ריכוז מטבוליטים של צפיפות נמוכה עבור קהילות Planktonic metabolomics הסביבה באמצעות תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה

Summary

שיטה להפקת המטבוליט מקהילות planktonic חיידקים מוצגת. דגימה כל הקהילה מושג באמצעות סינון על מסנני שהוכנו במיוחד. לאחר lyophilization, מימית מסיסים מטבוליטים חילוץ. גישה זו מאפשרת יישום של metabolomics סביבתיים חוצה omics חקירות של קהילות חיידקים טבעיים או ניסיוני.

Abstract

Metabolomics הסביבה היא תחום המתפתח כי הוא מקדם הבנה חדשה כיצד אורגניזמים להגיב ולתקשר עם הסביבה ועל זה ברמה הביוכימית ^1. ספקטרוסקופיה מגנטית גרעינית (NMR) תהודה היא אחת מספר טכנולוגיות, כולל כרומטוגרפיה המוני גז ספקטרומטריית (GC-MS), עם הבטחה רבה מחקרים כאלה. היתרונות של התמ"ג הם כי הוא מתאים ניתוחים לא ממוקדים, מספק מידע מבניים ספקטרה ניתן שאילתה באופנים כמותיים וסטטיסטיים מול מסדי נתונים זמינים לאחרונה של ספקטרום המטבוליט הפרט ^2,3. בנוסף, נתוני תמ"ג ספקטרליות ניתן לשלב עם נתונים אחרים (רמות omics transcriptomics למשל הגנומיקה) כדי לספק הבנה מקיפה יותר של התגובות הפיזיולוגיות של מינים זה לזה ולסביבה ^4,5,6. עם זאת, התמ"ג הוא רגיש פחות טכניקות metabolomic אחרים, ולכן קשה APרובדי חיידקים למערכות הטבעיות שבה אוכלוסיות המדגם ניתן בריכוזים נמוכים, צפיפות המטבוליט נמוכה בהשוואה מטבוליטים של מוגדרים היטב ובנפש חפצה מקורות שניתן להפיק כגון רקמות, biofluids שלמים או תאים תרבויות. כתוצאה מכך, המחקרים המעטים ישיר metabolomic הסביבתיות של חיידקים שבוצעו עד כה היה מוגבל צפיפות גבוהה מערכות אקולוגיות התרבות מבוססות או להגדיר בקלות כמו מארח הסימביונט מערכות, שנבנו שיתוף תרבויות או מניפולציות של הסביבה שבה המעיים תיוג איזוטופ יציב יכול להיות בנוסף משמש כדי לשפר את אותות תמ"ג ^{7,8,9,10,11,12.} שיטות להקל על ריכוז ואיסוף של מטבוליטים סביבתיים בריכוזים מתאימים NMR חסרים. מאז תשומת לב לאחרונה ניתנה על metabolomics הסביבתיות של אורגניזמים בתוך הסביבה המימית, שם הרבה זרימת האנרגיה והחומר מתווך על ידי הקהילה planktonic ^13,14, פיתחנו שיטה הריכוזtion והפקת כולו הקהילה מטבוליטים של מערכות חיידקים planktonic על ידי סינון. זמינים מסחרית הידרופילי פולי-1 ,1-difluoroethene (PVDF) מסננים מטופלים במיוחד כדי להסיר לחלוטין extractables, אשר יכול אחרת המופיעים מזהמים ניתוחים שלאחר מכן. מסננים אלה שטופלו משמשות לאחר מכן כדי לסנן דגימות סביבתיות או ניסיוני של עניין. מסננים המכילים את החומר מדגם רטוב הם lyophilized ו מימית מסיסים מטבוליטים מופקים ישירות ספקטרוסקופית NMR קונבנציונאלי באמצעות אשלגן זרחתי מיצוי מתוקנן חיץ ^2. הנתונים המופקים בשיטות אלו ניתן לנתח סטטיסטית לזהות תבניות בעלות משמעות, או משולב עם רמות omics אחרים הבנה מקיפה של הקהילה ותפקוד המערכת האקולוגית.

Protocol

1. הכנה מסנן להסיר extractables

1. השתמש 25 מ"מ בקוטר 0.22 מיקרומטר נקבוביות בגודל Durapore מסננים PVDF הידרופילי (Millipore). מקום מסננים כוס נקי 500 מ"ל פיירקס באמצעות פינצטה. לפני שלוש פעמים לשטוף עם מים מזוקקים. מערבולת גם לך לשטוף את המסננים כדי למנוע יידבקו זה לזה. הוספת 300 מ"ל מילי-Q (Millipore) או מים שווה ערך באיכות גבוהה. החיטוי כדי להקל על הסרה מלאה של extractables מן המסננים.
2. יוצקים את מילי-Q ושוב טריפל לשטוף את המסננים, הפעם עם מילי-Q. שימוש במסננים פינצטה מקום בודדים על משטח יבש ונקי (כגון אלומיניום) ויבש גם בטמפרטורה סבירה (למשל 37 ° C) או אוויר יבש. המסננים נמצאים כעת מוכן לשימוש.

2. סינון של חומר דגימה

1. עבור הוכחת בפרוטוקול זה, נירוסטה Millipore 3 במקום סעפת פילטר עם 25 מ"מ עמודות microanalysis מסנן עם זכוכית תומךומשאבה מכנית משמשים. באמצעות טכניקה האספטי, הנח מסנן אחד 25 מ"מ על בסיס טור מסנן, החל את העמודה לצבוט יחד.
2. טען 15 מ"ל של דגימה לעמודה, פתח את שסתום עצירה על סעפת פילטר, והפעל את המשאבה. סנן תחת לחץ מתון כדי למזער שבירה תא (<5 kPa). משאבות אחרות, כגון יד או משאבת peristaltic יכול להיות מותאם פרוטוקול זה. לקבלת דוגמיות צפיפות נמוכה יותר, תוספות רצופים של מים עשוי להיות נחוץ, אל תיתן מסנן ללכת יבש במשך תקופה ארוכה של זמן בין תוספת של מים.
3. לקבלת דוגמיות ימיים, לאחר שהחלת סינון לדוגמה, תוכל לבצע שטיפה במים מתוקים לא חובה להפחית יונים פאראמגנטיים שיורית במדגם שלך על המסנן. זה עשוי לעזור עם כוונון מדויק יותר של המגנט ספקטרומטר. פשוט בעדינות להוסיף נפח קטן של מים ולסנן דרך המדגם נאספו שלך בסוף.
4. לאחר סינון נגמר, כבה את המשאבה, ולהשאיר אופ שסתוםn כך שאין עדיין תחת לחץ שלילי המסנן. הסר את תפס ועמודה הסינון.
5. עם יד אחת, להשתמש בפינצטה נקיים לאחוז המסנן. מקפלים את המסנן על עצמו, אבל לא קמט. עם היד השנייה להשתמש השפה של הצינור 2-מ"ל סטרילי microcentrifuge להחזיק את המסנן. לשחרר את פינצטה ואז להשתמש בהם כדי לתפוס מחדש את שני הקצוות של המסנן. Regrip על 45 ° זווית לקיפול.
6. מניחים את המסנן לתוך צינור 2-ml ושחרור כך נפתח בצד מדגם מול פנימה. ניתן למקם עד שני מסננים לתוך צינור מ"ל סטרילי 2 microcentrifuge כך. אם באמצעות שני מסננים, להבטיח חפיפה מועטה ככל האפשר. מיד להקפיא (לפחות -30 ° C).

3. הפקת מימית מסיסים מטבוליטים

1. Lyophilize דגימות שלך לילה או לפחות 10 שעות.
2. לאחר lyophilization, להוסיף מגרסה נירוסטה לצינור זה (Tokken). הוסף 750 μl אשלגן סטנדרטיתפוספט חיץ התמ"ג ב תחמוצת דאוטריום ⁽² H> 90%) עם 2.2-דימתיל-2-silapentane-5-sulfonate (DSS) סטנדרטי (KPI, 38.3 mM KH ₂ PO _4, 61.7 mM K ₂ HPO _4, DSS 0.1 מ"מ, pH 7.0, 90% D ₂ O) ^2.
3. Sonicate דגימות במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס sonicator מים (Bioruptor, Diagenode) להסיר את החומר לתא מן המסנן. הסר את המסננים עם פינצטה נקיים.
4. לשבש את התאים באמצעות מגרסה הטחנה (1600 סל"ד) במשך 5 דקות.
5. דגירה על 65 מעלות צלזיוס עם רעד (1400 סל"ד) על הספסל העליון שאכר (Eppendorf) במשך 15 דקות.
6. הסר את החזיר מתכת עם פינצטה נקיים, צנטריפוגות מדגם של 13,000 גרם במשך 5 דקות.
7. צייר את supernatant ישירות צינור NMR עבור NMR ספקטרוסקופיה.

4. NMR ספקטרוסקופיה וניתוח נתונים

1. טען המדגם שלך ספקטרומטר התמ"ג (כאן, DRX-500 Bruker ספקטרומטר מצוידTXI בדיקה משולשת עם שיפוע ציר נשלט על ידי המחשב פועל XWIN-NMR).
2. קבל ¹ 1D H ספקטרום NMR בשיטות שפורסמו בעבר המתאימים ^2,15 מממשק XWIN-NMR. במחקר הנוכחי ¹ H NMR ספקטרה נרשמו על ההפעלה DRX-500 MHz ספקטרומטר ב 500.03 ב אותות 298 ק מים שנשארו דוכאו על ידי רצף הדופק ווטרגייט, עם הזמן חזרה על 1.2 s. 128 הארעיים נאספו להשיג 32,000 נקודות נתונים בכל הספקטרום.
3. להעביר את נתוני תמ"ג מדריכים למחשב התקנת תוכנה NMRPipe ^16. לעבד את הנתונים גלם DSS כמפורט 0 התייחסות עמודים לדקה באופן ידני בשלב ספקטרה. לספרת את הנתונים רפאים לתוך מערכת של ערכים בדידים על ידי שילוב או "binning" אותם עם תוכנה כגון rNMR, Automics, או באמצעות חבילת FT2B זמין לציבור באתר האינטרנט של ECOMICS ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) ^3,17. במאות ההוא למשל, ספקטרה שולבו בין ppm 0.5 ו 10.5 על 0.032 אזורים בלתי נפרד עמודים לדקה באמצעות ECOMICS ו לנורמליזציה לאחת DSS או עוצמת האות מוחלט. נתוני הפלט כעת ניתן להשתמש לניתוח סטטיסטי במורד כגון ניתוח מרכיבים עיקריים (PCA), תוך שימוש בחבילות תוכנה חופשית כמו R ^18.

5. נציג תוצאות

דוגמה ¹ ספקטרום NMR H המתקבל באמצעות השיטות הנ"ל מוצגים באיור 1. דוגמאות אלה, משתי נקודות זמן הניסוי מיקרוקוסמוס מראים הבדלים ברורים בשל פעילות מטבולית אצות. קשת יום 4 מציג שפע רב של פסגות, במיוחד בטווח 3-4 עמודים לדקה לעומת המדגם 1 יום. פסגות אלה ניתן לייחס סוכרים המיוצר על ידי פורח הצורניות בתוך המיקרוקוסמוס. בניסוי דומה להשוות את הצמיחה של טבע הקהילות הפלנקטון במי ים מלאכותיים או טבעיים, שיטות סטטיסטיות שלuch כמו העלילה העיקרי ניתוח מרכיבים ציון (PCA) נגזר ספקטרום NMR זרקת לפח ניתן להשתמש כדי להראות הבדלים מטבוליים ברורים בין שני הטיפולים (איור 2), ואילו מגרשים טעינת ניתן לזהות פסגות בתוך הספקטרום כי צורת ההפצה של הנתונים . תוצאות אלה ניתן להשוות את נתוני רמות omics אחרות, כגון טביעות אצבעות משיטות גנומית (איור 3). פסגות אלה תמ"ג ניתן שאילתה בנפרד (למשל על BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ) ^19, או כל ספקטרום ניתן לנתח סטטיסטית (למשל עם SpinAssign ב http://prime.psc.riken. jp /? פעולה = nmr_search ) ^2. בדוגמה זו, ההבדלים בין הטיפולים היו בשל שפע של פסגות באזור סוכרים (3.39 ppm ל 4.04 ppm) של ספקטרום מן הטבע מטבוליטים פלנקטון הקהילה, ואת פסגות כמה אופייני לקהילות מי ים מלאכותיים היו בהיסוס IDEntified כמו חומצת חלב ו formate באמצעות SpinAssign.

באיור 1. נציג ¹ H ספקטרום NMR המתקבל דגימות מעובד באמצעות הליך זה. דגימות נלקחו לפני מיקרוקוסמוס (יום 1) ובמהלך בלום (יום 4) diatom אינטנסיבי. הניסויים בוצעו על תמ"ג Bruker DRX-500 עם אותות מנורמל לגובה שיא פנימי סטנדרטי (DSS: 0 ppm).

איור 2. ניתוח מרכיבים ראשיים (PCA) ציון על העלילה של ספקטרום NMR זרקת לפח מ metabolomes של טבעי המופק planktonic קהילות חיידקים הגדלים מיקרוקוסמוס עם טבעי (ללא יהלומים) פתוחים או מי ים מלאכותיים (עיגולים שחורים). הבדלים מטבוליים ברורים ניתן לצפות scatterplot. העלילה טוען מניתוח כזה יכול לשמש כדי לזהות שיאים שונים של חשיבותהמערכת; פסגות אלו ניתן לנתח נוספת לפי הצורך.

איור 3. דוגמה ניתוח רב omics שילוב NMR עם הנתונים הגנומי. הרכב הקהילה מבוסס על אלקטרופורזה denaturing צבע ג'ל של 18s (משמאל) 16S (מימין) גנים rRNA מן דגימות אותו כפי שנותחו איור 2 מראה גם חיידקים שונים בקהילה (בין דפוסי יהלומים) פתוחים טבעיים ומלאכותיים (עיגולים שחורים) מיקרוקוסמוס מי ים. התכתבות כזו בין metabolome ו הגנום של מערכות טבעיות ממחיש את התועלת של גישה זו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שיטת סינון המטבוליט החילוץ הפגינו כאן מאפשר ביומסה planktonic חיידקים כדי לאסוף כמות מספקת metabolomics תמ"ג. תוך מיצוי רק מימית מסיסים מטבוליטים באמצעות KPI ו 1D ¹ H NMR באה לידי ביטוי, מיצוי בממסים אחרים וגישות ספקטרוסקופיות ניתן להשתמש. דוגמה שימושית הוא השימוש מתנול deutera...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
0.22 הידרופילי מיקרומטר Durapore PVDF מסננים, 25 מ"מ	Millipore	GVWP02500
בעל מסנן Microanalysis, 25 מ"מ, fritted תמיכה זכוכית	Millipore	XX1002500
3 במקום סעפת, 47 מ"מ, נירוסטה	Millipore	XX2504735
KH 2 PO 4	Wako	169-04245
K 2 HPO 4	Wako	164-04295
תחמוצת דאוטריום, 2 H> 90%	Campridge איזוטופ Laboratoties	DLM-4	>
DSS	Fluka	92754
Automill	Tokken	TK-AM4	Crushers נירוסטה כלל
Thermomixer נוחות	Eppendorf	5355 000.011
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
אבק המאייד	EYELA	CVE-3100
התמ"ג	Bruker	DRX-500 עם בדיקה מ"מ TXI 5
כלי binning רפאים	פותח במקור	FT2DB	https://database.riken.jp/ecomics/
ביאור כלי מסד נתונים המטבוליט ו	פותח במקור	SpinAssign	= Nmr_search "> http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search