비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

요약

우리는 비대칭 수용체 - 패턴 기판에서 셀을 회전 궤도를 관찰하고 분석하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 결과 데이터는 레이블이없는 세포 분리 및 분석을위한 수용체 - 패턴 기판의 엔지니어링하는 데 유용합니다.

초록

비대칭 수용체 패턴에 압연에 의해 흐름에 직교 세포의 측면 변위는 세포 ¹ 라벨이없는 분리 및 분석을위한 새로운 장치의 개발을위한 기회를 제공합니다. 이러한 장치는 지속적인 흐름 분리, 또는 다른 셀 또는 phenotypes 수용체 표현의 수준을 구별하기 접착력을 조절 수용체 패턴 측면 변위를 사용할 수 있습니다. 수용체 - 패턴 기판의 셀 압연 궤도의 본질을 이해하는 것은 기판과 같은 장치의 설계 기술이 필요합니다.

여기, 우리는 세포 압연 접착력 ^2를 지원 비대칭 수용체 패턴에 셀 압연의 탄도를 연구를위한 프로토콜을 보여줍니다. P - selectin 수용체의 잘 정의된, μm의 규모 패턴이 흐름 챔버에 통합되었습니다 골드 코팅 슬라이드에 microcontact 인쇄를 사용하여 가공되었습니다. PSGL - 1 리간드 ³ 표현 HL60 세포 무늬 라인의 들판을 가로질러 거듭하고 거꾸로 명시야 현미경에 시각되었습니다. 세포는 측면 편향 ¹ 결과 패턴의 경사 가장자리를 따라 굴러 및 추적. 각 세포는 일반적으로 패턴 가장자리를 따라 일정한 거리 (모서리 추적 길이로 정의)를 압연 가장자리에서 분리하고, 다운 스트림 패턴 reattached. 이 분리가 어려운 흐름 챔버의 출구 입구에서 세포의 전체 궤적을 추적할 수 있습니다 있지만, 입자 추적 소프트웨어는 그들이 하나의 수용체에 이동하는 때 시간 동안 세포의 압연의 탄도를 분석하고 항복하는 데 사용된 - 패턴 라인. 궤도는 다음 셀 롤링 판매율과 다른 패턴으로 각 셀의 가장자리 추적 길이의 배포판을 얻기 위해 조사되었다.

이 프로토콜은 수용체 패턴에 세포 회전 궤도를 quantifying과 패턴 각도 및 전단 응력 등이 엔지니어링 매개 변수를 관련된 유용합니다. 이러한 데이터는 레이블이없는 세포 분리 및 분석을위한 microfluidic 장치의 설계에 유용합니다.

프로토콜

1. 롤링 HL60 세포

1.1. 문양의 기판 제작.

1. 골드 코팅 유리 슬라이드에 PEG 분자의 자기 조립 monolayers을 (샘스) 교체하기 위해 microcontact 인쇄 (μCP) ^{4-7 사용} : α = 10의 경사 각도와 수용체의 패턴을 정의 microcontact 인쇄 polydimethylsiloxane (PDMS) 우표를 조작 SU - 8 성형 공정에 의해 °. 20 분 피라 냐는 물고 기지 너한테 솔루션 (황산의 혼합 3시 1분 30 % 과산화수소로)와 금 표면을 청소하고 사용하기 전에 24.5 ° C에서 풍부한 디 물로 표면을 씻어. 에탄올의 5mM PEG 솔루션 잉크 PDMS 스탬프를. 20 분 동안 공중에 우표를 건조시킵니다. 부드럽게 40 초에 대한 황금의 표면에 도장을 넣고 금 표면과 스탬프 사이 좋은 연락 방법이 있는지 확인하십시오. 초과 압력이 필요하지 않습니다. 에탄올로 표면을 씻어 N _2의 흐름에 따라 그것을 건조.
2. 24.5에서 3 시간 동안 재관류 챔버 (전자 현미경 과학)를 사용 ° C 패턴 P - selectin과 함께 남아있는 지역. P - selectin 솔루션 (15 μg / DPBS에 ML) 내에 기판을 품어 풍부한 DPBS로 표면을 씻어.
3. Backfill 1 H를위한 BSA (DPBS 1 MG / ML)로 표면이 아닌 특정 상호 작용을 차단합니다. 풍부한 DPBS로 표면을 씻어.

1.2. 세포는 흐름 회의소에서 실험 롤링.

1. 직사각형 흐름 챔버의 패턴 표면을 통해 HL60 세포 (~ 10 ⁵ 셀 / ML (); 폭 W = 1.0 cm, 길이 = 6cm, Glycotech, Inc의 높이 H = 0.0127 cm)의 정지를 흐름 24.5에서 ° C. 0.5 dyn / cm ² (~ 0.05 PA) 주변에 대응하는 전단 응력과 75 μL / 분 유량을 생성하기 위해 주사기 펌프 (세계 정밀 계측기, SP230IW)를 사용합니다. τ 비행기 Poiseuille 흐름 방정식 판매량 유량입니다 Q μ는 동점도 (0.001002 아빠들)입니다 τ는 = 6μQ/wh ^2를 사용하여 전단 응력을 계산, W는 흐름 챔버의 넓이이며, H는의 높이입니다 흐름 챔버.
2. 300 기간이 일반적으로 초당 1 프레임의 속도로, 4를 사용하여 접착제 P - selectin 기판과 상호 작용을 압연 HL60 세포를 기록하기 위해 장착된 카메라 (Andor iXon 885) × 목적으로 거꾸로 현미경 (니콘 TE2000 - U)를 사용하여 S. 각 전단 응력의 크기와 패턴 경사 각도 세 독립적인 실험을 수행합니다. 각 실험에서 얻은 평균 값을 의미 및 표준 편차로 제시 데​​이터입니다.
3. 데이터 분석.
   패턴 라인 가장자리를 따라 트랙을 생성하는 프리웨어 ⁸ 추적 입자를 이용한 사용자 정의 Matlab (Mathworks, 주식 회사) 프로그램으로 이미지 시퀀스를 분석합니다. P - selectin 밴드의 끝부분까지 연장 트랙이 선택 두 개의 직선 세그먼트 장착되어 있습니다 - 흐름에 부합 하나, 패턴 가장자리에 부합 다른. 이 두 세그먼트는 다음 가장자리에 속도를 압연하고, 일반 지역에 속도를 압연, 가장자리 추적 길이를 계산하는 데 사용됩니다.

2. 대표 결과 :

그림 (A)는 4 × 목표를 사용하여 접착제 P - selectin 기판과 HL60 압연 상호 작용의 동영상 변환 현미경 이미지 중 하나를 보여줍니다. 밝고 어두운 지역은 각각, P - selectin 수용체와 PEG 지역과 일치합니다. 그림 (B)는 맞춤형 Matlab 프로그램을 사용하여 얻은 트랙을 보여줍니다. 가장자리 경사 각도는 10 °와 전단 응력은 0.5 dyn / cm ^2이었다. 에지 추적 길이, L _E, 변위, D, 그리고 모서리에 각각 밴드, V _E와 V _P, 내부 압연 판매율이 (C - 1) 그림에 설명되어 있습니다. 그림은 (C - 2) 보여줍니다 에지 추적 길이 분포 (기록된 세포의 수를.) Insets은 L _E의 평균 가치와 가장자리에 압연 속도 (V _E)를 표시하고 경사 각도에서 밴드 (V _P) 내부 α = 10 ° 및 0.5 dyn / cm ² 주위의 유체 전단 응력의 ​​크기. 오차 막대는 하나의 표준 편차, N = 각 조건 3 복제 실험 (3 복제 표면). 나타냅니다

토론

우리는 microcontact 인쇄 ^2를 사용 가공 비대칭 수용체 - 패턴 표면에 세포 회전 궤도를 조사하기 위해 프로토콜을 설명합니다. PEG와 P - selectin 영역 사이의 명확한 대비를 보여주는 패턴 표면의 광학 현미경 이미지는 스탬핑이 성공적인지 여부를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 샤프, 직선 가장자리는 스탬핑이 잘 수행하면 볼 수 있습니다. 하드 스탬프 누르면 패턴의 정밀도를 제한 스탬?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human promyelocytic leukemia cells	ATCC	CCL-240	HL60 cells
Gold-coated glass slides	EMF	TA134	Gold slides
(1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	674508	PEG
Recombinant human P-selectin	R&D Systems	ADP3-050	P-selectin
Bovine serum albumin	Rockland Immunochemicals	BSA-50	BSA
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Mediatech, Inc.	21-030	DPBS
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	316989