Method Article
Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.
Gelişmekte olan beyin, sinyal molekülleri ve akson rehberlik molekülleri, yerel gen transferi veya knock-out gereklidir dahil olmak üzere belirli bir bölgedeki genlerin işlevini anlamak için. Knock-knock-out hedefleme Gen yerel bölgeye belirli bir zahmetli, masraflı CRE hattı, ve zaman alıcı bir kombinasyonu ile gerçekleştirmek mümkün. Bu nedenle, basit bir transfeksiyon yöntemi, kısa sürede yapılabilir bir utero elektroporasyon tekniği, transgenik hayvanlar 1,2 nesil öncesinde aday genlerin olası fonksiyon testi için kullanışlı olacaktır. Buna ek olarak, in utero elektroporasyon, belirli bir CRE hattı var olan beyin alanları hedef ve embriyonik öldürücülüğü 3,4 sınırlayacaktır . Burada, biz, basit ve kullanışlı bir gen transferi için iki farklı tür elektrotlar birleştirerek gelişmekte olan beyin hedef alanlara utero elektroporasyon bir yöntem mevcut. İlk olarak, benzersiz bir optik fiber optik ışık kablosu kullanarak bir embriyo tutma yöntemi ventriküller ve hedeflenen beyin alanı 5,6 iğne tipi elektrodlar ekleme içine hedeflenen DNA çözüm enjeksiyon için görünür küçük embriyolar (E9.5) yapacaktır . Bu nedenle, kortikal alanı gibi beyin desenlendirme E9.5 bu erken elektroporasyon tüm alanı desenlendirme olayı anlamak için büyük bir katkı yapmak, erken embriyonik aşamada meydana gelir. İkincisi, bir kılcal kesin şeklini kılcal ekleme delik yaparak rahim zarar görmesini engeller. Ayrıca, iğne elektrotlar kesin şeklini tungsten ve platin tel ile oluşturulan ve zımpara kağıdı kullanarak bilenmiş ve tırnak cilası 7, bu protokol çok detaylı olarak açıklanan bir yöntem ile izole edilir. Bu benzersiz tekniği, beynin sınırlı alanlar içine plazmid DNA transfeksiyon sağlar ve küçük embriyolar electroporated olmasını sağlayacak. Bu, çok erken embriyonik aşamada hücre farklılaşması, hücre göçü, akson rehberliği üzerinde çalışıyoruz birçok bilim adamları için yeni bir pencere açmak için yardımcı olacaktır. Ayrıca, bu teknik, bilim adamları, birçok bölgeye özel CRE hatları fonksiyon kazanç (GOF) veya fonksiyon (LOF) analizleri kaybı var talamus ve hipotalamus, beyin gibi gelişmekte olan derin bölüme plazmid DNA transfect sağlayacaktır.
1. Kapiller ve DNA çözüm enjeksiyon için hazırlanması
2. Platin elektrot Kaynaş
Burada beyin korteks (Şekil 1F) gibi yüzeysel bölge içine electroporate sopa platin elektrotlar (Nepe gen, CUY611P2-1) kullanılır.
3. Mikro elektrotlar hazırlanması
Beyin (yani, talamus ve hipotalamus) (Şekil 2B-E) derin bölüme electroporated için mikro elektrotlar kullanın.
4. Ameliyat hazırlanması
5. DNA ve elektroporasyon Enjeksiyon
6. Mesaj elektroporasyon
7. Temsilcisi sonuçları:
PCAG-EYFP kortikal elektroporasyon bazı örnekler, farklı zaman noktalarında sopa platin elektrot kullanılarak inşa şekil Şekil 32 de gösterilmiştir. Brain E13.5, E14.5, E15.5 electroporated ve postnatal gün (P) 6 hasat edilir. Ortaya çıkan ntibody boyama RORC 'ün 4. katmandaki ve EYFP transfekte hücreleri konumunu konumu GFP antikor boyama ile ortaya ortaya çıkarır ve her iki görüntüler dayatılan süper (Şekil 3A ve B) . Etiketli kortikal hücreler, zaman-bağımlı elektroporasyon kortikal tabaka özel GOF / LOF mümkün kılar (Şekil 32), her bir deney electroporated kortikal hücreler katmanı açıkça farklıdır.
Hücre transfeksiyon embriyolar ve verimlilik canlılığı, embriyonun yaşına ve elektroporasyon yerini bağlı olarak değişir. Örnekler Tablo 1'de listelenmiştir, ancak, koşullar sahne ve beynin bir parçası olarak her elektroporasyon için optimize edilmiş olmalıdır.
Sopa platin elektrotları ile talamus ve hipotalamus gibi derin bir doku içine Elektroporasyon genelde düşük verimlilik (Tablo 1) verir. Beynin derin bölgelerine ulaşacak whichelectrodes, mikro elektrotlar kullanarak bu sorun çözülebilir. Şekil 3, gelişmekte olan diensefalon pCAG EYFP elektroporasyon 4 gösterileri örnek. Plazmid DNA çözüm E11.5 3. ventrikül içine enjekte edilir ve mikro elektroporasyon (Şekil 3C4C) tarafından takip edilmektedir. Electroporated alan talamus sınırlıdır korteks (Şekil 3B4B) aksonlar proje. Korteks tabakası 4 Akson, projeksiyon, aynı zamanda tüm nöron fillesfills EYFP tarafından görüntülenmiştir. (Şekil 3A4A).
Şekil 1 Cartoon kılcal doğru şekli gösteren şematik. (A) cam kapiller tüp, belli bir şekli yapmak için bir mikropipet çektirmesi ile çekilir. Bir ucu 20-30 mikron yapmak için forseps sıkışmak kapalı. Ucu (kırmızı dirsek) 800 mm-1mm ölçün ve dış çapı 60 mikron (yeşil dirsek) daha az olduğundan emin olun. (B), tungsten veya platin tel Bir ucu altın kaplama pimlerin üzerine sarılmış ve parafilm ile sabittir. Daha sonra ucu 1 mm den 20-30 mikron dış çap ve 60 mm olmak için bahşiş yapmak için zımpara kağıdı kullanın. (C) Görüntü tungsten tel şekillendirme önce. (D), tungsten tel şekillendirme sonra Image. (E), ince bir kat oje uygulandıktan sonra tungsten tel Resim. E Ölçekli bar CE için 10 mikron (küçük ölçekli). (F) Stick platin elektrot (Nepa gen. CUY611P2-1). F Ölçekli bar, 2 mm.
Şekil 2 cerrahi işlemin Karikatür şema. (A), lateral ventrikül veya büyük embriyolar (sol taraf) içine ve 3. ventrikül veya küçük embriyolar (sağ tarafı) içine enjeksiyon Diyagramı . (B) platin çubuk elektrot (sol taraf) ve iğne tipi elektrot (sağ tarafı) tarafından electrporation Diyagramı.
Şekil 3 fare telencephalon geliştirilmesi E13.5 (A) E14.5 (B) ve E15.5 (C) pCAG-EYFP electroporated ve P6 hasat edildi. Brain ayrı koronal kesitli ve GFP antikor veya RORC 'ün antikor ile boyandı ve görüntüler birleştirilir. (A) E13.5 transfect birçok katman 4 nöronlar pCAG-EYFP plazmid Elektroporasyon. 4 belirteçlerinin RORC 'ün tabakası ile örtüşmektedir. Katman 4 nöronlar daha yüzeysel E14.5 transfect hücreler, (B) pCAG-EYFP plazmid Elektroporasyon. (C) E15.5 layer 2 / 3 gibi elektroporasyon etiket birçok yüzeysel nöronlar. Ölçek çubuğu 200 mm.
Şekil 4 talamo-kortikal aksonlar (TCA) içine EYFP Transfeksiyon. (A) kortikal 4. katmandaki TCA terminus GFP antikor boyama ile ortaya çıkar. RORC 'ün antikor boyama, 4 katmanlı bir pozisyon ortaya çıkarmak için kullanılır. Her iki görüntü aynı bölümde alınan ve birleştirilir. (B) talamus içine elektroporasyon konumu ifade talamus 11 sınırlıdır GFP antikor boyama ve RORC 'ün boyama, aynı zamanda gösterilir. (C) talamik elektroporasyon ve TCA projeksiyon Karikatür şematik gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 200 mm.
Bu protokol, biz sadece, farklı şeklinde elektrotlar kullanarak küçük bir embriyonik beyin kısıtlı alana pCAG EYFP transfeksiyon tekniği yararları nitelendirdi. Transfeksiyon verimlilik karşılaştırması farklı organizatörü tarafından daha önce açıklandığı için, hücre tipi özgüllüğü 1 gösterir. Ancak, sadece geçici ve plazmid bağlıdır değişir transfeksiyon gibi tekniği, sınırlamalar vardır, herhangi bir hücreyi özgüllüğü sahip değildir ve transfekte hücrelerinin sayısını kontrol altında tutmak zordur. ThereforeHowever, bu protokolü diğer tekniklerle birleştirerek daha farklı işleme yöntemleri için olanakları sağlayacaktır. İlk olarak, plazmid DNA hücre içine özel organizatörü birleştiren, nöronlar, glial hücreler ve astrositler hücre türüne özgü transfeksiyon sağlayacaktır. İkincisi, transfeksiyon geçici olduğundan, sonraki hayatında genin fonksiyonunu analiz etmek isteyen bilim adamları için uygun değildir. Bu nedenle, plazmid DNA genom entegre olmak için bir transposase ile birlikte istikrarlı bir transfeksiyon 8 dönüştürmek . Tet-veya tet-off sistemi, evlat edinme 8 sinir hücreleri veya hücre tipine özgü gen ekspresyonu zamanlama işlemek için mümkün kılacaktır. Alternatif olarak, bu protokol tamoksifen-indüklenebilir Cre-ER (T) recombinases 9 ve muhabir fareler 10 birleştirebilirsiniz.
Dokuların Bu geniş erişilebilirlik nörobilim kullanılan deneysel tasarımları büyük ölçüde değişecektir.
Çıkar çatışması ilan etti.
Bu çalışma RIKEN Beyin Bilimi Enstitüsü (BSI), İnsan Frontier Bilim Programı (HFSP) (TS verilen) ve RIKEN Junior Araştırma İşbirliği Programı (JRA), MK verilen RIKEN Beyin Bilimi Enstitüsü (BSI), İnsan Frontier Lisans Programı tarafından finanse edildi (HFSP) (TS ödüllendirildi) ve RIKEN Seyirci Araştırma İşbirliği Programı (JRA, MK verilen) bu işi finanse.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reaktifin Adı | Şirket | Katalog numarası | |
çıplak tungsten tel çapı 125 mm | AM sistemleri | 797600 | |
çıplak platin tel çapı 125 mm | AM sistemleri | 767000 | |
Çubuk elektrotlar | Nepa gen | CUY610P4-1 | |
Cam kılcal tüp | Stoelting | 50611 | |
mikromanipülatör | KD Bilimsel | KDS310 | |
makas | ROBOZ | RS-5865 | |
darbe jeneratörü | AM Sistemleri | Model 2100 | |
9 mm AutoCLIP | ROBOZ | RS-9260 | |
altın kaplama pinler | TEFE | 5482 | |
RORC 'ün antikor | Perseus Proteomik | H3925 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır