Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Çevre metabolomik için düşük yoğunluklu Planktonik topluluklardan Metabolitlerinin Konsantrasyon

Özet

Mikrobiyal planktonik toplulukların metaboliti çıkarımı için bir yöntem sunulmaktadır. Tüm topluluk örnekleme özel hazırlanmış filtreler üzerine filtrasyon sağlanır. Liyofilizasyon sonra, sulu çözünür metabolitleri ekstre edilir. Bu yaklaşım doğal ya da deneysel mikrobiyal toplulukların trans-omik araştırmalar çevre metabolomik uygulaması için izin verir.

Özet

Çevre metabolomik organizmalar cevap ve biyokimyasal ^1. düzeyde çevre ve birbirleri ile nasıl etkileşime yeni bir anlayışın geliştirilmesinde bir gelişmekte olan bir alandır. Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi gibi çalışmalar için önemli vaadi ile, gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) dahil olmak üzere çeşitli teknolojileri biridir. NMR avantajları, hedefsiz analizler için uygundur yapısal bilgi sağlar ve spektrumları bireysel metaboliti spektrumları ^2,3, son zamanlarda mevcut veri tabanları karşı niceliksel ve istatistiksel davranış içinde sorgulanabilir olmasıdır. Buna ek olarak, NMR spektral veriler birbirine taksonların fizyolojik yanıtları ve çevre ^4,5,6 daha kapsamlı bir anlaşılmasını sağlamak için başka bir omik seviyeleri (örn. transkriptomik, genomik) veriler ile kombine edilebilir. Ancak, NMR zor yapma, diğer metabolomic yöntemlerine göre daha az duyarlı olduğu aphasta populasyonu düşük iyi tanımlanmış ve bu bütün dokuları, biofluids veya hücre kültürleri gibi kolayca ekstrakte kaynakları. metabolitlerin kıyasla düşük yoğunluklu ve metabolit konsantrasyonları olabilir doğal mikrobiyal sistemlerine kat Sonuç olarak, bugüne kadar yapılan mikropların birkaç doğrudan çevresel metabolomic çalışmalar, ana-symbiont sistemleri gibi kültür-tabanlı veya kolayca tanımlanan yüksek yoğunluklu ekosistemler, kararlı izotop etiketleme olabilir bağırsak çevre ko-kültür veya manipülasyonlar inşa sınırlı olmuştur Buna ek olarak NMR sinyalleri ^{7,8,9,10,11,12} artırmak için kullanılır. NMR için uygun konsantrasyonda çevresel metabolitlerinin konsantrasyonu ve toplanmasını kolaylaştırmak yöntemler eksiktir. Son dikkatini çok enerji ve malzeme akışının planktonik topluluk ^13,14 aracılık su ortamında, içindeki organizmaların çevre metabolomik verilmiş olduğundan, biz konsantrasyon için bir yöntem geliştirdiTION ve süzülerek planktonik mikrobiyal sistemlerinden tam topluluk metabolitlerin çıkarma. Piyasada bulunan hidrofilik poli-1 ,1-difluoroethene (PVDF) filtreleri özel olarak tamamen aksi takdirde daha sonraki analizlerde kirleticiler gibi görünebilir özleri, kaldırmak için tedavi edilir. Bu tedavi filtreler daha sonra ilgi, çevresel ya da deney örnekleri filtrelemek için kullanılır. Islak numune filtreleri içeren liyofilize ve sulu-çözünür metabolitleri standart bir potasyum fosfat tampon ekstraksiyon ² kullanılarak konvansiyonel NMR spektroskopisi için doğrudan ayıklanır. Bu yöntemlerden elde edilen veriler istatistiksel olarak anlamlı desenleri tanımlamak için analiz, ya da topluluk ve ekosistem fonksiyonlarının kapsamlı bir anlayış için diğer omik seviyeleri ile entegre edilebilir.

