Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

Özet

Protokol zarı proteinleri kullanarak kriyo-elektron tomografisi ve 3D görüntü işleme yapıları belirlemek için yüksek verimli bir yaklaşımı açıklar. Numune hazırlama, veri toplama, veri işleme ve yorumlama kapsar ve yaklaşım, HIV-1 zarf glikoprotein bir temsilcisi hedef üretim ile son bulur. Bu hesaplama prosedürleri, araştırmacılar ve öğrenciler uzaktan çalışma ve veri işleme ve yapısal analiz için katkıda bulunmayı sağlayan bir şekilde dizayn edilmiştir.

Özet

Yaklaşık 30 yıl önce keşfedilmesinden bu yana, 60 milyondan fazla insan, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile enfekte olmuştur (www.usaid.gov ) . Virüs bulaşan ve CD4 + T-hücreleri tahrip eder ve böylece bağışıklık sisteminin sakatlayıcı ve edinsel bağışıklık yetmezliği sendromu ^(AIDS) 2 neden . HIV zarf glikoprotein "başak" CD4 + T hücre yüzeyinde CD4 reseptörü ile temas yaptığında Enfeksiyon başlar. Bu etkileşim, ikinci bir hücre yüzeyinde ^co-reseptör 5,9 ile etkileşimi teşvik başak, bir konformasyonel değişikliği neden olur . HIV enfeksiyonu yolu bu protein etkileşimleri önemi, temel, HIV araştırma derin öneme onları yapar ve bir HIV aşısı peşinde.

HIV hücre iletişim ve nötralizasyon moleküler ölçekli etkileşimleri daha iyi anlamak için ihtiyaç belirlemek için bir teknik geliştirme motiveHIV başak hücre yüzeyinde reseptör proteinler ve moleküller o blok enfeksiyon ile etkileşim yapıları. Kriyo-elektron tomografisi ve 3D görüntü işleme kullanarak, son zamanlarda yerli virüs ~ 20 Å ^{çözünürlük} 9,14 yüzey, bu tür yapıları belirlemek için yeteneğini göstermiştir . Bu yaklaşım çözümünde, HIV Zarf yapılara sınırlı değildir ve diğer viral membran proteinleri ve proteinlerin bir lipozom sulandırılmış kadar uzatılabilir. Bu protokol, HIV zarf glikoproteinler saflaştırılmış HIV virionlar başlayarak, vitrifiye numunelerin hazırlanması, kriyo-elektron mikroskobu veri toplama, yeniden oluşturmak ve 3D veri hacimleri işlem, ortalama ve 3D protein subvolumes sınıflandırılması yoluyla adım adım ilerlemeden yapıları nasıl elde edilir ve bir protein model üretmek için sonuçları yorumlama. Bizim yaklaşımımız hesaplama yönlerini erişilebilir ve uzaktan Biowulf GNU / Linux paralel p kullanarak idam edilebilir modülleri uyarlandıNIH rocessing küme (http://biowulf.nih.gov) . Bu uzaktan erişim, düşük maliyetli bilgisayar donanımı ve yüksek hızlı ağ erişimi ile birlikte okul veya evden çalışan araştırmacılar ve öğrencilerin katılımı mümkün kıldı.

Protokol

Burada açıklanan yaklaşım, aletleri, araçları ve yazılım belirli bir kullanılarak geliştirilmiştir. Tüm laboratuvarları bu aynı deney düzeneği kullanarak olmayacağından, çaba mümkünse yaklaşımı genelleştirmek ve bu mümkün değildi alternatifler sağlamak için yapıldı.

1. Vitrifiye virüs örneklerinin hazırlanması

Aşağıdaki bölümde, vitrifiye ızgaraları FEI Vitrobot Mark III, blot ve dalma dondurma robot kullanılarak hazırlanmıştır. Ayrıntılı bir protokol için bu sistemi kullanarak ⁷ Iancu ve ark bakın. Bir robot piston bir alternatif olarak, bir giyotin tarzı veya yerçekimi piston ⁶ derece yeterli olacaktır.

Bölüm 1.2. ve 1.3. elektron mikroskobu ızgaraları ile kullanılmak üzere tasarlanmış herhangi bir glow deşarj cihaz ikame edilebilir ama Gatan Solarus 950 glow deşarj ünitesi, örnek ızgaraları temiz ve hydrophilicity artırmak için kullanılır.

Gibi blot ve dalma donma önce grid uygulanan numune hacmi miktarı 2 mcL aralığında olmalıdır içerik "> olsa da, örnek karışımı virüs ve protein-A altın kolloid ses kaynağına bağlı olarak değişecektir. virüs ve altın dilüsyonları veya oranlarının bir dizi test ve mikroskop yansıması olacağı muhtemeldir ve ideal bir karışımı deneysel olarak belirlenir. Not görüntü verileri, Bölüm 3, 10 ve 20 arasında kazanılır altın fiducial belirteçler doğru eğim serisi uyum için mevcut olabilir.

Dikkat: Bu bölümde, son derece yanıcı bir gaz etan, hidrojen ve oksijen kullanımı anlatılmaktadır. Bu gazlar kullanırken Uygun dikkatli alınmalıdır. Ayrıca, virüs örnekleri biyogüvenlik öneriler doğrultusunda ele alınmalıdır. Son olarak, sıvı azot (N ₂₎ ve etan tutarken her zaman koruyucu gözlük ve elbise giymeli .

1. FEI Vitrobot Mark hazırlayınN ₂ gaz tedarik açma, nemlendirici kartuş taktıktan sonra süzülür deiyonize su ile kartuş dolum III . Vitrobot Güç ve 22 olan iklim odasında sıcaklığını ayarlamak -2 mm ofset ° C,% 100 hedef nem, 6 sn blot zaman ve kurulayın.
2. Gatan Solarus 950 glow deşarj ünitesi ve birim kaynağı açık H ₂ ve O ₂ kutu Güç. 50 Watt az 1 dakika için kızdırma deşarj çalışan Öncesi temiz numune odası.
3. Bir cam lamel kadar karbon yan ve üstten yüklemeli kapıdan glow deşarj numune odası içinde yer holey karbon ızgaraları istediğiniz numarayı düzenleyin. Temizlik 25 Watt 6-10 sn için kızdırma deşarj ızgaraları. (Not Bu protokolde kullanılan Quantifoil marka ızgaraları karbon tarafı mat görünüm üretici bu bilgileri elde etmek için en iyisi bu yüzden tüm ticari ızgaraları için doğru olmayacaktır.)
4. Coo içine yerleştirin grid kutusu (es)Lant konteyner kase, ve soğutucu kase içinde oturan merkezi bir fincan termal difüzör mili. Yavaş yavaş kase kase ve sıvı arasında bir denge gösteren kuvvetli köpüren geçene kadar sıvı N ₂ dökün. Sıvı N prosedürün geri kalanı boyunca ₂ seviyeli, merkezi fincan uzak tutmak için özen koruyun.
5. Etan gazı spreyi ve bir cam pipet diğer ucunu bir plastik hortumun bir ucunu takın. Cam pipet merkezi fincan altına tutun, yavaş ve sabit bir etan akışı kurmak ve etan yoğunlaşmayan başlayacak. Merkezi bardak dolana kadar doldurarak devam edin. Merkezi fincan mili çıkarın.
6. HIV-1 virüsü süspansiyon AT-2 inaktive 10 mcL 2 mcL protein-A altın kolloid fiducial ekleyerek örnek karışımı hazırlayın. , Çözüm haline fiducials getirmek için yavaşça karışımı pipetle. Buz üzerinde tutun.
7. Uzmanlaşmış Vitrobot cımbız ile bir ızgara dış kenarı kavrayın. Karbon s örnek karışımı 2 mcL uygulayınızgara ide. Hemen sıvı etan nemlendirilmiş iklim odası, leke ve dalma dondurma örnek yüklemek için robot kapatın.
8. Vitrifiye ızgara ızgara kutusu aktarın. 1.7 adımı tekrarlayın. Izgara istediğiniz numarayı üretmek. Bittiğinde, sonra hızlı bir şekilde küçük, sıvı azot taşıma Dewar (es) kutusuna aktarmak grid kutusu kapağı (ler) vidaları sıkın.

