Konzentration der Metabolite von Low-Density-Planktonic Gemeinschaften für Umweltforschung Metabolomics mit Kernresonanzspektroskopie

Zusammenfassung

Ein Verfahren zur Extraktion aus mikrobiellen Metaboliten planktonischen Gemeinden vorgestellt. Ganze Gemeinde Probenahme durch Filtration auf speziell präparierten Filter erreicht. Nach der Gefriertrocknung sind wasserlösliche Metaboliten extrahiert. Dieser Ansatz ermöglicht eine Anwendung des Umweltrechts Metabolomik zu trans-omik Untersuchungen von natürlichen oder experimentellen mikrobiellen Gemeinschaften.

Zusammenfassung

Environmental Metabolomik ist ein aufstrebendes Gebiet, die Förderung der neuen Verständnis ist in, wie Organismen reagieren und interagieren mit der Umwelt und miteinander auf biochemischer Ebene ^ein. Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie ist eine von mehreren Technologien, einschließlich der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), mit äußerst viel versprechend für solche Studien. Vorteile bei NMR sind, dass sie für ungezielte Analysen ist, eine strukturelle Informationen und Spektren können in quantitativer und statistische Weise vor kürzlich verfügbaren Datenbanken der einzelnen Spektren Metaboliten ^2,3 abgefragt werden. Darüber hinaus können NMR-Daten mit Daten aus anderen omik Ebenen (zB Transcriptomics, Genomik), um ein umfassenderes Verständnis der physiologischen Reaktionen von Taxa zueinander und die Umwelt bieten ^4,5,6 kombiniert werden. Jedoch ist die NMR weniger empfindlich als andere Techniken metabolomische, was es schwierig macht apLage zur natürlichen mikrobiellen Systemen, bei denen Probe Populationen mit geringer Dichte und Metabolit-Konzentrationen niedrig, um Stoffwechselprodukte von gut definierten und leicht extrahierbar Quellen wie ganze Gewebe, Körperflüssigkeiten oder Zellkulturen. verglichen werden können Folglich haben die wenigen direkten Umweltaspekte metabolomische Studien von Mikroben durchgeführt, um Datum, um Kultur-oder leicht definiert High-Density-Ökosysteme wie Wirt-Symbiont-Systeme, konstruiert Co-Kulturen oder Manipulationen des Darms Umgebung, in der Markierung mit stabilen Isotopen kann beschränkt zusätzlich verwendet werden, um zu verbessern NMR-Signale ^{7,8,9,10,11,12.} Methoden, die die Konzentration und Sammlung von Umweltdaten zu erleichtern Metaboliten in Konzentrationen für die NMR fehlen. Seit den letzten Augenmerk wurde auf die Umwelt Metabolomics von Organismen im Gewässer, in denen viel von der Energie-und Materialfluss von der Plankton-Gemeinschaft ^13,14 vermittelt wird, gegeben worden ist, haben wir eine Methode zur Konzentration entwickelttion und Extraktion der gesamten Gemeinde-Metaboliten aus planktonischen mikrobiellen Systemen durch Filtration. Im Handel erhältliche hydrophilen Poly-1 ,1-Difluorethen (PVDF) Filter sind speziell behandelt, um vollständig zu entfernen extrahierbaren, die ansonsten als Verunreinigungen in den nachfolgenden Analysen auftreten. Diese behandelten Filter werden dann verwendet, um die Umwelt oder experimentellen Proben von Interesse zu filtern. Filter, die das nasse Probenmaterial werden lyophilisiert und wasserlöslichen Metaboliten werden direkt für die konventionelle NMR-Spektroskopie mit Hilfe eines standardisierten Kaliumphosphat Extraktionspuffer ² extrahiert. Die Daten aus diesen Methoden abgeleitet werden können statistisch ausgewertet werden, um sinnvolle Muster zu identifizieren, oder mit anderen omik Ebenen für umfassende Verständnis von Gemeinschaft und Funktion des Ökosystems.

Protokoll

1. Filter Vorbereitung auf Extrahierbare entfernen

1. Verwendung von 25 mm Durchmesser 0,22 um Porengröße Durapore PVDF hydrophilen Filter (Millipore). Die Filter sollten in einem sauberen 500 ml-Pyrex-Becherglas mit einer Pinzette. Vorspülen dreimal mit destilliertem Wasser. Swirl gut wie Sie, um die Filter aus aneinander kleben zu verhindern spülen. Dann werden 300 ml Milli-Q (Millipore) oder eine gleichwertige hochwertiges Wasser. Autoklav um die vollständige Entfernung der extrahierbaren von den Filtern zu erleichtern.
2. Abgießen, Milli-Q und dreifach wieder spülen Sie die Filter, diesmal mit Milli-Q. Mit einer Pinzette Ort individuelle Filter auf einem sauberen und trockenen Oberfläche (z. B. Alufolie) und entweder trocken zu einem vernünftigen Temperatur (zB 37 ° C) oder an der Luft trocknen. Die Filter sind nun einsatzbereit.

2. Filtration des Probenmaterials

1. Zur Demonstration dieses Protokolls kann ein Millipore Edelstahl 3-Platz-Filter Verteiler mit 25-mm-Filter Mikroanalyse Säulen mit Glas unterstütztund eine mechanische Pumpe verwendet werden. Unter aseptischen Bedingungen legen Sie eine einzelne 25-mm-Filter auf dem Filter Säulenfuß, wenden Sie die Spalte und spannen zusammen.
2. Last 15 ml der Probe auf die Säule, öffnen Sie die Stop-Ventil auf dem Filter vielfältig, und schalten Sie die Pumpe. Filtern sie unter leichtem Druck auf dem Aufbrechen der Zellen (<5 kPa) zu minimieren. Andere Pumpen, wie Hand oder einer peristaltischen Pumpe kann zu diesem Protokoll angepasst werden. Für geringere Dichte Proben, aufeinanderfolgende Zugaben von Wasser kann es erforderlich sein, lassen Sie sich nicht die Filter gehen über einen längeren Zeitraum zwischen den Zugaben von Wasser trocken.
3. Für marine Proben, nachdem Sie Ihre Probe gefiltert haben, können Sie eine optionale Süßwasser spülen, um das restliche paramagnetischen Ionen in Ihrer Probe und auf dem Filter zu reduzieren. Dies kann mit präziser Abstimmung der Magnet des Spektrometers zu helfen. Einfach sanft fügen Sie eine kleine Menge Wasser und filtriert durch Ihre gesammelten Probe am Ende.
4. Nach Filterung beendet ist, schalten Sie die Pumpe, und lassen Sie das Ventil OPEn, so gibt es immer noch Unterdruck unter dem Filter. Entfernen Sie die Klammer und Filter-Spalte.
5. Mit der einen Hand, verwenden Sie saubere Pinzette Halt des Filters zu nehmen. Falten Sie den Filter über sich selbst, aber nicht knittert. Mit der anderen Hand mit der Lippe einer sterilen 2-ml Zentrifugenröhrchen Halten Sie die Filter. Lassen Sie die Pinzette verwenden Sie sie dann wieder greifen Sie beide Kanten des Filters. Regrip in einem 45 ° Winkel in den Schoß.
6. Setzen Sie den Filter in die 2-ml-Tube und Freisetzung so dass es mit der Probe Seite nach innen öffnet. Sie können bis zu zwei Filter in das sterile 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf diese Weise. Bei Verwendung von zwei Filtern, sicherzustellen, dass sie überlappen so wenig wie möglich. Sofort einfrieren (mindestens -30 ° C).

3. Extraktion von wasserlöslichen Metaboliten

1. Lyophilisieren Ihre Proben über Nacht oder für mindestens 10 Stunden.
2. Nach der Gefriertrocknung, fügen Sie ein Edelstahl-Brecher in jedes Röhrchen (Tokken). Fügen Sie 750 ul standardisierte KaliumPhosphat-NMR-Puffer in Deuteriumoxid ⁽² H> 90%) mit 2,2-Dimethyl-2-silapentane-5-sulfonat (DSS)-Norm (KPi; 38,3 mM KH ₂ PO _4, 61,7 mM K ₂ HPO _4, 0,1 DSS mM, pH 7,0, 90% D _² O) _2.
3. Beschallen die Proben für 5 Minuten bei 4 ° C in einem Wasserbad Ultraschallgerät (Bioruptor, Diagenode), die Zellmaterial aus dem Filter zu entfernen. Entfernen Sie die Filter mit sauberer Pinzette.
4. Die Zellen unter Verwendung einer Mühle Brecher (1600 rpm) für 5 Minuten.
5. Inkubation bei 65 ° C unter Schütteln (1400 rpm) auf einem Tisch-Schüttler (Eppendorf) für 15 Minuten.
6. Entfernen Sie die Metall-Schwein mit sauberer Pinzette, und zentrifugieren Sie die Probe bei 13.000 g für 5 Minuten.
7. Beziehen Sie den Überstand direkt an einem NMR-Röhrchen für die NMR-Spektroskopie.

4. NMR-Spektroskopie und Datenanalyse

1. Legen Sie Ihre Probe in einem NMR-Spektrometer (hier ein Bruker-DRX-500-Spektrometer ausgestattet mitTXI Sonde mit Dreifach-Achse Gradienten von einem Computer mit XWIN-NMR) gesteuert.
2. Erhalten ^1D-1 H-NMR-Spektren mit Hilfe geeigneter Methoden bisher veröffentlichten ^2,15 aus dem XWIN-NMR-Schnittstelle. In der vorliegenden Studie ¹ H-NMR-Spektren wurden an einem DRX-500 Spektrometer bei 500,03 MHz bei 298 K. Restwasser Signale aufgezeichnet wurden von der Watergate-Pulssequenz unterdrückt, mit einer Wiederholrate von 1,2 s. 128 Transienten wurden gesammelt, um 32.000 Datenpunkte pro Spektrum zu erhalten.
3. Übertragen Sie die NMR-Daten-Verzeichnisse auf einem PC installiert NMRPIPE Software ^16. Verarbeiten Sie die Rohdaten und Set DSS als 0 ppm Verweis dann manuell Phase der Spektren. Digitalisieren Sie die spektralen Daten in eine Reihe von diskreten Werten durch die Integration oder "Binning" sie mit Software wie rNMR, Automics oder zum öffentlichen FT2B Paket aus dem ECOMICS Website ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) ^3,17. In thwird beispielsweise wurden Spektren zwischen 0,5 und 10,5 ppm über 0,032 ppm integraler Regionen mit ECOMICS und normalisierte sich entweder auf DSS oder insgesamt Signalintensität integriert. Output-Daten können nun für nachgeschaltete statistische Analyse wie z. B. Hauptkomponentenanalyse (PCA), die freie Software-Pakete wie R ¹⁸ verwendet werden.

5. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel von ¹ H-NMR-Spektren unter Verwendung der obigen Verfahren in Abbildung 1 gezeigt. Diese Proben von zwei Zeitpunkten eines Mikrokosmos Experiment zeigen deutliche Unterschiede aufgrund von Algen Stoffwechselaktivitäten. Die Tag 4-Spektrum zeigt das grosse Vorkommen Peaks, insbesondere in der 3-4 ppm-Bereich im Vergleich zum Tag 1 Probe. Diese Spitzen können Zucker durch blühende Kieselalgen innerhalb des Mikrokosmos produziert zugeschrieben werden. In einem ähnlichen Experiment vergleicht das Wachstum von natürlichem Plankton Gemeinden in künstlichen oder natürlichen Meerwasser, statistische Ansätze such als Principal Component Analysis (PCA) Score-Diagramm aus klassierten NMR-Spektren abgeleitet werden verwendet, um klare metabolische Unterschiede zwischen den beiden Behandlungen (Abb. 2) zeigen, während die Belastung Plots können Peaks innerhalb der Spektren zu identifizieren, die Form der Verteilung der Daten . Solche Ergebnisse können im Vergleich mit Daten von anderen omik Ebenen, wie aus genomischer Fingerabdruckverfahren (Abb. 3). Diese NMR-Peaks können einzeln abgefragt werden (zB an der BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ) ^19, oder ganze Spektren können statistisch ausgewertet werden (zB mit SpinAssign bei http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search ) ^2. In diesem Beispiel waren die Unterschiede zwischen den Behandlungen wegen einer Fülle von Spitzen in der Region Zucker (3,39 ppm bis 4,04 ppm) von Spektren aus natürlichen Planktongemeinschaft Metaboliten, und mehrere Gipfel Merkmal mit den Gemeinden künstlichem Meerwasser wurden vorläufig identified wie Lactat und Formiat mit SpinAssign.

Abbildung 1. Vertreter ¹ H-NMR-Spektren von Proben bearbeitet mit diesem Verfahren erhalten. Mikrokosmos Proben wurden vor (Tag 1) und während (Tag 4) einer intensiven Kieselalgenblüte genommen. NMR-Spektren wurden auf einem Bruker DRX-500 mit Signalen normiert auf den internen Standard Peakhöhe (; 0 ppm DSS) durchgeführt.

Abbildung 2. Hauptkomponentenanalyse (PCA) Score-Diagramm gebinnten NMR-Spektren von metabolomes von natürlich abgeleitet mikrobiellen planktonischen Gemeinden in Mikrokosmen mit natürlich gewachsenen (offene Rauten) oder künstlicher (schwarze Kreise) Meerwasser. Klare metabolischen Unterschiede lassen sich im Streudiagramm beobachtet werden. Ein Be-Plot aus einer solchen Analyse können dann verwendet werden, um deutliche Spitzen in der Bedeutung identifizieren werdendas System, wobei diese Peaks können weiter analysiert werden, wie erforderlich.

Abbildung 3. Ein Beispiel für Multi-omik Analyse kombiniert NMR mit genomischen Daten. Gemeinschaft Zusammensetzung auf denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese von 18S (links) und 16S (rechts) rRNA-Gene aus den gleichen Proben wie in Abbildung 2 analysiert Basis zeigt auch verschiedene mikrobielle Gemeinschaft Muster zwischen natürlichen (offene Rauten) und künstliche (schwarze Kreise) Meerwasser Mikrokosmen. Eine solche Korrespondenz zwischen Genom und Metabolom von natürlichen Systemen zeigt den Nutzen dieses Ansatzes.

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Diskussion

Die Filtration und Metaboliten Extraktionsverfahren hier gezeigt ermöglicht mikrobiellen Biomasse planktonischen in ausreichender Menge für die NMR-Metabolomik gesammelt werden. Während nur Extraktion von wasserlöslichen Metaboliten mit KPi und 1D ¹ H-NMR nachgewiesen wird, können andere Extraktionslösungsmittel und spektroskopische Methoden verwendet werden. Ein gutes Beispiel ist die Verwendung von deuteriertem Methanol als semi-polaren Lösungsmittel, von dem gezeigt wurde, um überlegene NMR-Spektre...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
0,22 um hydrophile Durapore-PVDF-Filter, 25 mm	Millipore	GVWP02500
Mikroanalyse Siebträger, 25 mm, Glasfritte Unterstützung	Millipore	XX1002500
3-Platz vielfältigen, 47 mm, Edelstahl	Millipore	XX2504735
KH 2 PO 4	Wako	169-04245
K 2 HPO 4	Wako	164-04295
Deuteriumoxid, 2 H> 90%	Campridge Isotope Laboratoties	DLM-4	>
DSS	Fluka	92754
Automill	Tokken	TK-AM4	Edelstahl-Brecher enthalten
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
Vakuumverdampfer	EYELA	CVE-3100
NMR-	Bruker	DRX-500 mit 5-mm-TXI Sonde
Spectral Binning-Tool	Ursprünglich entwickelt	FT2DB	https://database.riken.jp/ecomics/
Metabolit Annotation Tool und Datenbank	Ursprünglich entwickelt	SpinAssign	= Nmr_search "> http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search