קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ו ממוצעים אוטומטי תת tomogram

Summary

הפרוטוקול מתאר גישה תפוקה גבוהה לקביעת מבנים של חלבונים בממברנה באמצעות אלקטרונים cryo-3D טומוגרפיה ועיבוד תמונה. זה מכסה את הפרטים של הכנת הדגימה, איסוף נתונים, עיבוד נתונים לפרשנות, מסכם עם ייצור של היעד מייצג את הגישה, HIV-1 גליקופרוטאין מעטפה. נהלים אלה חישובית מעוצבים באופן המאפשר לחוקרים וסטודנטים כדי לעבוד מרחוק לתרום עיבוד וניתוח של נתונים מבניים.

Abstract

מאז גילויו כמעט 30 שנים, יותר מ -60 מיליון בני אדם נדבקו בווירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) (www.usaid.gov) . הנגיף מדביק והורס CD4 + T-תאים ובכך משתק את המערכת החיסונית, וגורם לתסמונת הכשל החיסוני הנרכש (איידס) ^2. הזיהום מתחיל כאשר גליקופרוטאין מעטפת ה-HIV "ספייק" יוצר קשר עם הקולטן CD4 על פני השטח של CD4 + T-cell. אינטראקציה זו גורמת לשינוי קונפורמציה הספייק, המקדמת אינטראקציה עם משטח התא second שיתוף קולטן ^5,9. המשמעות של אלה אינטראקציות חלבון במסלול הידבקות ב-HIV גורם להם חשיבות רבה בחקר HIV היסוד, במרדף אחר חיסון ל-HIV.

הצורך להבין טוב יותר את האינטראקציות בקנה מידה מולקולרי של מגע תא איידס נטרול מונעים התפתחות של טכניקה כדי לקבוע אתמבנים של ספייק HIV אינטראקציה עם פני התא קולטן חלבונים ומולקולות כי זיהום לחסום. באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ועיבוד תמונה 3D, אנו לאחרונה הדגימו את היכולת לקבוע מבנים כאלה על פני השטח של הווירוס הילידים, ב ~ 20 החלטה ^9,14. גישה זו אינה מוגבלת מבנים לפתרון HIV מעטפה, וכן ניתן להרחיב אחרים חלבונים בממברנה חלבונים נגיפיים מחדש על liposome. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד להשיג מבנים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה החל virions מטוהרים איידס הליך הדרגתי דרך הכנת דגימות מזוגגת, איסוף נתונים אלקטרונים cryo-מיקרוסקופיה, בשחזור ועיבוד נתונים 3D כרכים, מיצוע ומיון subvolumes חלבון 3D, פירוש התוצאות לייצר מודל חלבון. היבטים חישוביים של הגישה שלנו הותאמו לתוך מודולים ניתן לגשת והוצאו להורג מרחוק באמצעות גנו / לינוקס Biowulf במקביל processing אשכול ב-NIH (http://biowulf.nih.gov) . זו גישה מרחוק, בשילוב עם חומרה בעלות נמוכה המחשב במהירות גבוהה גישה לרשת, איפשרה את מעורבותם של חוקרים וסטודנטים מבית הספר או בעבודה מהבית.

Protocol

הגישה המתוארת כאן פותחה באמצעות סדרה ספציפית של מכשירים, כלים ותוכנות. בגלל כל המעבדות לא תהיה התקנה זו באמצעות ניסויי זאת, נעשה כל מאמץ להכליל את הגישה במידת האפשר, ולספק חלופות שם זה לא היה אפשרי.

1. הכנת דגימות נגיף מזוגגת

בסעיף הבא רשתות מזוגגת מוכנים באמצעות Vitrobot פיי Mark III, הקפאה סופג רובוט לצלול. ר 'ינקו, et al. בפרוטוקול מפורט על השימוש במערכת זו ^7. כחלופה הבוכנה רובוטית, הבוכנה הגיליוטינה בסגנון או הכבידה מספיק בהחלט ^6.

בסעיפים 1.2. ו 1.3. Solarus Gatan 950 פריקה יחידה זוהר משמש לניקוי רשתות מדגם ולהגדיל hydrophilicity שלהם, למרות כל הפרשות זוהר התקן המיועד לשימוש עם רשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להחליף.

"> תוכן למרות כמות נפח דגימה להחיל לרשת לפני סופג והקפאה לצלול צריך להיות בטווח של μL 2, הנגיף חלבון נפח קולואיד זהב בתערובת מדגם ישתנה בהתאם למקור. ככזה, סביר להניח כי בטווח של דילולים וירוס זהב או יחסי יצטרך להיבדק הדמיה במיקרוסקופ, ואת תערובת אידיאלי נקבעים אמפירית. שים לב שכאשר נתוני תמונה רכשה בסעיף 3, בין 10 ל 20 סמנים fiducial זהב צריך להיות נוכח יישור הטיה נכונה סדרה.

זהירות: סעיף זה מתאר את השימוש של אתאן מימן גזי, חמצן אשר דליק מאוד. זהירות פרופר צריך לקחת בעת שימוש אלה גזים. בנוסף, יש להקפיד לטפל דגימות נגיף בהתאם להמלצות biosafety. לבסוף, תמיד ללבוש משקפי שמש ביגוד מגן בעת טיפול בחנקן נוזלי (N _2), אתאן.

1. הכן פיי Vitrobot מרקIII ידי הפעלת אספקת גז N ₂ שלה, התקנת מחסנית אדים ואז ממלאים את המחסנית עם מים מסוננים deionized. כוח על Vitrobot ולהגדיר קאמרית האקלים שלה הטמפרטורה ל 22 מעלות צלזיוס, לחות היעד עד 100%, זמן סופג עד 6 שניות, ואת כתם לקזז -2 מ"מ.
2. כוח על יחידת Solarus Gatan 950 זוהר הפרשות ולפתוח H ₂ O ו - ₂ רימוני כי אספקת יחידה. טרום נקי הדגימה קאמרית ידי הפעלת הפרשות זוהר דקות 1 ב 50 וואט.
3. מסדרים את המספר הרצוי של רשתות המחוררת פחמן על coverslip זכוכית, פחמן בצד למעלה, מקום בתוך חדר פריקה הדגימה זוהר דרך הדלת טעינת הדף. רשתות נקי על ידי הפעלת הפרשות זוהר עבור 6-10 שניות במהירות של 25 וואט. (יש לציין כי הצד של פחמן רשתות המותג Quantifoil שימוש בפרוטוקול זה הם במראה מט. זה לא יהיה נכון לגבי כל רשתות מסחריות ולכן הדרך הטובה ביותר היא לקבל מידע זה מן היצרן.)
4. רשת Place בתיבת (תיבות) בתוך קוlant קערה המיכל, ואת ציר מפזר חום על כוס המרכזי שיושב בתוך קערה הקירור. לאט לאט לשפוך נוזלי N ₂ לתוך הקערה עד שוך מבעבע נמרץ, המעיד על שיווי משקל בין הקערה נוזלי. שמור נוזלי N ₂ רמה בכל שאר ההליך, מקפיד לשמור את זה מתוך כוס המרכזי.
5. חבר קצה אחד של צינור פלסטיק המכל אתאן גז, ואת הקצה השני אל פיפטה זכוכית. החזק קצה פיפטה זכוכית לתחתית של כוס מרכזי, להקים זרם איטי, אתאן יציב, אתאן יחל עיבוי. המשך למלא את הכוס עד מרכזי מלא. הסרה של ציר מרכזי מכוס.
6. הכינו תערובת מדגם ידי הוספת 2 חלבונים μL קולואיד זהב fiducial כדי μL 10 AT-2 מומת HIV-1 ההשעיה וירוס. בעדינות פיפטה תערובת להביא fiducials לתוך פתרון. שמור על הקרח.
7. תפוס את השפה החיצונית של רשת עם Vitrobot התמחה פינצטה. החל 2 μL של תערובת מדגם של פחמןIDE של הרשת. מיד להורות לרובוט לטעון מדגם לתוך תא humidified כתם, האקלים להקפיא לצלול ב אתאן נוזלי.
8. העברת רשת מזוגגת לתיבת הרשת. חזור על שלב 1.7. כדי לייצר את המספר הרצוי של רשתות. בסיום, להדק את הברגים על מכסה הקופסה לרשת (ים) ולאחר מכן במהירות העברה בתיבה (כתובות) קטן חנקן נוזלי תחבורה דיואר.

2. דגימות טוען לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

לאורך קטע זה, הנוזל N ₂ רמת בחדר הטעינה יש לעקוב בדריכות, ומילאו נוזל לפי הצורך, כדי להבטיח כי הרשת תיבות להישאר שקוע. לפני הבאת כלי במגע עם רשת, לקרר אותו על ידי והשקיע אותה נוזלי N ₂ עד equilibrates עם הנוזל. לאחר כל שימוש, כלים יש מפשיר באמצעות אקדח אוויר חם.

לאורך קטע זה Tecnai פיי G2 Polara שידור מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) משמש יחדעם Workstation Gatan cryo. בעוד העיקרון של דגימות תחת העמסה נוזלי N ₂ תנאים ישים לעבודה אלקטרונים cryo-מיקרוסקופיה כל, השלבים בסעיף זה הן ספציפיות הציוד המשמש בניסוי. השלבים משמשים ציוד שונה ישתנו על ידי היצרן.

זהירות: במהלך סעיף זה, תמיד ללבוש משקפי שמש ביגוד מגן בעת טיפול נוזלי N _2.

1. ודא Compustage TEM אינו מכיל מחסנית הדגימה, וכי הבחירה הדגימה מוט והחדרת מוט להלן 110 K.
2. מגניב ולהכין Workstation cryo לטעינת רשתות לבלוק הדגימה אחסון, המהווה חלק של מוט הבחירה המדגם.
3. העברת המוט מקורר (<110 K) מבחר מתוך מיקרוסקופ כדי cryo Workstation.
4. מבחר מוט שקופיות קדימה להכניס בלוק מבחר לאמבטיה חנקן על Workstation cryo. הסר את כל מחסניות הדגימה מגוש אחסון באמצעות התמחה גartridge טיפול מלקחיים. רשת Place בתיבת (תיבות) של תחנת הטעינה ואת לשחרר את המכסה (ים) עם מברג.
5. להשתמש בפינצטה כדי להסיר רשת מתיבת רשת ומניחים מחסנית. השתמש בכלי המתמחה C-קליפ מיקום להפקיד C-קליפ על גבי רשת, אבטחת רשת במחסנית.
6. חזור על שלב 2.5. עד המספר הרצוי של רשתות הם מחסניות. העברת מחסניות לחסום מבחר הדגימה.
7. הכן Workstation cryo להסרת מוט מבחר הדגימה. Slide מוט מבחר האחורי כדי להסיר לחסום מבחר מן האמבט חנקן. הסר מוט הבחירה Workstation cryo ומתחברים TEM.

3. רכישת אלקטרונים cryo-נתונים מיקרוסקופיה

במהלך סעיף זה, אצווה פיי טומוגרפיה ממשק התוכנה משמשת כדי להגדיר קובץ אצווה המאחסן את הקואורדינטות של כל הפוזיציות לרשת של עניין. כאשר הורה על ידי המשתמש, התוכנה טומוגרפיה אצווה יהיה לבקר כל העמדות ואת ירכזלהטות סדרת הרכישה באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי. אם תוכנה זו אינה זמינה, חבילת התוכנה Leginon היא בת קיימא המקור חופשי, פתוח חלופיות ^13. הדמיה נעשה על 200 קאב, באמצעות הדמיה Gatan סינון (GIF) עם פוסט GIF 2K 2K x מצלמת CCD (Gatan).

1. Compustage עמדה קרן כזו האלקטרון עובר דרך חלל ריק. מעבר אל מצב גבוה (34kX) הגדלה חשיפה ולבצע יישור ישיר.
2. יישר אפס על הפסד שיא אנרגיה הסינון. (זה מספק את מסנן אנרגיה עם הפניה עבור אלקטרונים עם אובדן אפס אנרגיה).
3. הזז את Compustage לאזור רשת שמציעות פחמן. בשנת הגדלה נמוכה (4.5kX) מצב חיפוש, השתמש בפונקציה Wobbler כדי להטות את הבמה הלוך ושוב בין + / -15 מעלות. בינתיים להתאים את מיקום ציר Z-שלב עד שלב המעבר המינימלי הוא ציין. (זה השלב עמדות כ בשיא eucentric). בטל Wobbler כאשר אין שינוי שלב הוא ציין.
4. השתמש f אוטומטיות גובה Eucentric המשיחה כדי לחדד את גובה eucentric. (שגרה זו משתמשת מתאם הצלב כדי להשיג גובה eucentric מדויק יותר בשלב 3.3). גובה Eucentric מאוחסן באופן אוטומטי לעיון מאוחר יותר על ידי תוכנה טומוגרפיה אצווה.
5. מצא שטח של הריבית שמציעות כ 3-6 virions, ולא פחות מעשרה סמנים fiducial. הוסף עמדה זו רשת לקובץ טומוגרפיה אצווה.
6. חזור על שלבים 3.4. ו -3.5. עד המספר הרצוי של משרות מיועדות. הגדרת פרמטרים אצווה (± 60 ° עם 2 ° במרווחים של הטיה, 1-2 דואר / a ² / להציג להטות) ולהפעיל את אצווה.

4. שיחזור אלקטרונים cryo-tomograms

1. יישר סדרה להטות באמצעות יישור אוטומטי fiducial מבוסס Raptor ^1.
2. לשחזר tomograms באמצעות R-משוקלל השלכה לאחור IMOD ^8. תבנית הקובץ תקן הכרכים הנתונים המתקבלים הוא קובץ MRC, עם סיומת הקובץ. MRC.

ve_title "> 5. קוצים פילוח subvolumes virion וזיהוי

סעיף זה עם סיומת אישית של IMOD המאפשר למשתמש לקבוע subvolumes virion בתוך tomogram. בסעיף 6, המשתמש הגדיר גבולות virion משמשים משטח שלאורכו קוצים נבחרים באופן אוטומטי.

1. פתח IMOD עומס tomogram מאוכלס virions.
2. נווט לאורך ציר Z-tomogram של עד מרכזי פרוסה דרך אחד virions ממוקם. ודא centroid virion זוהה. לאחר שתעשה זאת, ההפקדה סמן virion. סמן זה ישמש את השירות פילוח אוטומטי virion בסעיף 6.
3. המשך ייעוד centroid עד שכל כרכים virion מזוהים.
4. סגור tomogram ולשמור להגדיר סמן הגדרת centroids virion. חזור על הפעולה עד virions כבר המיועד tomograms כל.
5. שימוש, IMOD למטה מדגם subtomograms virion בפקטור של ארבעה.
6. Virions Denoise משתמש קצה לשיפור דיפוזיה אניסוטרופי כפי שהיא מתבצעת IMOD.
7. Virions בכפוף פילוח קרום השגחה באמצעות אנרגיה המבוסס על גישה תלת ממדי (המפורט Bartesaghi et al. 2005) ^3.
8. Spikes מזוהים במקומות על פני השטח virion מפולח המתאים מקסימום מקומי של הכלאה בין קורלציה למיקום מסוים נפח סינתטי סימטרי כמו ספייק. במקומות אלה מעל סף מסוים מתווספים לרשימה של קואורדינטות עבור המשוערת subvolumes ספייק.