2. Yükleniyor örnekleri transmisyon elektron mikroskobu içine

Bu bölümde boyunca yükleme odasında sıvı N ₂ seviyesinde titizlikle izlenir ve gerektiği gibi sıvı doldurulan, ızgara kutuları içine kalmasını sağlamak için olmalıdır. Bir ızgara ile temas eden bir araç götürmeden önce, sıvı ile equilibrates kadar sıvı N ₂ daldırarak serin. Her kullanımdan sonra, araçlar, bir sıcak hava tabancası kullanarak çözülmüş olmalıdır.

Bu bölüm boyunca FEI Tecnai G2 Polara transmisyon elektron mikroskobu (TEM) birlikte kullanılırGatan Cryo Workstation. Sıvı altında yükleme örnekleri K ₂ koşulları prensibi tüm cryo-elektron mikroskobu çalışmaları için geçerli olsa da, bu bölümdeki adımları deneyde kullanılan ekipman için özeldir. Farklı ekipman için kullanılan adımları üreticiye göre değişebilir.

DİKKAT: sıvı N ₂ işlerken, bu bölümde boyunca her zaman koruyucu gözlük ve elbise giymeli .

1. O TEM Compustage bir örnek kartuşu ve numune seçim çubuk ve ekleme çubuk aşağıda 110 K. gelmez olun
2. Serin ve örnek seçimi çubuk parçası örnek saklama blok, ızgaralar yükleme için Cryo İş İstasyonu hazırlamak.
3. Cryo İstasyonu için mikroskop soğutmalı (<110 K) seçimi çubuk aktarın.
4. Slayt seçim çubuğu ileri Cryo İş İstasyonu azot banyoya seçimi blok yerleştirmek için. Uzmanlaşmış c kullanarak depolama blok tüm numune kartuşlarını çıkarınforseps artridge işleme. Place ızgara iş istasyonu yükleme kutusu (ler) ve bir tornavida ile kapak (lar) gevşetin.
5. Izgara ızgara kutusu ve kartuş içinde yerden kaldırmak için cımbız kullanın. Kartuş içinde güvence ızgara, ızgara üstünde bir C-klibi yatırmak için özel C-klip yerleşim aracını kullanın.
6. 2,5 adımı tekrarlayın. Izgara İstediğiniz numaraya kartuşları kadar. Örnek seçimi engellemek için kartuşlar aktarın.
7. Cryo İş İstasyonu örnek seçimi çubuk kaldırılması için hazırlayın. Azot banyo seçim bloğu kaldırmak için seçim çubuk geri kaydırın. Cryo İş İstasyonu seçim çubuk çıkarın ve TEM eklemek.

3. Kriyo-elektron mikroskobu veri toplanmasında

Bu bölümde sırasında, FEI Toplu Tomografi yazılım arayüzü, tüm grid pozisyonları ilgi koordinatlarını depolayan bir toplu iş dosyası kurmak için kullanılır. Toplu Tomografi yazılım kullanıcı tarafından talimat, her pozisyonların tekrar ve koordine edecekDijital Mikrografik dizi satın alma yoluyla tenteli. Bu yazılım mevcut değilse, Leginon yazılım paketi uygulanabilir ücretsiz, açık kaynak kodlu alternatif ^13. Görüntüleme Gatan Görüntüleme Filtresi (GIF) bir post-GIF 2K x 2K CCD kamera (Gatan) kullanarak, 200 keV yapıldı.

