וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית Confocal ו Microendoscopy

Summary

הבנייה המלאה של מנהג, בזמן אמת, מערכת סריקה confocal הדמיה מתואר. מערכת זו, אשר ניתן להשתמש בהם בקלות עבור מיקרוסקופיה וידאו שיעור microendoscopy, מאפשר מערך של הגיאומטריות הדמיה ויישומים אינם נגישים באמצעות תקן מערכות confocal מסחרי, בכל חלק של עלות.

Abstract

מיקרוסקופיה Confocal הפך כלי רב ערך בתחום הביולוגיה ומדעי ביו, המאפשר מהיר, רגישות גבוהה, ברזולוציה גבוהה חתך אופטי של מערכות מורכבות. מיקרוסקופיה Confocal משמש באופן שגרתי, למשל, ללמוד מטרות ספציפיות הסלולר ^1, לפקח הדינמיקה בתאים חיים ^2-4, ולדמיין את האבולוציה תלת מימדי של אורגניזמים שלמים ^5,6. הרחבות של מערכות הדמיה confocal, כגון microendoscopes confocal, לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה in vivo ⁷ והן נמצאות כיום מוחל על הדמיה לאבחון מחלות במסגרות קליניות ^8,9.

מיקרוסקופיה Confocal מספק תלת מימדי ברזולוציה ידי יצירת מה שמכונה "סעיפים אופטי" באמצעות האופטיקה הגיאומטרית פשוטה. בשנת מיקרוסקופ רחב בתחום הסטנדרטי, הקרינה שנוצר ממדגם נאסף על ידי העדשה אובייקטיבי ומסר ישירות גלאי. בעוד לקבלמסוגל עבור דגימות הדמיה דק, עבה דגימות מיטשטשים ידי הקרינה שנוצר מעל ומתחת למישור המוקד אובייקטיבי. לעומת זאת, מיקרוסקופיה confocal מאפשר חתך וירטואלי, אופטי של דגימות, דחיית out-of-להתמקד אור לבנות גבוה תלת מימדי ברזולוציה ייצוגים של דגימות.

מיקרוסקופים Confocal להשיג הישג באמצעות הצמצם confocal בנתיב קרן זיהוי. הקרינה שנאסף ממדגם על ידי המטרה מועבר בחזרה דרך המראות סריקה דרך המראה dichroic העיקרי, מראה שנבחרו בקפידה על מנת לשקף אורכי גל קצרים יותר כגון קרן עירור הלייזר בעת שעבר זמן רב יותר, סטוקס, העביר פליטת הקרינה. אות זה ארוכת גל הקרינה מועברת אז זוג עדשות משני צדי חריר אשר ממוקמת מטוס המצומד בדיוק עם מישור המוקד של העדשה המטרה. פוטונים שנאספו נפח המוקד של האובייקט הם collimatedעל ידי העדשה אובייקטיבי ממוקדים על ידי עדשות confocal דרך חריר. הקרינה שנוצר מעל או מתחת למישור המוקד ולכן לא ניתן collimated כראוי, לא יעברו דרך חריר confocal ^1, יצירת קטע אופטי שבו רק אור למקד את המיקרוסקופ גלוי. (איור 1). לפיכך חריר ביעילות משמש צוהר וירטואלי במישור המוקד, כליאת פליטת זוהה למיקום אחד בלבד מרחבית מוגבלת.

Modern מיקרוסקופים confocal מסחרי להציע למשתמשים פעולה אוטומטית לחלוטין, מה שהופך את ההליכים הדמיה מורכבות לשעבר פשוטה יחסית נגיש. למרות הגמישות והכוח של מערכות אלה, מיקרוסקופים confocal מסחרי לא מתאימים גם עבור כל הפעילויות הדמיה confocal, כמו רבים ביישומים vivo הדמיה. בלי היכולת ליצור מערכות הדמיה אישית כדי לענות על הצרכים שלהם, ניסויים חשובים יכולים להישאר מחוץ reach מדענים רבים.