6. סיווג ממוצעים של חלקיקי

1. המחשוב לחלץ את subvolumes tomogram (100 x 100 x 100 voxels) במיקום כל כך זוהה בשלב 5.8. (זה נעשה ללא denoising או binning). אוסף כתוצאה של subvolumes מכילים חלבונים ספייק יהיה מסווג בממוצע בשלבים הבאים.
2. Determine אוריינטציות של ציר זמן של ספייק באמצעות נורמלי קרום מפולח באופן אוטומטי על מיקומו של כל ספייק. גישה זו מספקת אומדנים ראשוניים עבור שניים משלושת זוויות אוילר.
3. אקראי הנותרים במקום סיבוב כדי למנוע הטיות אפשריות של מערכים הבאים.
4. החל זוויות אוילר subvolumes, אז translationally ליישר את subvolumes לממוצע בממוצע cylindrically שלהם העולמי כדי להבטיח שהם כולם חולקים את אותו מוקד של המונית.
5. הסר את 10% subvolumes המתואמים הכי גרוע עם הממוצע העולמי המעודכן. זה נעשה כדי להסיר צפיפויות בסיכון הגדול ביותר של להיות מזוהה בטעות קוצים.
6. יישר לסווג כרכים ספייק ללא שימוש הפניות חיצוניות ועם חשבונאית נאותה של טריז החסר (מפורט Bartesaghi et al. 2008) ^4. בהדרגה לשפר מערכים subvolume ולסווג כרכים ספייק בכל איטרציה.
7. פי שלושה סימטריה יש לשים לב היטב בשלבים המוקדמים של סיווג, ועל איטרציה הרביעי, 3 פי סימטריה מוטל. באותו סיבוב, ביותר מוגדרים היטב בכיתות הם ממוצעים ושימש הפניה לסיבוב הבא.
8. בדרך כלל ~ 4000 קוצים יש לבחור עבור כל בסיס הנתונים. מפות צפיפות סופית מתקבלים לאחר ~ 5-12 סיבובים עידון יכלול תרומות של 50% ~ של תת כרכים במערך זה.

7. תיאום הולם

1. מפות צפיפות הנובעת 6.8 צעד נפתחים ב ¹² קליפורניה בסן פרנסיסקו כימרה.
2. תוצרת מדומה 20 מפה של קרני ה-X באמצעות קואורדינטות כימרה או אימאן ^10.
3. Dock קואורדינטות לתוך אוריינטציות אקראי. שימוש של כימרה נבנה אופטימיזציה התלול, העלייה המקומיות, מתאים קואורדינטות על ידי ביצוע בכפולות של 100 צעדים העלייה החדה ביותר עד ההתכנסות מתקבל.

8. נציג תוצאות

שימוש בממוצע 3D ולתאם הולם, מגוון רחב של HIV ו SIV Env מבנים ספייק נפתרו. מוצג איור 3A הוא המבנה של ספייק עוטף מן זן HIV-1, BAL (סגול). לספייק יש פי שלושה סימטריה עם ממדים של 120 ~ מדוד כמו מן הקרום אל הקודקוד ספייק, ואת רוחב מרבי של 150 ~ אשר מתכנסת אל ~ 35 בבסיס של ספייק. כפי שניתן לראות באיור 3 ב, על ידי שילוב של מפת צפיפות עבור trimeric Env נקבע באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה עם המבנה נקבע crystallographically עבור monomeric gp120 (אדום, שמקורם PDB מזהה, 2NY7), הצלחנו להשיג מודל מולקולרי עובד המעטפה trimeric גליקופרוטאין מורכבים (PDB מזהה, 3DNN) ^9.

הגישה שלנו מאפשרת גם ניתוח מבני של קומפלקסים שנוצר בין trimeric Env ועוד מגוון של חלבון gp120 ספציפישברי נוגדנים. דוגמה לכך, שבה Env הוא ומורכבת עם נטרול רחב B12 Fab מוצג באיור 4 א (המורכב כולו מוצג סגולים). בנתון זה, צפיפות נוספת המתאים B12 נתפסת מקרין החוצה מן ספייק, ובמקביל הממברנה. פרשנות מבנית של קומפלקסים כאלה ניתן להרחיב ברמה המולקולרית ידי התאמת מפות צפיפות עם הקואורדינטות אטומי עבור חלקים של ספייק, חייב ליגנד המקביל. כפי שניתן לראות באיור 4B, כאשר המפה הזאת צפיפות מצויד הקואורדינטות של חלבון gp120 ספייק (אדום, שמקורם PDB מזהה, 2NY7) מחויב B12 Fab (לבן), אוריינטציות היחסי של שלוש ליבות gp120 ניתן להבחין (PDB מזהה, 3DNL). אלה הם יחסים קונפורמציה מאלפת להבנת ligands כגון אינטראקציה עם ספייק להפריע לפעילות הנגיף. כמה מבנים אחרים של Env unliganded ו liganded כי נפתרו ע"י השיטה המוצגת כאן כוללאודה לאלה של HIV-1 R3A, SIV CP-MAC, SIVmneE11S ו SIVmac239, המורכב משולשת בין HIV-1 באל Env, sCD4 ו-Fab 17 ב, ו - SIV CP-Mac Env ומורכבת כדי הנוגדן 7D3 ^9,14.

איור 1 מ ההשעיה ויראלי למבנה 3D:. צעדים מושגית במיקרוסקופ אלקטרונים cryo-ושיקום 3D.

באיור 2. (א) פרוסה נציג tomogram של HIV-1 virions. (ב) virion בודד HIV-1, עם קוצים הליבה פני השטח הראו סכמטי.

באיור 3. (א) תלת ממדי המבנה של גליקופרוטאין עוטף HIV-1 באל (קוצים השטח) מוצגת על פני השטח של קרום ויראלי. (ב) מודל מולקולרית עבור trimeקוצים ריק נקבע על ידי הצבת שלושה עותקים של מבנים עבור monomeric gp120 (אדום) שהופקו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן לתוך צפיפות המפה ^9.

איור 4. (א) תלת ממדי המבנה של גליקופרוטאין-HIV-1 מעטפה באל במתחם עם שבר Fab של נוגדנים מנטרלים רחב, B12. (ב) מודל מולקולרית מורכבת שנקבע על ידי הצבת שלושה עותקים של מבנים מורכבים monomeric Fab gp120-B12 שהופקו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן לתוך צפיפות המפה ^9.

Discussion

במיקרוסקופ אלקטרונים cryo-ו תלת ממדי סיווג ושיטות בממוצע המוצגים כאן מאפשרים קביעת תלת מימדי של מבנים גליקופרוטאין מתחמי המעטפה ~ 20 החלטה. השתלבות של קרני ה-X הקואורדינטות של הרכיבים monomeric את מפות צפיפות מאפשר פרשנות מבנית ברמה המולקולרית. שיפורים המשך בציוד מחשוב בעלות נמוכה בשילוב עם ההתפתחויות כלי קוד פתוח המדעי והפצת תשתית הרשת לאפשר מאמצים בלתי נתפס בעבר שיתוף פעולה מדעי. אנו מנצלים את ההתפתחויות הללו מראים כי שיטות מדעיות מתקדמות ניתן להביא בהישג ידם של תלמידים רבים מכל הגילאים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוג	תגובות
Multi-Carbon רשתות המחוררת	Quantifoil	-	200 רשת
חלבון קולואיד זהב	אוניברסיטת Utrech - הולנד	-	קוטר 10 ננומטר
HIV-1 BAL	NIH, NCI, פרדריק, MD	-	~ 10 11 virions / mL
Cryo-EM תיבת אחסון	השקט גריד טק	GB-4R	4-חור עגול
Vitrobot Mark III	פיי	-	6 זמן כתם השני, מ"מ -2 אופסט, 100% לחות
Tecnai G2 Polara שידור מיקרוסקופ אלקטרונים	פיי	-	קו 200
Gatan הדמיה מסנן	Gatan	-	-
Gatan Post-GIF CCD	Gatan	-	2K 2K x פיקסלים
Gatan cryo Workstation	Gatan	-	-
Gatan Solarus 950 ניקוי מערכת פלזמה	Gatan	-	חמצן ומימן פלזמות
C - קליפים	פיי	ZIT0634	-
Biowulf מחשוב אשכול	המכונים הלאומיים לבריאות	-	http://biowulf.nih.gov/
כימרה קליפורניה בסן פרנסיסקו	אוניברסיטת קליפורניה - סן פרנסיסקו	-	http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
IMOD	אוניברסיטת קולורדו - בולדר	-	/ Imod / "> http://bio3d.colorado.edu/imod/
אימאן	ביילור לרפואה	-	http://blake.bcm.tmc.edu/eman/
Raptor	אוניברסיטת סטנפורד	-	http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm