Un modelo ortotópico de cáncer de ovario seroso en ratones inmunocompetentes para In vivo Imágenes y seguimiento de tumores de las respuestas inmunitarias del tumor

Resumen

Para el estudio de In vivo El crecimiento del tumor y el microambiente del tumor, se utilizó un modelo de ratón y singénico ortotópico de cáncer de ovario en los animales inmunocompetentes. Nos transducidas un tumor de ratón línea celular (MOV1) con Katushka proteína fluorescente (MOV1 ^KAT) Y aquí se muestra su implantación ortotópica en el ovario y In vivo Imágenes.

Resumen

Antecedentes: El cáncer de ovario se diagnostica generalmente en una etapa avanzada, donde la proporción de casos / mortalidad es alta y por lo tanto sigue siendo el más letal de todos los cánceres ginecológicos entre los EE.UU. las mujeres ^1,2,3. Los tumores serosos son las formas más generalizadas de cáncer de ovario y el ^4,5 transgénicos Tg-MISIIR-TAG representa el modelo de ratón sólo que de forma espontánea se desarrolla este tipo de tumores. Tg-MISIIR-TAG ratones expresan SV40 región transformación bajo control de la sustancia inhibitoria de Müller tipo de receptor II (MISIIR) promotor del gen ^6. Otras líneas transgénicas se han identificado que expresan el transgén etiqueta SV40, pero no desarrollan tumores en los ovarios. No tumorales ratones propensos exhibición típica vida de los ratones C57BL / 6 y son fértiles. Estos ratones se puede utilizar como receptores de aloinjertos singénico de células tumorales aisladas de Tg-MISIIR-Tag-DR26 ratones.

Objetivo: A pesar de imagen del tumor es posible ^7, la detección temprana de los tumores profundos es un reto en animales vivos pequeños. Para permitir que los estudios preclínicos en modelos animales inmunológicamente intactos para el cáncer de ovario seroso, se describe un modelo de ratón singénico para este tipo de cáncer de ovario, que permite imágenes in vivo, los estudios del microambiente del tumor y el tumor de la respuesta inmune.

Métodos: En primer lugar, obtuvo un tag + ratón línea celular de cáncer (MOV1) de un tumor ovárico espontáneo recolectadas en un 26 semanas de edad Tg-DR26 MISIIR-Tag mujeres. Luego, de forma estable transduced MOV1 células con el vector Lentivirus TurboFP635 mamíferos que codifica Katushka, un mutante rojo lejano de la proteína fluorescente roja de la anémona de mar Entacmaea quadricolor con excitación / emisión máxima a 588/635 nm ^8,9,10. Hemos implantado ortotópicamente MOV1 ^Kat en el ovario ^11,12,13,14 de no tumorales propensos Tg-MISIIR-TAG ratones hembra. La progresión del tumor fue seguido por imágenes in vivo óptica y microambiente tumoral se analizó mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Resultados: ortotópicamente implantado células MOV1 ^Kat desarrollaron tumores serosos de ovario. MOV1 tumores ^Kat puede ser visualizado por imágenes in vivo de hasta tres semanas después de la implantación (fig. 1) y se infiltraron con los leucocitos, como se observa en el cáncer de ovario humano ¹⁵ (fig. 2).

Conclusiones: Se describe un modelo ortotópico de cáncer de ovario adecuado para imágenes in vivo de tumores antes de tiempo debido a los altos de pH estabilidad y fotoestabilidad de Katushka en los tejidos profundos. Se propone el uso de este nuevo modelo singénico de cáncer de ovario seroso en los estudios de imágenes in vivo y seguimiento de los tumores la respuesta inmune e inmunoterapias.

Protocolo

1. Cultivo de células

1. Antes de la inyección ortotópico, la cultura MOV1 células ^Kat, derivada de los tumores DR26, en un matraz T175 hasta que el 90% confluente. Plan para usar de 1 a 5 millones de células por inyección, lo que requiere de 1 o 2 frascos T175.
2. En el día de la inyección, la cosecha de las células y determinar el número de células con un hemocitómetro.
3. Una vez que la concentración celular se ha determinado, que sedimenten las células por centrifugación durante 5 minutos a 300 x g a temperatura ambiente.
4. Después de la vuelta, volver a suspender las células tienen 1 millón en 10 microlitros de PBS estéril con EDTA 0,002 M

2. Antes de la cirugía

1. Antes de la cirugía, llenar una jeringa de insulina 3/10cc con 1 millón de ^MOV1-Kat células en 10 microlitros de PBS con EDTA.
2. La transferencia de un ratón anestesiado con isofluorano a una compresa caliente. Añadir ungüento para los ojos para evitar la deshidratación del ojo. Luego, inmediatamente inserte la cabeza del animal en un sistema de cono conectada a un vaporizador de isoflurano para entregar la anestesia durante la cirugía.
3. Después de la desinfección del sitio de la inyección con alcohol, por vía subcutánea inyectar 5 mg / kg de ketoprofeno, un analgésico antes de la cirugía, con una jeringa de insulina 3/10cc.
4. Usando las podadoras, afeitarse la parte izquierda de caudal en el dorso de la unión toracolumbar a la base de la cola animal. Aplicar crema de depilación para eliminar por completo el cabello. A continuación, retire el exceso con una toalla de papel húmeda.
5. Una vez que el pelo se ha eliminado, esterilizar el área afeitada con povidona yodada y torundas con alcohol. Luego, coloque un paño quirúrgico en la zona de la incisión.

3. Cirugía

1. Justo antes de la cirugía, ajustar los niveles de vaporizador isoflurano al 1,5%.
2. Verificar que el animal está completamente anestesiado por pellizcar la almohadilla plantar.
3. A continuación, busque el bazo debajo de la piel. Luego, utilizando tijeras quirúrgicas, hacer una incisión dorsolateral 1-2 cm de largo en la parte superior derecha del bazo.
4. Disecar el retroperitoneo. La almohadilla alrededor del ovario de ratón se observó. Use pinzas curvas de captar y exponer la almohadilla de grasa que rodea el ovario de ratón.
5. Hidratar el órgano con unas gotas de PBS estéril.
6. Use pinzas curvas de entender, se retracte de la posición ... ... y luego se asegura el ovario para la inyección
7. Mientras que las palancas del ovario con las pinzas, inyectar 10 microlitros de células tumorales MOV1 ^Kat en el ovario. Un conocimiento firme voluntad evitar la regurgitación de líquidos o fugas.
8. Inmediatamente después de la inyección, la liberación de la tensión ejercida por el fórceps. La perforación en el ovario de forma espontánea debe retractarse y cerrar.
9. Usando una sutura absorbible de ácido poliglicólico unido a una aguja, cerrar la herida retro-peritoneo.
10. Liberar al animal del cono de la nariz.
11. Estire la piel y sellar los bordes de heridas dorsolateral con unas gotas de adhesivo tisular.
12. Finalmente, por vía oral administrar 100 microlitros de antibióticos a los animales. Luego se coloca de nuevo en su jaula y el monitor para la recuperación. Mantener al animal de los antibióticos en el agua de beber durante una semana.

4. Imágenes in vivo

1. Una semana después de la inyección ortotópico de células tumorales MOV1 ^Kat, realizar imágenes in vivo. Comience por la transferencia de un ratón anestesiado con isofluorano a la cámara de imágenes.
2. Baje el volumen del vaporizador isoflurano al 2%.
3. Realizar imágenes in vivo de acuerdo a las instrucciones del fabricante del sistema de imágenes de. En este video, el sistema de Lumina se utilizará.
4. A la imagen, haga clic en la imagen viva de software icono en el escritorio. Luego, en el Panel de control IVIS adquisición, seleccione "Ejecutar". Los ajustes de los instrumentos son análogos a una configuración de la cámara
5. En el Panel de Control de la adquisición de configurar los parámetros del instrumento de adquisición. De fluorescencia, marca "fluorescentes". Haga clic en la casilla de Fotografía para adquirir una fotografía con cada imagen.
6. A continuación, establezca el tiempo de exposición como Auto. En "pixel binning o resolución CCD", marque "Medium". A continuación, en F / parada o apertura, comprobar el valor de 2. A continuación, seleccione el filtro de excitación de 535 y el filtro de emisiones DsRed.
7. En el campo de visión, haga clic en Ver B a la imagen de un ratón.
8. A continuación, haga clic en adquirir para iniciar la adquisición de la imagen.
9. Una vez que la adquisición de la imagen es completa, el uso de la Región de interés o retorno de la inversión, la herramienta de medida de la señal. Haga clic en el icono de medida para liberar los valores de la señal y el área.
10. Por último, haga clic en "Guardar" para guardar la imagen en la carpeta de usuario
11. Después de las imágenes se han guardado, interrumpa la administración de isoflurano y devolver el ratón a su jaula. El ratón debe despertar de inmediato.

5. Resultados representante

-El uso de este protocolo, El crecimiento in vivo de un cáncer de ovario ortotópico puede ser monitoreado por lo menos 3 semanas con un procedimiento no invasivo.

Figura 1. MOV1 células ^Kat, o PBS como control negativo, se inyectaron ortotópicamente en el ovario de no tumorales ratones propensos (derecho de los animales y de los animales a la izquierda y, respectivamente). In vivo de imágenes se realizó después de 2 semanas. La emisión de fluorescencia generada por las células MOV1 ^Kat injertado en el ovario se midió y comparó con la de ratones control negativo.

Figura 2. Las secciones congeladas de tumores de ovario MOV1 ^Kat fueron teñidas con biotina anti-CD4 mAb de seguido de sustrato DAB (marrón oscuro) para detectar la infiltración tumoral de linfocitos (flecha negro). Las células fueron contrastados con metil-verde para visualizar los núcleos de células (azul). Las células tumorales (flechas rojas) fueron morfológicamente distinta de las células T. La diapositiva aparece magnificado 40x.

Discusión

Cirugía y las inyecciones ortotópico

Inyección ortotópica en bolsa ovárica demandas de formación y precisión. Así

1. En el caso de los pobres de la experiencia práctica quirúrgica, con cadáveres en primer lugar.
2. Usar preferentemente mujeres multíparas (uno o dos litros) a medida que desarrollan los ovarios más grandes con el tiempo que facilita la inyección y aumentar la supervivencia de comparar con las mujeres nulíparas.
3. Debido al pequeño tamaño...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-GLUTAMAX	Invitrogen	10564-011
PBS	GIBCO, by Life Technologies	14040
Versene	Lonza Inc.	17-711E
Heating pad	Deltaphase	39 DP
Povidone pads	Dynarex	1108
Alcohol pads	Fisher Scientific	06-669-62
Artificial tears ointment	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	17845-153
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
3cc/insulin syringe	BD Biosciences	309301
Polyg Polyglycolic Acid suture/needle (3/8 19mm)	Syneture	9612-31
Tissue adhesive	Vetbond	3M
Vet Bactrim/ oral suspension	Hi-tech Pharmacal	840823
IVIS-Lumina	Caliper Life Sciences
Isofluorane	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	J108013
Fetal Bovine Serum, Qualified	Invitrogen	10437036
Penicillin/streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140
TurboFP635 mammalian vector	Evrogen	FP721
T175 flasks	cellstar	660-190