מסלולי לימוד Cell רולינג על דפוסי קולטן אסימטרית

Summary

אנו מתארים פרוטוקול להתבונן ולנתח מסלולי מתגלגל תאים על מצעים בדוגמת אסימטרית הקולטן. את הנתונים המתקבלים שימושיים ההנדסה של הקולטן בדוגמת מצעים להפרדה-תווית חינם התא ניתוח.

Abstract

תזוזה רוחבית של תאים אורתוגונליים כדי להזרים זרם על ידי גלגול על דפוסי קולטן אסימטרית מהווה הזדמנות לפיתוח של מכשירים חדשים ההפרדה תווית חינם ניתוח של תאים ^1. מכשירים כאלה עשויים להשתמש תזוזה לרוחב הפרדה רצוף זרימה, או דפוסי קולטן כי לווסת הידבקות להבחין בין פנוטיפים תאים שונים או רמות של ביטוי הקולטן. הבנת טבעה של מסלולי מתגלגל על ​​קולטן תא בדוגמת מצעים הכרחי ההנדסה של מצעים ועיצוב של מכשירים כאלה.

הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול לחקר מסלולי התא מתגלגל על דפוסי קולטן אסימטרית התומכים הידבקות התא מתגלגל ^2. מוגדרים היטב, מיקרומטר בקנה מידה דפוסי P-selectin רצפטורים היו מפוברקות באמצעות הדפסה microcontact על מצופה זהב שקופיות שולבו בחדר זרימה. HL60 תאים המבטאים את ליגנד PSGL-1 ³ היו זרמו על פני השדה של קווים בדוגמת ו דמיינו על הפוך מיקרוסקופ שדה בהיר. התאים התגלגל מסומנים בשולי נוטה דפוסים, וכתוצאה מכך סטיה לרוחב ^1. כל תא התגלגל בדרך כלל במרחק מסוים לאורך שולי התבנית (כהגדרתו אורך מעקב קצה), מנותקת מן הקצה, והעלה שוב לדפוס במורד הזרם. למרות ניתוק זה מקשה לעקוב אחר מסלול שלם של תא מהכניסה ליציאה בחדר זרימה, חלקיק מעקב התוכנה שימשה לנתח התשואה מסלולי גלגול של התאים בתקופה שבה הם נעים על קולטן אחד בדוגמת קו. מסלולי נבדקו ואז לקבל הפצות של גלגול מהירויות התא אורכי קצה מעקב עבור כל תא של דפוסים שונים.

פרוטוקול זה שימושי לכימות מסלולים תא מתגלגל על ​​דפוסי הקולטן הקשור אלה פרמטרים הנדסיים כגון זווית דפוס מתח גזירה. נתונים אלה יהיה שימושי עבור העיצוב של התקנים microfluidic להפרדת-תווית חינם התא ניתוח.

Protocol

1. HL60 תא מתגלגל

1.1. המצאה של Patterned מצעים.

1. באמצעות הדפסה microcontact (μCP) ^4-7 לבצע לסירוגין עצמית התאספו monolayers (Sams) של מולקולות PEG על מצופה זהב שקופיות הזכוכית: לפברק הדפסה microcontact polydimethylsiloxane (PDMS) חותמות אשר הגדיר את דפוסי קולטן עם זווית הנטייה של α = 10 ° על ידי תהליך SU 8 דפוס. נקו את משטח זהב עם פתרון פיראניה (03:01 תערובת של חומצה גופרתית על חמצן ומימן 30%) למשך 20 דקות ולאחר מכן לשטוף את המשטח עם מים די שופע ב 24.5 מעלות לפני השימוש. דיו חותמת PDMS עם פתרון PEG 5mm באתנול. יבש חותמת באוויר במשך 20 דקות. בעדינות לשים את החותמת על פני השטח זהב עבור 40 שניות ולוודא שיש מגע טוב בין משטח זהב חותמת. אין לחץ עודף נדרשת. יש לשטוף את המשטח עם אתנול לייבש אותו תחת זרם של N _2.
2. דגירה המצע בתוך פתרון P-selectin (15 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב DPBS) באמצעות תא זלוף (מדעי מיקרוסקופית אלקטרונים) במשך 3 שעות ב 24.5 ° C לדפוס אזורים שנותרו עם selectin-P. יש לשטוף את המשטח עם DPBS שופע.
3. למילוי השטח עם ארגון ה-BSA (1 מ"ג / מ"ל ​​ב DPBS) עבור h 1 לחסום הלא ספציפית אינטראקציות. יש לשטוף את המשטח עם DPBS שופע.

1.2. תא רולינג ניסויים בחדר זרימה.

1. תזרים השעיה של HL60 תאים (~ 10 ⁵ תאים / מ"ל) על משטחים בדוגמת בתא תזרים מלבני (Glycotech, Inc; רוחב w = 1.0 ס"מ, אורך = 6 ס"מ, גובה h = 0.0127 ס"מ) על 24.5 ° C. השתמש משאבת מזרק (Precision Instruments העולם, SP230IW) כדי לייצר קצב הזרימה של μL 75 / דקה, עם הלחץ גזירה המקביל סביב 0.5 dyn / ² ס"מ (~ 0.05 אבא). חישוב מתח גזירה τ באמצעות מטוס תזרים Poiseuille המשוואה τ = 6μQ/wh ^2, שם μ הוא צמיגות kinematic (0.001002 אבא ים), Q הוא קצב הזרימה volumetric, W הוא רוחב של תא הזרימה, h הוא גובה תא זרימה.
2. שימוש במיקרוסקופ הפוכה (ניקון TE2000-U) עם מצלמה רכוב (אנדור iXon 885) כדי להקליט HL60 תאים המתגלגל אינטראקציות עם P-selectin מצעים דבק באמצעות 4 × אובייקטיבי, בדרך כלל בשיעור של 1 מסגרת לשנייה עבור משכי זמן של 300 s. בצעו שלושה ניסויים עצמאיים, עבור כל גודל הלחץ גזירה ונטייה זווית דפוס. מוצגים נתונים כמו סטייה ממוצעת ורמת הערכים הממוצע המתקבל כל ניסוי.
3. ניתוח נתונים.
   נתח את התמונה sequences על ידי תוכנית אישית (Mathworks, Inc) Matlab כי נוצלו חלקיק מעקב ⁸ freeware ליצור מסלולים בשולי קו בדוגמת. שירים להאריך עד סוף הלהקה P-selectin נבחרו מצויד בשני מגזרים קו ישר - אחד מיושר עם הזרם, השני מיושר עם קצה דפוס. שני אלה משמשים מגזרים אז כדי לחשב את אורך מעקב קצה, מהירות גלגול על הקצה, וגלגול מהירות על האזור רגיל.

2. נציג תוצאות:

איור (א) מראה אחד של תמונות מיקרוסקופ המרה וידאו של HL60 אינטראקציות מתגלגל עם P-selectin מצעים דבק באמצעות אובייקטיבי 4 ×. אזורים בהירים וכהים מתאימות קולטן P-selectin ואזורים PEG, בהתאמה. איור (ב) מציג את המסלולים מתקבל באמצעות תוכנית אישית Matlab. זווית הנטייה קצה היה 10 ° ואת הלחץ גזירה היה 0.5 dyn / ² ס"מ. מעקב קצה אורך, אני _הדואר, עקירה, d, ואת מהירויות מתגלגל על קצה ובתוך להקות, V ו-V _{e p,} בהתאמה, מתוארים באיור (C-1). איור (C-2) מראה את הפצה (מספר תאים מוקלט) אורך מעקב קצה. ריבועי להראות את הערך הממוצע של l _דואר ואת מהירות מתגלגל על קצה (V _ה) ובתוך להקות (V _p) בזווית הנטייה α = 10 ° ואת גודל נוזל מתח גזירה סביב 0.5 dyn / ² ס"מ. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן אחת, כאשר n = 3 ניסויים לשכפל (3 משטחים לשכפל) עבור כל תנאי.

Discussion

תיארנו פרוטוקול לבחון מסלולים מתגלגל על קולטן תא בדוגמת משטחים סימטריים מפוברק באמצעות הדפסה microcontact ^2. התמונות מיקרוסקופ אופטי של פני השטח בדוגמת מראה בניגוד ברור בין PEG ו-P-selectin אזורים ניתן להשתמש כדי לאשר הטבעה מוצלחת. שארפ, ישרות ניתן לראות כאשר ביול מבוצע הי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human promyelocytic leukemia cells	ATCC	CCL-240	HL60 cells
Gold-coated glass slides	EMF	TA134	Gold slides
(1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	674508	PEG
Recombinant human P-selectin	R&D Systems	ADP3-050	P-selectin
Bovine serum albumin	Rockland Immunochemicals	BSA-50	BSA
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Mediatech, Inc.	21-030	DPBS
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	316989