Protokol

1. Ekstrakte kaldırma Filtre Hazırlık

1. 25-mm çapında 0.22 mikron gözenek boyutu Durapore PVDF hidrofilik filtreler (Millipore) kullanın. Temiz bir 500 ml Pyrex kabı koyun filtreler cımbız kullanarak. Damıtılmış su ile üç kez ön-yıkama. Eğer birbirine yapışmasını önlemek için durulama filtreleri gibi girdap. 300 ml Milli-Q (Millipore) ya da eşdeğeri yüksek kaliteli su ilave edilir. Filtreler ekstrakte tümüyle kaldırılmasını kolaylaştırmak için otoklavlayın.
2. Milli-Q off dökün ve tekrar üçlü Milli-Q ile, bu kez filtreleri durulayın. Temiz ve kuru bir yüzey (alüminyum folyo gibi) ve makul bir sıcaklıkta (örneğin 37 ° C) veya kuru hava ya da kuru zeminde cımbız yerde bireysel filtrelerini kullanma. Filtreleri artık kullanıma hazır.

2. Örnek Malzeme Filtrasyon

1. Cam destekler ile 25 mm mikroanaliz filtre sütunları ile bu protokol, bir Millipore paslanmaz çelik 3 yerinde filtre manifoldu göstermek içinve mekanik bir pompa kullanılır. Aseptik teknik kullanarak, filtre sütun kaidesi üzerinde tek bir 25 mm filtre koyun, sütun uygulamak ve birbirine kenetlenmiştir.
2. , Sütun örneği 15 ml yükleyin filtre manifolduna stop-valf açılır ve pompa açın. Hücre kırılması (<5 kPa) en aza indirmek için hafif bir basınç altında filtre. Bu eli ya da bir peristaltik pompa gibi diğer pompaları, bu protokolü için uyarlanmış olabilmektedir. Düşük yoğunluklu örnekleri için, su arda eklemeler gerekli olabilir, filtrenin su eklemeler arasında uzun bir süre kuru gitmesine izin verme.
3. Eğer numune filtre ettikten sonra deniz örnekleri için, isteğe bağlı bir tatlı su ürünleri örnek ve filtre üzerinde kalan paramanyetik iyonların azaltmak için durulama gerçekleştirebilirsiniz. Bu spektrometre mıknatısın daha hassas ayar ile yardımcı olabilir. Sadece hafifçe suyu küçük bir hacim kazandırmak ve sonunda toplanan örnek süzülür.
4. Sonra filtreleme bittiğinde pompa kapatın ve vana ope terkn böylece altında filtre negatif basınç hala. Kelepçe ve filtre sütun çıkarın.
5. Tek bir el ile, filtrenin beklemeye almak için temiz cımbız kullanın. Kendisi üzerinden filtre katlayın, ama kırışık yok. Diğer elinizle filtre aşağı tutmak için steril 2 ml mikrosantrifüj tüpü dudak kullanın. Filtre her iki kenarları yeniden kavramak için bunları kullanmak ve sonra cımbız bırakın. Kavuşturmak için bir 45 ° açıyla Regrip.
6. Içeriye bakan örnek tarafında açılır böylece 2 ml tüp ve içine serbest filtre yerleştirin. Sen steril 2 ml mikrosantrifüj tüpü bu şekilde içine iki filtreye kadar yerleştirebilirsiniz. İki filtreleri kullanarak, bunlar mümkün olduğunca az örtüşme sağlamak. Hemen (en az -30 ° C) dondurma.

3. Sulu-çözünür Metabolitlerinin Ekstraksiyon

1. Senin örnekleri gece boyunca veya en az 10 saat Lyophilize.
2. Liyofilizasyon sonra, her bir tüp (Tokken) için bir paslanmaz çelik kırıcı ekleyebilir. 750 ul standart potasyum ekle2,2-Dimetil-2-silapentane-5-sülfonat (DSS) standardı (KPI ile döteryum oksit ⁽² H>% 90) fosfat NMR tampon; 38.3 mM KH ₂ PO _4, 61.7 mM K ₂ HPO _4, DSS 0.1 mM, pH 7.0,% 90 D ₂ O) ^2.
3. Bir su içinde sonikatör ° C (Bioruptor, Diagenode) filtreden hücre malzemelerin ayrılması için 4, 5 dakika boyunca örnekleri sonikasyon. Temiz bir cımbız ile filtreleri çıkarın.
4. 5 dakika için bir değirmen kırıcı (1600 rpm) ile hücreleri bozabilir.
5. 15 dakika boyunca bir tezgah üst çalkalayıcı (Eppendorf) üzerine (1400 rpm) çalkalanarak 65 ° C'de inkübe edin.
6. Temiz cımbızla metal domuz kaldırmak ve 5 dakika boyunca 13.000 g'de Örnek santrifüjlenir.
7. NMR spektroskopisi bir NMR tüpü doğrudan süpernatant kapalı çizin.

4. NMR Spektroskopisi ve Veri Analizi

1. (Burada, Bruker DRX-500 spektrometre ile donatılmış bir NMR spektrometresi içine örnek yükleyinXWIN-NMR çalıştıran bir bilgisayar) tarafından kontrol edilen üç eksenli gradient TXI prob.
2. XWIN-NMR arayüzden uygun yöntemler, daha önce yayınlanmış ^2,15 kullanılarak 1D ¹ H-NMR spektrası elde. Bu çalışmada ¹ H NMR spektrumları 1.2 s tekrarlama zamanı ile, Watergate darbe dizisi bastırılmıştır 298 K. Artan su sinyallere 500,03 MHz'de bir DRX-500 spektrometresi işletim kaydedildi. 128 geçici spektrum başına 32.000 veri noktası elde etmek için toplandı.
3. NMRPipe yazılımı ¹⁶ yüklü bir PC'ye NMR verileri dizinleri aktarın. 0 ppm referans sonra el spektrumları faz olarak ham veri ve set DSS işleyin. Sayısallaştır entegre veya 'binning' onlar gibi rNMR, Automics üzere yazılım veya ECOMICS web sitesi (gelen halka açık FT2B paketini kullanarak ayrık değerler kümesi içine spektral verileri https://database.riken.jp/ecomics/ ) ^3,17. Th, spektrumları 0.032 ppm ayrılmaz ECOMICS kullanarak bölgeler ve DSS veya toplam sinyal yoğunluğu ya normalize üzerinden 0,5 ile 10,5 ppm arasında örneğin entegre edildi edilir. Çıkış verileri şimdi bu tür R ¹⁸ gibi ücretsiz yazılım paketleri kullanılarak temel bileşenler analizi (PCA) olarak aşağı istatistiksel analiz için kullanılabilir.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

¹ H NMR spektrumları bir örneği, yukarıdaki yöntemlerin Şekil 1 'de gösterilmiştir kullanılarak elde edilmiştir. Bu örnekler, bir evren deney iki kez puan alg metabolik faaliyetleri nedeniyle belirgin farklılıklar göstermektedir. 4 gün spektrumu gün 1 örnek karşılaştırıldığında özellikle 3-4 ppm aralığında tepe önemli bolluk, gösterir. Bu zirveleri mikrokozmos içinde diatom çiçeklenme tarafından üretilen şekerler atfedilebilir. Yapay veya doğal deniz suyu ile doğal plankton topluluklarının büyümesini karşılaştırarak benzer bir deneyde, istatistiksel yaklaşımlar syükleme araziler spektrumu içinde zirveleri tespit olurken sağlıklı bir yer NMR türetilen temel bileşenler analizi (PCA) puanı komplo olarak uch, iki tedavi (Şekil 2) arasında belirgin metabolik farklılıklar göstermek için kullanılabilecek şekil veri dağıtım . Bu sonuçlar gibi genomik parmak izi yöntemleri gibi başka omik seviyeleri, (Şekil 3) gelen veri ile mukayese edilebilir. Bunlar NMR pikleri (BMRB örn. bireysel olarak sorgulanabilir http://www.bmrb.wisc.edu/ ^19, ya da tüm spektrumu (at SpinAssign ile örneğin istatistiksel analiz edilebilir) http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search ) ^2. Bu örnekte, tedaviler arasındaki farklılıkları doğal plankton topluluğunun metabolitlerden spektrumlarının şekerler bölgede zirveleri bir bolluk (3.39 ppm 4.04 ppm) sonucu ortaya çıkmış ve yapay deniz suyu topluluklara karakteristik birkaç tepe geçici ide vardılaktat ve SpinAssign kullanarak format gibi ntified.

Şekil 1. Bu prosedür kullanılarak elde edilen işlenmiş örnekleri Örnek ¹ H-NMR. Microcosm örnekleri öncesi (1. gün) ve (4 gün), yoğun bir diatom çiçeklenme sırasında alınmıştır. NMR deneyleri internal standart pik yüksekliği (; 0 ppm DSS) normalize sinyalleri ile bir Bruker DRX-500 üzerinde yapıldı.

Şekil 2. Doğal olan mikrokosmlarından yetiştirilen doğal kaynaklı mikrobiyal planktonik topluluklar (açık karo) veya yapay (siyah daireler) deniz suyu metabolomes gelen sağlıklı bir yer NMR için temel bileşenler analizi (PCA) skoru arsa. Açık bir metabolik farklılıklar saçılım görülebilir. Böyle bir analizden bir yükleme arsa daha sonra da önemini farklı zirveleri tanımlamak için kullanılabilirSistem; gerektiği gibi, bu zirveleri daha analiz edilebilir.

Şekil 3. Çok-omik analizi için bir örnek genomik NMR verileri ile birleştirilmesi. Topluluk kompozisyon denatüre edici gradient jel elektroforezi 18S (solda) ve Şekil 2'de analiz aynı örneklerde 16S (sağda) rRNA genlerinde göre de doğal (açık elmas) ve yapay (siyah daireler) deniz suyu mikrokosmlarından arasındaki farklı mikrobiyal toplum modellerini gösterir. Doğal sistemlerinden metabolome ve genom arasındaki bu yazışmalar bu yaklaşımın yararlılığı tanıtılmakta.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada gösterildiği filtrasyon ve metaboliti ekstraksiyon yöntemi NMR metabolomik için yeterli miktarda toplanabilir üzere mikrobik planktonik biyokütle sağlar. KPI ve 1D ¹ H-NMR kullanarak sulu bir çözünür metabolitlerinin, sadece ekstraksiyon gösterilmiştir birlikte, başka bir ekstraksiyon çözücüsü ve spektroskopik yaklaşımlar kullanılabilir. Bir yararlı örneğin heterojen örnekleri üstün NMR spektrumları üretmek için gösterilen ve paramanyetik iyonları tarafından kirlenmeye...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,22 um hidrofilik Durapore PVDF filtreleri, 25 mm	Millipore	GVWP02500
Mikroanaliz Filtre Tutucu, 25 mm, cam destek fritli	Millipore	XX1002500
3-yer manifoldu, 47 mm, paslanmaz çelik	Millipore	XX2504735
KH 2 PO 4	Wako	169-04245
K 2 HPO 4	Wako	164-04295
Döteryum oksit, 2 H>% 90	Campridge İzotop Laboratoties	DLM-4	>
DSS	Fluka	92754
Automill	Tokken	TK-AM4	Paslanmaz çelik kırıcılar dahil
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
Vakum evaporatör	EYELA	CVE-3100
NMR	Bruker	5 mm-TXI prob ile DRX-500
Spektral binning aracı	Başlangıçta gelişmiş	FT2DB	https://database.riken.jp/ecomics/
Metaboliti açıklama aracı ve veritabanı	Başlangıçta gelişmiş	SpinAssign	= Nmr_search "> http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search