Method Article
העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.
על מנת להבין את תפקידם של גנים הביע באזור מסוים של המוח המתפתח, כולל מולקולות איתות והדרכה מולקולות האקסון, העברת גנים מקומיים או עקום החוצה נדרשת. ג'ין מיקוד עקום או עקום החוצה לאזורים המקומי ניתן לבצע בשילוב עם קו Cre ספציפי, שהוא מייגע, יקר, זמן רב. לכן, שיטה transfection פשוט, טכניקה electroporation ברחם, אשר יכול להתבצע עם זמן קצר, יהיה בהישג יד כדי לבדוק את תפקוד אפשרי של גנים מועמדים לפני דור 1,2 חיות טרנסגניות. בנוסף לכך, ב electroporation ברחם מטרות אזורים במוח שבהם אין קו ספציפי Cre קיים, יגביל הקטלניות עובריים 3,4. כאן, אנו מציגים שיטה ב electroporation ברחם שילוב של שני סוגים שונים של אלקטרודות להעברת גנים קל ונוח לתחומי היעד של המוח המתפתח. ראשית, שיטת החזקה ייחודית של עוברים באמצעות סיב אופטי כבל אופטי אור יגרום עוברים קטנים (מ E9.5) גלוי להזרקה פתרון ממוקד דנ"א לתוך החדרים וסוג אלקטרודות מחט הכניסה לאזור המוח ממוקד 5,6. דפוסים של המוח כגון אזור בקליפת המוח מתרחשת בשלב עוברי מוקדם, ולכן, אלה electroporation מוקדם E9.5 תרומה גדולה להבין את האירוע כולו דפוסים אזור. שנית, את הצורה המדויקת של נימי מונע נזק הרחם על ידי יצירת חורים על ידי הכניסה של נימי. יתר על כן, הצורה המדויקת של אלקטרודות מחט נוצרות עם טונגסטן חוט פלטינה חידד שימוש בנייר חול מבודד עם לק 7, שיטה אשר מתואר בפירוט רב בפרוטוקול זה. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד לאזורים מוגבלים של המוח יאפשר עוברי קטן להיות electroporated. זה יעזור, לפתוח חלון חדש של מדענים רבים שעובדים על התמיינות תאים, נדידת תאים, הדרכה האקסון עובריים בשלב מוקדם מאוד. יתרה מכך, טכניקה זו תאפשר למדענים transfect DNA פלסמיד לחלקים העמוקים של המוח המתפתח כגון התלמוס וההיפותלמוס, שם לא רבים ספציפיים באזור קווי Cre קיימים למטרות רווח של הפונקציה (GOF), או הפסד של (LOF) מנתח לתפקד.
1. הכנת פתרון נימי ו-DNA להזרקה
2. סטיק אלקטרודות פלטינה
כאן השתמשנו פלטינה מקל אלקטרודות (Nepe גן, CUY611P2-1) כדי electroporate לאזור שטחיים של המוח, כמו קליפת המוח (איור 1F).
3. הכנת מיקרו אלקטרודות
השתמש מיקרו אלקטרודות electroporated לחלקים העמוקים של המוח (כלומר, התלמוס וההיפותלמוס) (איור 2 ב-E).
4. הכנת הניתוח
5. הזרקה של DNA electroporation
6. הודעה electroporation
7. נציג התוצאות:
כמה דוגמאות של electroporation קליפת המוח של pCAG-EYFP לבנות באמצעות אלקטרודות פלטינה מקל בנקודות זמן שונות מוצגות באיור איור 32. מוחות הם electroporated ב E13.5, E14.5 ו E15.5, וקצרו ביום הלידה (P) 6. AThe מכתים ntibody של RORc מגלה עמדתו של שכבת 4 ואת המיקום של תאים EYFP transfected מתגלים כתמים על ידי נוגדן ה-GFP, והתמונות הן סופר שהוטל (איור 3A ו-B). תאים בקליפת המוח תווית הם שכבה של תאים בקליפת המוח electroporated הוא בבירור שונה בכל ניסוי (איור 32), אשר טוען תלוי זמן electroporation קליפת המוח הופכת שכבת ספציפי GOF / LOF אפשרי.
הכדאיות של עוברים והיעילות של transfection התא משתנה בהתאם לגיל העובר ואת המיקום של electroporation. דוגמאות מפורטות על טבלה מס '1, לעומת זאת, התנאים צריכים להיות מותאמים לכל electroporation בהתאם הבמה חלק של המוח.
Electroporation לתוך רקמות עמוק כגון התלמוס וההיפותלמוס עם פלטינה באמצעות אלקטרודות מקל לעתים קרובות לתת יעילות נמוכה (טבלה 1). בעיה זו ניתן לפתור באמצעות מיקרו אלקטרודות whichelectrodes, אשר תגיע לחלקים העמוקים של המוח. איור 3 4 מראה דוגמה electroporation pCAG-EYFP לתוך diencephalon המתפתח. פתרון ה-DNA פלסמיד מוזרק לתוך ה -3 החדר בבית E11.5 ואחריו מיקרו electroporation (איור 3C4C). האזור electroporated מוגבל בתלמוס שבה רוב הפרויקט אקסונים אל הקורטקס (איור 3B4B). הקרנת אקסון לשכבה 4 של קליפת ניתן דמיינו גם EYFP, אשר fillesfills את נוירון כולו. (איור 3A4A).
באיור 1. סכמטית Cartoon הוכחת את הצורה הנכונה של נימי. (א) צינור זכוכית נימי הוא משך באמצעות חולץ micropipette לעשות צורה מסוימת. טיפ כבוי צבט ידי מלקחיים כדי לעשות את זה 20-30 מיקרומטר. מדד 800 מיקרומטר-1mm מקצה (סוגר אדום) ולוודא כי קוטר חיצוני הוא פחות מ 60 מיקרומטר (סוגר ירוק). (ב) קצה אחד של טונגסטן או חוטי פלטינה הוא מפותל על מצופה זהב סיכות קבוע עם parafilm. ואז להשתמש בנייר חול לבצע קצה שלהם להפוך 2-30 קוטר חיצוני מיקרומטר ו 60 מיקרומטר 1 מ"מ של קצה. (ג) תמונה של חוט טונגסטן לפני בעיצוב. (ד) תמונה של חוט טונגסטן לאחר עיצוב. (ה) תמונה של חוט טונגסטן לאחר החלת מעיל דק של לק. בר סולם ב E הוא 10 מיקרומטר (בקנה מידה קטן) עבור לספירה. (F) פלטינה Stick אלקטרודות (גן Nepa. CUY611P2-1). בר סולם בפה הוא 2 מ"מ.
איור 2. Cartoon סכימה של הליך כירורגי. (א) תרשים של הזרקה לתוך החדר לרוחב או עוברי גדול (צד שמאל) לתוך החדר ה -3 או עוברי קטן (צד ימין). (ב) תרשים של electrporation ידי אלקטרודה פלטינה מקל (צד שמאל) על ידי אלקטרודה מחט סוג (צד ימין).
איור 3. פיתוח עכבר telencephalon היה electroporated עם pCAG-EYFP E13.5 ב (א), E14.5 (B) E15.5 (C) שנקטפו ב P6. המוח נותחו העטרה ומוכתמת עם נוגדן GFP או נוגדן RORc בנפרד ותמונות ימוזגו. (א) electroporation של pCAG-EYFP פלסמיד ב E13.5 transfect 4 נוירונים רבים בשכבה. אשר חפיפה עם שכבת סמנים RORc 4. (ב) electroporation של pCAG-EYFP פלסמיד ב E14.5 תאים transfect, שהם שטחיים יותר שכבה 4 נוירונים. (ג) E15.5 תווית electroporation נוירונים שטחית רבים כגון שכבה 2 / 3. סולם בר 200 מיקרומטר.
איור 4. Transfection של EYFP לתוך thalamo-קליפת המוח אקסונים (TCA). (א) הסופית TCA בשכבה קורטיקליים 4 מתגלה על ידי מכתים נוגדן ה-GFP. מכתים RORc הנוגדן משמש כדי לחשוף את המיקום של שכבה 4. התמונות הן לקוחים סעיף זהה הממוזג. (ב) קבוצה של electroporation אל התלמוס מוצג גם על ידי צביעת נוגדן ה-GFP ו מכתים RORc, אשר הביטוי מוגבל של התלמוס 11. (ג) סכמטית Cartoon עבור electroporation thalamic והשלכה TCA מוצגים. סולם בר 200 מיקרומטר.
בפרוטוקול זה, אנחנו רק תיאר היתרונות של השיטה של transfection pCAG-EYFP לאזור המוגבל של מוח העובר קטן באמצעות אלקטרודות בצורת שונות. לשם השוואה של יעילות transfection על ידי האמרגן שונה שתואר לעיל, אשר מציגה סוג תא סגוליות 1. עם זאת, ישנן מגבלות על הטכניקה, כגון transfection הוא חולף רק משתנה תלוי פלסמיד, אין לו שום ייחוד תא וקשה לשלוט במספרים של תאים transfected. ThereforeHowever, שילוב של פרוטוקול זה עם טכניקות אחרות יהיה עוד לספק אפשרויות שיטות מניפולציה שונות. ראשית, שילוב מקדם תאים ספציפיים לתוך פלסמיד דנ"א יאפשר לתא מסוג transfection ספציפיים, כגון נוירונים ותאי גלייה ו האסטרוציטים. שנית, מאז transfection הוא חולף, זה לא מתאים מדענים שרוצים לנתח את הפונקציה של הגן בשלב מאוחר יותר בחיים. לכן, בשילוב עם transposase לעשות פלסמיד דנ"א להשתלב בגנום יהיה להמיר אותו לתוך transfection יציב 8. האימוץ הבא של ט או ט את המערכת תאפשר לתפעל את העיתוי או סוג תא ספציפי ביטוי גנים בתאים עצביים 8. לחלופין, אפשר לשלב את זה עם פרוטוקול ועין מתנהלת-טמוקסיפן Cre-ER (T) recombinases 9 ועכברים הכתב 10.
זו נגישות רחבה של רקמות יהיה דרסטי לשנות עיצובים ניסיוניים בשימוש במדעי המוח.
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
עבודה זו מומנה על ידי המכון למדעי המוח RIKEN (BSI), תוכנית האדם Frontier Science (HFSP) (הוענק TS) ו RIKEN תוכנית ג'וניור עמית מחקר (JRA, העניק לח"כ) RIKEN המכון למדעי המוח (BSI), תוכנית אנוש המדע Frontier (HFSP) (הוענק TS) ו RIKEN עמית ג'וניור תוכנית המחקר (JRA, העניק לח"כ) מימנה את העבודה הזאת.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | |
טונגסטן חשוף חוט בקוטר 125 מיקרומטר | AM מערכות | 797600 | |
פלטינה חשוף חוט בקוטר 125 מיקרומטר | AM מערכות | 767000 | |
סטיק אלקטרודות | Nepa גן | CUY610P4-1 | |
צינור זכוכית נימי | Stoelting | 50611 | |
micromanipulator | KD מדעי | KDS310 | |
מספרים | ROBOZ | RS-5865 | |
הדופק גנרטור | AM מערכות | דגם 2100 | |
9 מ"מ autoclip | ROBOZ | RS-9260 | |
מצופה זהב סיכות | WPI | 5482 | |
RORc נוגדן | פרסאוס Proteomics | H3925 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved