-FSC à l&#39;intrigue SSC-PE. Les basophiles sont identifiés par un PE-anticorps anti-CCR3 anticorps comme CCR3 Salut lo SSC et les porte dans l&#39;intrigue FITC-PE. L&#39;anticorps anti-CD63 détecter les basophiles activés est marqué au FITC. </li><li> Régler le seuil à maximum 2,5% de basophiles CD63 comme Salut dans le contrôle négatif. Un échantillon est considéré positif pour l&#39;activation des basophiles, si basophiles&gt; 5% sont CD63 salut et l&#39;indice de fluorescence moyenne (IFM) de l&#39;échantillon divisé par le MFI du contrôle négatif dépasse 2 (figure 3). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Cette expérience évalue BAT comme un outil bénéfique pour détecter hypersensibilité médicamenteuse IgE-dépendante. Conjugués de protéines d&#39;AINS sont utilisés pour l&#39;activation des basophiles. Par HPSEC avec RI et de l&#39;état d&#39;agrégation détection UV, le degré de couplage et de rendement effectif des conjugués sont déterminées. Comme la figure 4 montre, 43,5% des conjugués DF resté monomères avec un degré de couplage de 5,0 DF / HSA. Pour les agrégats un degré de couplage de 9,5 a été déterminée. Le conjugué propyphenazone a été démontré que des monomères constitués de 68,5% avec un degré de couplage de 21,2. Le degré de couplage des agrégats était de 27,9. Au total, le degré de couplage déterminée de conjugués DF DF était de 7,6 et que des conjugués PP était de 23,2. BAT réalisé avec des conjugués dans des conditions optimisées (concentration des conjugués, le temps de stimulation) permis d&#39;étudier les réactions IgE-dépendante dans l&#39;hypersensibilité aux AINS. Comme le montre la figure 5, seul le PP a été conjugué à même de déclencher l&#39;activation des basophiles visualisés par une régulation positive de l&#39;expression en surface CD63: 20,6% des basophiles ont été activés caractérisée par un journal de changement dans l&#39;intensité de fluorescence. L&#39;IMF a augmenté par un facteur de 4,9 par 386 (témoin négatif) à 1893. En revanche, en utilisant le conjugué DF seulement 3,1% des basophiles ont été activés, qui était inférieur à 5% de coupure. Aussi l&#39;IMF n&#39;a augmenté que d&#39;un facteur 1,1 (limite 2,0) à partir de 197 (témoin négatif) à 210. La validité de dosage est donnée par (i) &lt;5% d&#39;activation des basophiles dans le contrôle négatif, (ii) un journal de changement dans l&#39;intensité de fluorescence d&#39;une sous-population des basophiles, et (iii)&gt; 50% basophiles activés (contrôle positif). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" /> Figure 1. Couplage des dérivés DF et PP à la HSA. Après dissolution de la drogue, l&#39;eau, tampon MES, et EDC (réactif de couplage) sont ajoutés. Les échantillons sont vortexés pendant 1 minute avant de HSA est pipeté aux solutions de drogue. Dans les 2 heures d&#39;agitation à température ambiante, la drogue de façon covalente se lient à la SAH. Monomères ainsi que des agrégats peuvent en résulter. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" /> Figure 2. Calcul des degrés d&#39;accouplement. Tout d&#39;abord, les constantes k RI et UV k sont déterminés. Par conséquent, HSA standard avec une concentration connue est injecté dans le système HPSEC. (Dn / dc) et (DA / DC) de HSA sont donné des valeurs de 0,185 et 0,518, respectivement 5. Les domaines de pointe sont utilisées pour calculer les constantes. Deuxièmement, pour chaque médicament trois normes sont injectés afin de déterminer la drogue et de la concentration et les zones spécifiques du RI UV. Depuis l&#39;IR k et k constantes UV sont connus à partir des étapes précédentes, les dérivés de médicaments spécifiques (dn / dc) et (DA / DC) peut être calculé. Troisièmement, la drogue-SAH conjugués sont injectés dans HPSEC. Les aires des pics obtenus sont utilisés pour calculer les concentrations de médicament et HSA par de pointe en résolvant les deux équations à deux inconnues. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" /> Figure 3. Gating basophiles. Cellules prédit que les lymphocytes sont diffusion latérale fermée par rapport prodiffusion (SSC-FSC parcelle). Les basophiles sont identifiés comme CCR3 Salut lo CSE à partir des lymphocytes gated (SSC-CCR3-PE parcelle). Les basophiles sont analysés pour l&#39;activation (CD63 Salut) dans la parcelle CD63-FITC-CCR3-PE. Le contrôle négatif est utilisé pour définir le seuil maximal des basophiles 2,5% restants CD63 Salut. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" /> Figure 4. Degrés de couplage Déterminé des conjugués drogue. Du RI et les signaux UV montrent deux pics représentant les agrégats (élution à volume faible rétention) et les monomères (élution à un volume élevé de rétention) des médicaments-SAH conjugués. Les pourcentages de monomères et d&#39;agrégats (déterminé à partir des signaux IR) et de leurs degrés de couplage sont représentés (n = 1). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" /> Figure 5. Basophiles Activatile test. Résultats de la drogue conjugué activé échantillons, les contrôles négatifs, et les contrôles positifs sont indiqués dans le CD63-FITC-CCR3-PE parcelles (n = 1).

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

BAT est un bien établis mais pas encore la méthode couramment utilisée pour le diagnostic des IgE maladies allergiques 6,7. Pour hypersensibilité médicamenteuse, toutefois, son application est compromise tant que composés de faible poids moléculaire ne sont pas capables de réticuler récepteurs IgE, une condition préalable à l&#39;activation des basophiles 8. Par conséquent, les médicaments sous enquête doivent être couplés de manière covalente à des protéines porteuses appropriées (par exemple, HSA). Surtout, le degré de couplage (ie le nombre de molécules de médicament par protéine porteuse) doit être contrôlée afin de garantir l&#39;activité immunologique (ie IgE récepteurs de réticulation) de conjugués. Théoriquement, deux haptènes par molécule porteuse doit être suffisante pour le récepteur d&#39;IgE de réticulation et aussi peu que cinq molécules DF par HSA a été démontré pour déclencher la libération du médiateur dans un test basé sur des cellules 4. Les deux conjugués, PP-HSA et HSA-DF, ont été déterminés à afficher un degré de couplage suffisamment élevée (HPSEC) et d&#39;être immunologiquement actives rendant réactifs appropriés pour l&#39;utilisation des MTD. Une autre question peut être que les métabolites de médicaments peuvent jouer un rôle, comme un métabolite plutôt que de la molécule mère peut provoquer la réaction d&#39;hypersensibilité. En cas de DF, cette possibilité a été préalablement évalué en détail l&#39;aide de cinq Phase I majeurs métabolites et une variante de liaison 4. Les facteurs importants pour la maîtrise de la technique décrite notamment la qualité de l&#39;échantillon de sang (&lt;12 heures depuis la collecte de sang, le nombre de basophiles détectée&gt; 500) et l&#39;optimisation des conditions de stimulation (temps, dose). En outre, les soi-disant non-répondeurs qui n&#39;ont même pas réagir avec le contrôle positif (anticorps dirigé contre le récepteur des IgE) doivent être identifiés. Par conséquent, les critères de validation ont d&#39;inclure un anticorps anti-FceRI comme témoin positif. Un avantage important de l&#39;utilisation de conjugués drogue est le fait qu&#39;elles apparaissent non toxique, contrairement aux médicaments purs, comme le montre pour DF-HSA conjugué par la co-stimulation avec des anticorps anti-FceRI BAT 4. Pur DF, en revanche, affiche des effets cytotoxiques à une concentration de 1,25 mg / ml causant des problèmes avec l&#39;interprétabilité des MTD 9. Généralement, les tests de cytotoxicité potentielle est fortement recommandé pour tous les médicaments nouvellement produites conjugué. Ici, nous avons montré le potentiel de la PP-HSA conjugué utilisé dans les MTD pour révéler une hypersensibilité médiée par les IgE. En revanche, DF hypersensibilité n&#39;est pas associé avec les IgE démontrée par l&#39;absence d&#39;activation des basophiles en réponse à DF-HSA conjugué. Surtout, en cas d&#39;incertitude concernant un mécanisme IgE-médiée, conjugués doivent être évaluées pour l&#39;activité immunologique par des systèmes de test in vitro de cellules à base comme cela a été montré pour DF 4. Utilisation de la configuration décrite de conjuguer médicaments à bas poids moléculaire covalente à la protéine porteuse appropriée molécules d&#39;un certain nombre de réactions d&#39;hypersensibilité, y compris contre les drogues antibiotiques, d&#39;autres AINS, contraste radiologique des médias, des relaxants musculaires, des anesthésiques, etc peuvent être étudiés pour une participation d&#39;une IgE mécanisme. Par conséquent, les MTD peuvent servir comme un complément aux méthodes existantes de diagnostic (test cutané, des tests de provocation orale).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif / appareil </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> 2 - (N-morpholino) éthanesulfonique </td><td> Sigma </td><td> M3671 </td><td> - </td></tr><tr><td> 7,8 x 300 mm gel TSK -G2000SWXL colonne </td><td> Bioscience Tosoh </td><td> 08540 </td><td> - </td></tr><tr><td> BD FACSCanto II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 338962 </td><td> - </td></tr><tr><td> Centrifugeuse de paillasse </td><td> Sigma </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Sel de sodium de diclofénac </td><td> Sigma </td><td> D6899 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA Vacutainer </td><td> Becton Dickinson </td><td> 368589 </td><td> - </td></tr><tr><td> Flow2 Kit CAST </td><td> Laboratoires Bühlmann </td><td> FK-CCR </td><td> Efficace kit CAST Juin 14, 2011 Flow2 est maintenant un sort de débit </td></tr><tr><td> HP1100 système HPLC </td><td> Hewlett Packard </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Albumine sérique humaine </td><td> Sigma </td><td> A9511 </td><td> - </td></tr><tr><td> Centrifugeuse de laboratoire </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> N-éthyl-N&#39;-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) </td><td> Sigma </td><td> E6383 </td><td> - </td></tr><tr><td> Comprimés PBS </td><td> AppliChem </td><td> A9199 </td><td> - </td></tr><tr><td> Dérivés propyphenazone </td><td> Département de Biologie Moléculaire, Université de Salzbourg, Autriche </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Shaker </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> L&#39;azide de sodium </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> - </td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td><td> - </td></tr><tr><td> Carbonate acide de sodium </td><td> Sigma </td><td> 90421C </td><td> - </td></tr><tr><td> Sodium hydroxyde </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td> - </td></tr><tr><td> Le phosphate de sodium </td><td> Sigma </td><td> 342483 </td><td> - </td></tr><tr><td> Matrice de détecteurs Triple </td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> - </td></tr><tr><td> BioVortex personnels V-1 plus </td><td> Peqlab </td><td> 90-V-1 </td><td> - </td></tr><tr><td> 1012 Bain-marie </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

basophil activation test for investigation of ige-mediated mechanisms in drug hypersensitivity

Des réactions d&#39;hypersensibilité contre le non-stéroïdiens anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) tels que propyphenazone (PP) et le diclofénac (DF) peut se manifester comme de type I-like réactions allergiques 1. En pratique clinique, le diagnostic d&#39;hypersensibilité médicamenteuse est principalement effectué par les antécédents du patient, comme les tests cutanés ne sont pas fiables et les tests de provocation orale porte des risques mortels pour les 2 patients. Par conséquent, les preuves d&#39;un sous-jacent IgE pathomécanisme est difficile à obtenir. Ici, nous présentons une méthode in vitro basée sur l&#39;utilisation des basophiles humains issus de patients hypersensibles aux médicaments qui imite la réaction allergique effectrices in vivo. Comme les basophiles de drogue chez les patients allergiques porter des molécules d&#39;IgE spécifiques pour le médicament coupable, ils deviennent activés lors de réticulation du récepteur d&#39;IgE et la libération des molécules effectrices allergiques. L&#39;activation des basophiles peut être contrôlé par la détermination de la régulation positive de l&#39;expression en surface CD63 en utilisant la cytométrie en flux 3. Dans le cas de médicaments de faible poids moléculaire, conjugués sont conçus pour permettre la reticulation des récepteurs IgE sur les basophiles. Comme le montre la figure 1, deux représentants des AINS, PP et DF, sont liés de manière covalente à l&#39;albumine sérique humaine (HSA) par un groupe carboxyle réagir avec le groupe amino primaire des résidus lysine. DF porte un groupe carboxyle intrinsèques et, par conséquent, peut être utilisé directement 4, alors un groupe contenant carboxyle dérivé du PP a dû être synthétisés organochemically avant l&#39;étude 1. Le degré de couplage des composés de faible poids moléculaire de la molécule de protéine porteuse et leur répartition spatiale est important de garantir réticulation de deux molécules réceptrices IgE. Le protocole décrit ici s&#39;applique chromatographie d&#39;exclusion haute performance de taille (HPSEC) équipé d&#39;un indice de réfraction séquentielle (RI) et ultra violet (UV) système de détection pour la détermination du degré de couplage. Comme la méthodologie décrite peut être appliquée pour d&#39;autres drogues, le test d&#39;activation des basophiles (BAT) porte le potentiel d&#39;être utilisé pour la détermination des IgE dans les mécanismes d&#39;hypersensibilité médicamenteuse. Ici, nous déterminons que PP hypersensibilité IgE médiée et hypersensibilité DF comme non IgE médiée par BAT.

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Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

De test d&#39;activation des basophiles est un outil puissant pour la détection des allergies IgE-dépendante<em&gt; In vitro</em&gt;. Ici, un protocole optimisé pour le test d&#39;activation des basophiles est utilisée pour étudier hypersensibilité médicamenteuse. Une méthode pour la production efficace de covalentes drogue-protéine conjugués et leur caractérisation physico-chimique est décrite.

Test d&#39;activation des basophiles pour l&#39;enquête des IgE dans les mécanismes d&#39;hypersensibilité médicamenteuse

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

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33.3K vues.  University of Salzburg. De test d'activation des basophiles est un outil puissant pour la détection des allergies IgE-dépendante In vitro. Ici, un protocole optimisé pour le test d'activation des basophiles est utilisée pour étudier hypersensibilité médicamenteuse. Une méthode pour la production efficace de covalentes drogue-protéine conjugués et leur caractérisation physico-chimique est décrite.

Vidéo: Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modèle murin de CD40-activation des cellules B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Recherche

Immunologie et infection

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Drug faciliter la découverte: Un test automatisé inflammation Haute-contenu chez le poisson zèbre

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

Trans-vivo de type hypersensibilité retardée test pour le règlement spécifique de l&#39;antigène

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Activation et évaluation de NLRP3 Inflammasome activité de l&#39;IL-1β Utilisation dans des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Statique Essai d&#39;adhésion pour l&#39;étude de l&#39;intégrine activation dans les lymphocytes T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Haut-débit quantitative en temps réel RT-PCR analyse pour déterminer les profils d&#39;expression de types I et III sous-types d&#39;interféron

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

In vivo Investigation of Antimicrobial Therapy Blue Light pour multirésistante Acinetobacter baumannii Gravez Infections En utilisant l&#39; imagerie par bioluminescence

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients with autoimmune hepatitis. The overwhelming majority of patients with DIH are women. The underlying mechanisms of these sex differences in prevalence are unclear because of the paucity of animal models that mimic human disease. Even so, underlying mechanisms are widely believed to be associated with human leukocyte antigen haplotypes and sex hormones. In contrast, using a DIH mouse model, we have uncovered that IL-4 initiated&#160;CD4+ T cells directed against an epitope of cytochrome P450 2E1 induces influx of neutrophils, macrophages and mast cells into the livers of female BALB/c mice. Using this model, we have also shown that IL-33-induced FoxP3+regulatory T cells confer protection against DIH in female and male mice. This DIH model is induced by immunizing mice with an epitope of CYP2E1 that has been covalently altered with a drug metabolite that has been associated with DIH. This epitope is recognized by patients with DIH. Our method induces robust and reproducible hepatitis and autoantibodies that can be utilized to study the pathogenesis of DIH. While in vivo studies can cause undue pain and distress in mice when done improperly, the advantage of an in vivo model is the ability to evaluate the pathogenesis of disease in a large number of mice. Additionally, biological effects of the altered liver proteins can be studied using invasive procedures. The addition of in vitro studies to the experimental design allows rapid repetition and mechanistic analysis at a cellular level. Thus, we will demonstrate our model protocol and how it can be utilized to study in vivo and in vitro mechanisms of DIH.

We describe an in vivo immunization, translational hepatitis model in BALB/c mice that can be utilized to study the pathogenesis of drug-induced autoimmune hepatitis including sex differences seen in this disease. We will describe how this model demonstrates reproducible analyses using in vivo and in vitro experimental techniques.

Induction d’une hépatite auto-immune induite par des médicaments chez des souris BALB/c pour l’étude de ses mécanismes pathogènes

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.