1. Pozisyon Compustage gibi, elektron ışını, vakum yoluyla geçer. Yüksek büyütme (34kX) Pozlama Modu geçme ve doğrudan hizalanmalar gerçekleştirmek.
2. Enerji filtre sıfır kaybı zirve hizalayın. (Bu, sıfır enerji kaybı ile elektronlar için bir referans enerji filtre sağlar.)
3. Compustage karbon ızgara alana taşıyın. + / -15 ° arasında geri ve ileri aşamada yatırmak için düşük büyütme (4.5kX) Arama Modu, Wobbler işlevini kullanın. Bu arada en az evre görülmektedir kadar Z-ekseni sahne konumunu ayarlamak. (Bu eucentric yükseklikte yaklaşık sahne pozisyonları). Herhangi bir evre görülmektedir Wobbler devre dışı bırakın.
4. Otomatik Eucentric Yükseklik f kullanın. unction eucentric yüksekliği rafine. (Bu rutin çapraz korelasyon adım 3.3 'de daha doğru eucentric yüksekliği elde etmek için kullanır). Eucentric yüksekliği, daha sonra başvurmak üzere Toplu Tomografi yazılım tarafından otomatik olarak saklanır.
5. Yaklaşık 3-6 virionlar ilgi alanı ve en az on fiducial belirteçler bulun. Bu grid pozisyonu toplu tomografi dosyası ekleyin.
6. Tekrar adımları 3.4. ve 3.5. kadar istenilen pozisyonların sayısı belirlenir. Toplu iş parametreleri (± 2 ° eğim artışlarla birlikte 60 °, 1-2 e / Å ² / tilt manzaralı) tanımlayın ve toplu çalışacak.

4. Yeniden kriyo-elektron tomogram

1. RAPTOR ¹ fiducial tabanlı otomatik hizalama kullanarak tilt serisi hizalayın.
2. IMOD ⁸ R-ağırlıklı arka projeksiyon kullanarak tomogram yeniden. Ortaya çıkan veri hacimleri için standart dosya biçimi, dosya uzantısına sahip, MRC dosya. Mrc.

ve_title "> 5 virion subvolumes segmentleme tanımlanması ve ani

Bu bölümde kullanıcı tomogram içinde virion subvolumes belirtmek için izin IMOD özelleştirilmiş bir uzantısı kullanır. Bölüm 6, kullanıcı tanımlı virion sınırları ani otomatik olarak seçilir boyunca hangi bir yüzey olarak kullanılır.

1. IMOD açın ve virionlar doldurulur tomogram yük.
2. Tomogram Z-ekseni boyunca virionlar biri aracılığıyla merkezi dilim bulunana kadar gidin. Virion centroid tespit edilmiştir doğrulayın. Bunu yaptıktan sonra, bir virion işaretleyici yatırın. Bu marker Bölüm 6 otomatik virion bölümleme programı tarafından kullanılır.
3. Centroid atama, bütün virion hacimleri tespit oluncaya kadar devam edin.
4. Tomogram kapatın ve virion sentroidler tanımlayan işaret yerini belirlemek kaydedin. Virionlar tüm tomogram atanmış kadar tekrarlayın.
5. Dört bir faktör IMOD, aşağı örnek virion subtomograms.
6. Kenar arttıran anisotropic difüzyon kullanarak Denoise virionlar IMOD uygulanmaktadır.
7. Bir enerji tabanlı üç boyutlu bir yaklaşım (ayrıntılı Bartesaghi et al, ²⁰⁰⁵⁾ 3 denetimsiz membran segmentasyon Konu virionlar .
8. Spike segmente virion yüzeyler üzerinde, özel konumu ve sentetik simetrik bir başak gibi hacmi arasındaki çapraz korelasyon yerel maksimum karşılık gelen noktada tespit edilir. Belirli bir eşiğin üzerinde olanlar yerleri koordinatları varsayılan başak subvolumes için bir listeye eklenir.

6. Parçacıkların sınıflandırılması ve ortalama

1. Hesaplama adım 5.8 'de tespit edildi her yerde tomogram subvolumes (100 x 100 x 100 vokseller) özü. (Bu denoising veya binning olmadan yapılır). Ortaya çıkan toplama subvolumes sınıflandırılmış ve aşağıdaki adımları ortalaması olacaktır başak proteinler içerir.
2. Determine, her başak yerde otomatik olarak bölümlenmiş zarı normal kullanım başak uzun ekseni yönelimleri. Bu yaklaşım, iki üç Euler açıları için ilk tahminler sağlar.
3. Sonraki hizalanmalar olası yanlılığı önlemek için kalan yerinde rotasyon Rastgele.
4. Subvolumes için Euler açıları uygulayın, daha sonra translationally hepsi aynı kütle merkezi sağlamak için silindirik ortalama küresel ortalama subvolumes hizalamak.
5. Güncellenen küresel ortalama ile en az ilişkilidir subvolumes% 10 çıkarın. Bu yanlışlıkla ani belirlendi büyük risk yoğunlukları kaldırmak için yapılır.
6. Hizalayın ve dış başvurular kullanarak olmadan ve uygun muhasebe eksik kama (Bartesaghi ve ark, 2008 ayrıntılı) ⁴ başak hacimleri sınıflandırmak. Kademeli subvolume hizalanmalar rafine ve her tekrarında başak hacimleri sınıflandırmak.
7. Üç katlı simetri açıkça sınıflandırma erken aşamalarında uyulması gereken ve dördüncü yineleme, 3 kat simetri empoze edilir. Her turda, en iyi tanımlanmış sınıflar, ortalama ve bir sonraki tur için referans olarak kullanılır.
8. Genelde ~ 4000 ani her veri kümesi için seçili olmalıdır. Final yoğunluk haritalarının ~ 5-12 arıtma turundan sonra elde edilir ve her bir veri kümesi içinde ~% 50 alt-hacimleri katkıları içerecektir.

7. Uydurma Koordinat

1. UCSF Chimera ¹² adım 6.8 kaynaklanan yoğunluk haritalarının açıldı.
2. X-ray bir simüle 20 Å haritası üretin Chimera veya EMAN ¹⁰ koordine eder.
3. Dock rasgele yönelimler içine koordinatları. Chimera dik havalanması yerel optimizasyonu yerleşik kullanarak, yakınsama elde edilinceye kadar 100 dik tırmanış adımları katları gerçekleştirerek koordinatları uygun.

8. Temsilcisi Sonuçlar

3D ortalama ve koordine uydurma, HIV ve SIV Env başak yapıları çeşitli kullanarak çözüme kavuşturuldu. Sunan Şekil 3A, HIV-1 suşu, Bal (mor) Zarf başak yapıdır. Başak başak apeks membran ölçülen ~ 120 Å boyutları ile simetri, üç kat ve başak baz ~ 35 Å tapers ~ 150 Å maksimum genişlik vardır. Şekil 3B görüldüğü gibi monomerik gp120 crystallographically belirlenen yapı (kırmızı, PDB ID, 2NY7 türetilmiştir) kriyo-elektron tomografisi kullanılarak belirlenir trimerik Env yoğunluk haritası birleştirerek, bizim için çalışan bir molekül modeli elde etmek için başardık trimerik zarf glikoprotein kompleks (PDB kimliği, 3DNN) ^9.

Bizim yaklaşımımız da trimerik Env ve gp120 spesifik protein çeşitli arasında oluşan komplekslerin yapısal analiz sağlarparçaları ve antikorlar. Şekil 4A (tüm karmaşık mor gösterilir) Bu bir örnek, Env büyük ölçüde nötralize b12 Fab ile kompleks olduğu gösterilmiştir. B12 karşılık gelen bu rakam, ekstra yoğunluk başak dışarıya doğru projelendirme ve membran paralel. Bu tür komplekslerin Yapısal yorumlara spike bölümleri için atomik koordinatlar ile ilgili ligand bağlı yoğunluk haritaları takarak moleküler düzeyde uzatılabilir. B12 Fab (beyaz), üç gp120 çekirdek göreli yönelimleri bağlı gp120 başak protein koordinatları (PDB ID, 2NY7 türetilmiş kırmızı,) ile donatılmış bu yoğunluk haritası Şekil 4B, görüldüğü gibi ayırt edilebilir (PDB ID, 3DNL). Bu konformasyonel ilişkileri gibi ligandlar başak ile etkileşime girer ve virüs aktivitesi ile müdahale nasıl anlamak için öğreticidir. Yöntemi ile çözüldü unliganded ve liganded Env diğer bazı yapılar dahil sunduUde olanlar, HIV-1 R3A, SIV CP-MAC, SIVmneE11S ve SIVmac239, HIV-1 Bal Env, sCD4 ve 17b Fab arasındaki üçlü kompleksi ve SIV CP-Mac Env 7D3 antikor ^9,14 complexed.

Şekil 1 viral süspansiyon 3D yapı: kriyo-elektron mikroskobu ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon kavramsal adımları.

Şekil 2 (A) HIV-1 virionlar tomogram temsilcisi dilim. (B) çekirdek ve yüzey ani tek bir HIV-1 virion, şematik olarak gösterilmiştir.

Şekil 3. (A) gibi viral membran yüzey üzerinde görüntülenir, HIV-1 Bal zarf glikoprotein (yüzey sivri) üç boyutlu yapısı . (B) trime Moleküler modeliric ani yoğunluk haritası ⁹ X-ışını kristalografisi elde ettiği monomerik gp120 (kırmızı) için üç nüsha yapıları yerleştirerek tarafından belirlenir.

Şekil 4 (A) HIV-1 Bal Zarf glikoprotein büyük ölçüde nötralize antikor Fab parçası, b12 ile karmaşık üç boyutlu yapısı. (B) kompleksi için Moleküler modeli, yoğunluk ^haritası 9 X-ışını kristalografisi elde ettiği monomerik gp120-B12 Fab kompleks yapıların üç nüsha koyarak belirlenir .

Tartışmalar

Kriyo-elektron mikroskobu ve üç boyutlu sınıflandırma ve ortalama yöntemleri burada zarf glikoprotein kompleksleri ~ 20 Å çözünürlüklü üç boyutlu yapıların belirlenmesi için izin sundu. X-ray Montaj yoğunluk haritalarına monomerik bileşenleri koordinatları moleküler düzeyde yapısal yorumlanması için izin verir. Gelişmelere açık kaynak bilimsel araçlar ve ağ altyapısının yayılması ile birlikte düşük maliyetli bilgisayar donanımları devam eden gelişmeler, daha önce hayal bile edemeyecekleri olası bilimsel işbirliği çabaları olun. Biz bu gelişmelerden yararlanmak ve gelişmiş bilimsel teknikleri birçok yaştaki öğrencilerin ulaşabileceği getirilebilir olduğunu göstermektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Multi-A Delikli Karbon Izgaralar	Quantifoil	-	200 mesh
Protein bir altın kolloid	Utrech Üniversitesi - Hollanda	-	10 nm çapında
HIV-1 Bal	NIH, NCI, Frederick, MD	-	~ 10 11 virionlar / mL
Cryo-EM saklama kutusu	Pasifik Izgara Tech	GB-4R	4-delik, yuvarlak
Vitrobot Mark III	FEI	-	6 saniye leke süresi, -2 mm ofset, nem oranı% 100
Tecnai G2 Polara transmisyon elektron mikroskobu	FEI	-	200 keV
Gatan Görüntüleme Filtre	Gatan	-	-
Gatan Post-GIF CCD	Gatan	-	2K x 2K piksel
Gatan Cryo İş İstasyonu	Gatan	-	-
Gatan Solarus 950 Plazma Temizleme Sistemi	Gatan	-	Oksijen ve hidrojen plazmasının
C - Daha fazla Mesajını bul	FEI	ZIT0634	-
Biowulf işlem kümesi	Ulusal Sağlık Enstitüleri	-	http://biowulf.nih.gov/
Chimera UCSF	University of California - San Francisco	-	http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
IMOD	University of Colorado-Boulder	-	/ Imod / "> http://bio3d.colorado.edu/imod/
EMAN	Baylor College of Medicine	-	http://blake.bcm.tmc.edu/eman/
RAPTOR	Stanford Üniversitesi	-	http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm