דגם orthotopic של סרטן השחלות הצפק ב עכברים immunocompetent עבור In vivo הדמיה ניטור הגידול של המערכת החיסונית גידול

Summary

כדי ללמוד In vivo צמיחת הגידול microenvironment הגידול, השתמשנו במודל עכבר syngeneic ו orthotopic של סרטן השחלות בחיות immunocompetent. אנו transduced גידול העכבר התא קו (MOV1) עם חלבון פלואורסצנטי Katushka (MOV1 ^קאט) והנה אנחנו מראים השתלת orthotopic שלה בשחלה ו In vivo הדמיה.

Abstract

רקע: סרטן השחלות מאובחנת בדרך כלל בשלב מתקדם שבו היחס במקרה / הרוגים גבוה ונותר הקטלני ביותר של כל ממאירויות גניקולוגיים בקרב נשים בארה"ב ^1,2,3. גידולים הצפק הן הצורות הנפוצות ביותר של סרטן השחלות ^4,5 Tg-MISIIR-Tag מהונדס מייצג את מודל העכבר רק באופן ספונטני מפתחת סוג זה של גידולים. Tg-MISIIR-Tag עכברים להביע SV40 הפיכת האזור תחת שליטה של Mullerian מעכבות סוג חומר II קולטן (MISIIR) מקדם הגן ^6. קווי מהונדס נוספים זוהו לבטא את transgene תג SV40, אך אינם מפתחים גידולים השחלות. ללא גידול עכברים נוטה להפגין תוחלת החיים האופייני C57Bl / 6 עכברים פוריים. עכברים אלו יכולים לשמש מקבלי allograft syngeneic עבור תאים סרטניים שבודדו Tg-MISIIR-Tag-DR26 עכברים.

המטרה: למרות הגידול הדמיה אפשרי ^7, לגילוי מוקדם של גידולים עמוקים מאתגרת בבעלי חיים חיים קטנים. כדי לאפשר מחקרים פרה במודל חיה שלם immunologically לסרטן השחלות הצפק, אנו מתארים במודל עכבר syngeneic עבור סוג זה של סרטן השחלות המאפשר הדמיה in vivo, מחקרים של microenvironment את הגידול ואת התגובה החיסונית הגידול.

שיטות: אנחנו הראשונים נגזר + תג עכבר סרטן תאים קו (MOV1) מן הגידול השחלות ספונטנית שנבצרו נקבה בת 26 בשבוע Tg-MISIIR DR26-Tag. לאחר מכן, אנו ביציבות transduced MOV1 תאים עם וקטור TurboFP635 Lentivirus יונקים המקודד Katushka, מוטציה מרחיקות אדום של חלבון פלואורסצנטי אדום מהים כלנית Entacmaea quadricolor עם עירור / פליטה מקסימום 588/635 ננומטר ב ^8,9,10. אנו orthotopically מושתל MOV1 ^קאט בשחלה ^11,12,13,14 שאינם סרטניים Tg-MISIIR-Tag הנשי נוטה עכברים. התקדמות הגידול בעקבות הדמיה אופטית vivo ו microenvironment הגידול נותח על ידי אימונוהיסטוכימיה.

תוצאות: מושתל Orthotopically MOV1 תאים ^קאט פיתחו גידולים השחלות הצפק. MOV1 גידולים ^קאט יכול להיות דמיינו ידי in vivo הדמיה עד שלושה שבועות לאחר ההשתלה (איור 1) והם הסתננו עם לויקוציטים, כפי שנצפה ב סרטן השחלות אדם ¹⁵ (איור 2).

מסקנות: אנו מתארים מודל orthotopic של סרטן השחלות מתאים בתחום ההדמיה vivo של גידולים מוקדם עקב גבוה-pH יציבות photostability של Katushka ברקמות עמוקות. אנו מציעים להשתמש במודל זה syngeneic הרומן של סרטן שחלות נסיובי עבור במחקרים vivo הדמיה וניטור של המערכת החיסונית ואת immunotherapies הגידול.

Protocol

1. תא תרבות

1. לפני הזרקת תרבות orthotopic, MOV1 תאים ^קאט, נגזר DR26 גידולים, בבקבוק T175 עד שהם 90% ומחוברות. תוכנית להשתמש 1-5000000 תאים לכל הזרקה, אשר יחייב 1 או 2 T175 צלוחיות.
2. ביום של הזריקה, לקצור את התאים לקבוע את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
3. לאחר ריכוז התא נקבע, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 גרם X בטמפרטורת החדר.
4. בעקבות הספין, resuspend התאים יש 1 מיליון 10 מיקרוליטר של PBS סטרילי עם 0.002 M EDTA

2. טרום ניתוח

1. לפני הניתוח, למלא מזרק אינסולין 3/10cc עם תאים 1,000,000 ^MOV1-קאט 10 מיקרוליטר של PBS EDTA.
2. העברת העכבר הרדים isofluorane על כרית חימום. הוסף משחה עין על מנת למנוע התייבשות העין. ואז, מיד להכניס את הראש של החיה למערכת האף קונוס מחובר מאדה isoflurane לספק הרדמה במהלך הניתוח.
3. לאחר חיטוי של הזריקה עם מטליות אלכוהול, תת עורי להזריק 5 מ"ג / ק"ג של Ketoprofen, משכך כאבים טרום ניתוחית, עם מזרק אינסולין 3/10cc.
4. בעזרת קוצץ, לגלח את החלק השמאלי של הזנב dorsum מצומת thoracolumbar לבסיס של הזנב בעלי חיים. החל קרם להסרת שיער להסיר לחלוטין את השיער. לאחר מכן, להסיר את עודפי עם מגבת נייר רטובה.
5. פעם את השיער הוסר, לחטא את האזור מגולח עם יוד povidone ו מטליות אלכוהול. ואז, במקום לעטוף כירורגית סביב האזור של החתך.

3. כירורגיה

1. ממש לפני הניתוח, להתאים את רמות מאדה isoflurane ל -1.5%.
2. ודא כי בעל החיים הוא מורדם לחלוטין על ידי צובט את כרית כף הרגל.
3. בשלב הבא, לאתר את הטחול מתחת לעור. ואז באמצעות מספריים כירורגית, לעשות חתך דורסולטרלי 1-2 ס"מ בפינה הימנית העליונה של הטחול.
4. מנתחים את retroperitoneum. כרית המקיף את השחלה עכבר יקויימו. שימוש במלקחיים מעוקל לתפוס ולחשוף את כרית השומן המקיף את השחלה העכבר.
5. איבר מימה עם כמה טיפות של PBS סטרילית.
6. שימוש במלקחיים מעוקל לתפוס, לסגת ... עמדה ... ואז לאבטח את השחלה להזרקה
7. אמנם אוחז בחוזקה את השחלה עם המלקחיים, להזריק 10 מיקרוליטר של ^קאט MOV1 תאים סרטניים לתוך השחלה. הבנה טובה תמנע זליגת נוזל או regurgitation.
8. מיד לאחר ההזרקה, לשחרר את המתח המופעל על ידי מלקחיים. ניקוב בשחלה צריך ספונטני לחזור ולסגור.
9. שימוש תפר חומצה נספגים Polyglycolic מחוברת מחט, לסגור את הפצע רטרו הצפק.
10. שחרר את החיה מן חרוט האף.
11. למתוח את העור לאטום את קצוות הפצע דורסולטרלי עם כמה טיפות של דבק רקמות.
12. לבסוף, בעל פה לנהל 100 מיקרוליטר של אנטיביוטיקה לחיה. ואז למקם אותו לכלוב שלו לפקח על ההתאוששות. שמור על בעלי חיים על אנטיביוטיקה במי השתייה למשך שבוע.

4. Vivo הדמיה

1. שבוע לאחר ההזרקה orthotopic של ^קאט MOV1 תאים סרטניים, לבצע הדמיה vivo. בגין על ידי העברת העכבר הרדים isofluorane לחדר ההדמיה.
2. הפעל את רמת מאדה isoflurane עד 2%.
3. בצע in vivo הדמיה בהתאם להוראות מערכת הדמיה של היצרן. בסרטון זה, המערכת לומינה ישמש.
4. לתמונה, לחץ על תמונה Living תוכנה סמל בשולחן העבודה. ואז, על לוח הבקרה רכישת IVIS, בחר "אתחול". ההגדרות הן מכשיר מקביל הגדרות המצלמה
5. בלוח הבקרה רכישת להגדיר פרמטרים הרכישה של המכשיר. לגבי הקרינה, המחאה "פלורסנט". לחץ על תיבת צילום לרכוש תמונה עם כל תמונה.
6. לאחר מכן, לקבוע את זמן החשיפה כפי אוטומטי. תחת "binning פיקסל או CCD ברזולוציה", לבדוק "בינוני". אז תחת F / להפסיק או הצמצם, לבדוק את הערך של 2. הבא, בחר את המסנן עירור 535 ואת מסנן פליטה DsRed.
7. תחת שדה הראיה, לחץ על View B לתמונה עכבר אחת.
8. לאחר מכן, לחץ על לרכוש כדי להתחיל את רכישת התמונה.
9. לאחר רכישת התמונה הושלמה, השתמש אזור ריבית, או החזר על ההשקעה, כלי למדוד את האות. לחץ על הסמל מדידה לשחרר את ערכי האות אזור.
10. לבסוף, לחצו על "שמור" כדי לשמור את התמונה בתיקיית המשתמש
11. אחרי התמונות נשמרו, להפסיק את מתן isoflurane ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה. העכבר צריך להתעורר מיד.

5. נציג תוצאות

, שימוש בפרוטוקול זה, הגידול in vivo של סרטן השחלות orthotopic ניתן לנטר לפחות 3 שבועות באמצעות הליך פולשני.

באיור 1. MOV1 תאים ^קאט, או PBS כביקורת שלילית, הוזרקו orthotopically לתוך השחלה הלא סרטניים בעכברים מועדים (חיה הנכון חיה שמאל בהתאמה). In vivo הדמיה בוצעה 2 שבועות מאוחר יותר. פליטת הקרינה הנוצר על ידי תאים MOV1 ^קאט engrafted בשחלה היה נמדד בהשוואה מהעכבר בקרה שלילית.

איור 2. סעיפים קפואים של MOV1 גידולים ^קאט השחלות הוכתמו אנטי CD4 biotinylated MAB ואחריו המצע DAB (חום כהה) כדי לזהות לימפוציטים חדירה הגידול (חץ שחור). תאים היו counterstained עם מתיל ירוק לדמיין גרעיני תאים (כחול). תאים סרטניים (חצים אדומים) היו ברורים מורפולוגית מתאי T. השקופית מופיע בהגדלה 40X.

Discussion

ניתוח וזריקות orthotopic

הזרקת orthotopic בבורסה השחלות דרישות הכשרה דיוק. כך

1. במקרה של עניים בפועל כירורגית ניסיון, עם גופות הראשון.
2. השתמש מעדיפים נקבות multiparous (א...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-GLUTAMAX	Invitrogen	10564-011
PBS	GIBCO, by Life Technologies	14040
Versene	Lonza Inc.	17-711E
Heating pad	Deltaphase	39 DP
Povidone pads	Dynarex	1108
Alcohol pads	Fisher Scientific	06-669-62
Artificial tears ointment	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	17845-153
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
3cc/insulin syringe	BD Biosciences	309301
Polyg Polyglycolic Acid suture/needle (3/8 19mm)	Syneture	9612-31
Tissue adhesive	Vetbond	3M
Vet Bactrim/ oral suspension	Hi-tech Pharmacal	840823
IVIS-Lumina	Caliper Life Sciences
Isofluorane	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	J108013
Fetal Bovine Serum, Qualified	Invitrogen	10437036
Penicillin/streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140
TurboFP635 mammalian vector	Evrogen	FP721
T175 flasks	cellstar	660-190