במאמר זה, אנו מספקים שיטה צעד אחר צעד לבניית מערכת שלמה של מנהג וידאו שער, הדמיה confocal מן המרכיבים הבסיסיים. המיקרוסקופ זקוף יוקם באמצעות מראה galvanometric התהודה לספק את ציר סריקה מהירה, בעוד מהירות סטנדרטית התהודה המראה galvanometric תסרוק את ציר איטי. כדי ליצור קרן סרוקים מדויק מוקד העדשה אובייקטיבי, מראות אלה ימוקמו על מה שמכונה מטוסים telecentric באמצעות ארבעה עדשות ממסר. איתור Confocal תבוצע באמצעות תקן, ה-off-המדף צינור מכפיל (PMT), ואת התמונות יהיה בשבי מוצג באמצעות כרטיס Matrox framegrabber ואת התוכנות הכלולות.

Protocol

הבחירה של אורך גל לייזר, מראה dichroic, ומסננים אופטיים צריך להיקבע על בסיס צבעים הספציפי שבשימוש בניסוי. לדוגמה, הדמיה confocal מדגם מוכתם אלקסה 488 פלואוריד מושגת הטובה ביותר באמצעות לייזר 488 ננומטר, 500 ננומטר ארוך לעבור המראה dichroic, ו 30 ננומטר רוחב פס bandpass במראה מרוכז ב 515 ננומטר. לעומת זאת, הדמיה confocal של צבע אדום אלקסה פלואוריד 647 ידרוש קבוצה שונה של מרכיבים. המיקרוסקופ בפרוטוקול זה נבנה לדמיין כל צבע הקולט חזקה ב 400 ננומטר ופולט מעבר 450 ננומטר. לכן אנו בוחרים לייזר עירור 406 ננומטר ננומטר 425 ארוך לעבור dichroic כדי לשקף את קרן הלייזר. Fluorophores מתרגש שניתן לדמיין באופן סלקטיבי על ידי בחירת מסנני פליטה מתאימים. חשוב השימוש הנכון הרכבה חומרה אופטיים ברחבי בפרוטוקול צוין, חומרה פסולים או מאולתרים לא תקיים יישור גם יכול להיות מפגע בטיחותי.

1. הגדרת את המראה galvanometric התהודה אופטיקה ממסר

מושג חשוב בבניית כל סוג של מערכת סריקה confocal הוא telecentricity. במערכת אופטית telecentric, עדשות מרווחים אחד מהשני על ידי בסכום של אורכי מוקד שלהם, כך הגדלה של המערכת מוגדרת רק על ידי היחס של אורכי מוקד ^1. דבר זה מאפשר בנייה של מערכת ממסר אופטי שבו בהגדלה, וכך את מאפייני המערכת, מוגדרים בקלות על ידי בחירה של עדשות. מושג חשוב נוסף כרוך שנקרא "נייח" המטוסים אופטי, המכונה גם "המטוסים צוהר". מטוס הצמצם היא עמדה בנתיב אופטי שבו קרן אור לא לעבור כל סוג של תנועה לרוחב. בעיצוב זה מיקרוסקופ, ישנם שלושה מטוסים צוהר חשוב: מראות סריקה הראשון והשני, ועל גב הצמצם של העדשה אובייקטיבי. על מנת להשיג אופטימלי קרן SCAnning על המטוס מוקד של המטרה, קרן הכניסה את הצמצם האחורי של העדשה אובייקטיבי חייב להיות נייח, גורף רק זווית. על מנת ליצור נייח, זווית נסחף מטוס, אנחנו צריכים להציב את מראות סריקה הראשון והשני בבית המצומד, מטוסים telecentric למטרה גב הצמצם. עדשות ממוקם בין מראות את העדשה מטרה לשרת להעביר את קרן זווית סרק בין מטוסים נייח (איור 2). המראות סריקה הם רכובים על שני galvos סריקה, שכל אחד מהם אחראי על סריקת בכיוון נתון של המטוס דימות (X ו-Y). כדי להשיג את קו נדרש לסרוק שיעור הדמיה וידאו שער, galvo גבוהה תדר התהודה הנדרש כדי לסרוק את ציר x (הידוע גם בשם ציר "מהיר"). Galvos אלה לנצל רגיש, לולאה סגורה מעגלי משוב ליצור דפוס סריקה סינוסי ומסוגלים הפועלים בתדרים גבוהים מאוד, בחרנו galvo 8 kHz עבור זה לבנות.

1. להקיםcollimator סיבים אופטיים בהר בערך לכוון את אלומת האור באמצעות ברגים התאמה כזו שהוא נוסע בקו ישר אופקית ואנכית. עכשיו, לקחת איריס ולמקם אותו מול collimator סיבים, התאמת גובה אנכי של אירוס כזה הקורה עובר דרך נקייה במרכז הקשתית. בשלב הבא, להזיז את איריס הרחק collimator לאורך השביל הקורה ולבחון אם הקורה עדיין עובר במרכז הקשתית. אם לא, לשנות את מיקום הקרן על הקשתית באמצעות שני ברגים הסתגלות.
2. מניחים את המראה dichroic רכוב בנתיב קרן עם קרן לייזר ממוקמת במרכז כ המראה. לפני מהדק את המראה לשולחן, לסובב את בעל מראה על מנת לשקף את הקורה על כ 90 מעלות בערך להתאים את ההשתקפות כך גובה אנכי של קרן הלייזר משתקפת לא משנה.
3. מראה מקום רכוב galvanometric מהדהד לתוך נתיב קרן הלייזר, לוקחים מכוניתהדואר כדי להבטיח את קרן הלייזר ממוקם במרכז אופקי המדויק של פני השטח את המראה. בפרוטוקול זה, המראה היה מהדהד galvo expoxied ישירות הר מראה. סובב הר במראה כדי לשקף את קרן הלייזר בזווית של 90 מעלות. בערך להתאים את השתקפות את המראה כדי לשמור על אותה קרן לייזר גובה אנכי.
4. על מנת לכוון כל קרן אור בכיוון מסוים, יש בהגדרה להגדיר שתי נקודות בחלל שדרכו קרן תטייל. מטרה זו מושגת בדרך כלל על ידי הצבת שני אירוסים לאורך השביל האופקי והאנכי הרצויים מניפולציה של קרן הלייזר לעבור במרכז הקשתית כל אחד. ארבע דרגות חופש נדרשים להתאים את הקורה, שתי מעלות אופקי ואנכי של חופש עבור כל אירוס. הדרך הנפוצה ביותר וישיר כדי להשיג את דרגות החופש הוא להשתמש בשתי מראות לנווט, או "ללכת", קרן לייזר.
   קח שני אירוסים, ולהגדיר גובה אנכי שלהםבשלב 1.1, באמצעות קרן לייזר לידי ביטוי את המראה התהודה galvo כנקודת התייחסות. כעת, באמצעות חורי הברגים על קרש החיתוך אופטי כמדריך העין, מהדק את שתי קשתיות למטה בקו ישר.
5. התאם את המראה dichroic ואת המראה galvo התהודה לכוון את קרן הלייזר דרך מרכז של שני אירוסים. השתמש במראה הראשון בדרך (המראה dichroic) למרכז הקורה על אירוס הראשון, ולאחר מכן השתמש במראה השני בדרך (את המראה התהודה galvo) אל הקורה במרכז הקשתית על השני. Iteratively להתאים אלה שתי מראות עד הקורה מיושרת דרך אירוסים שני, להבטיח כי בכל קרן הלייזר משתקפת מהמראה galvo התהודה משתקף עדיין ממרכז המראה משוער. אם הקרן חרג, להתאים את הר collimator סיבים איטרטיבי לחזור על השלבים שלעיל.
6. עם הקורה התרכזו אירוסים שני, אנחנו עכשיו במקום שתי עדשות ממסר אשר התמונה הראשונה נייח שלנו, תוכנית telecentricדואר (כלומר, את המראה התהודה galvo) על second מטוס שלנו, נייח telecentric (כלומר, מהירות תקן galvo המראה). עבור מיקרוסקופ מיוחד זה, עדשות נבחרים ממסר הראשון יש את אותו אורך מוקד, "F", כך המרחק בין שתי מראות במערכת telecentric שלנו הוא פשוט 4f. כדי להבטיח את העדשות מרוכזים בדיוק בנתיב קרן, השתמש טריק יישור העדשה. מניחים את העדשה הראשונה נתיב קרן ולהסתכל במקום קרן לייזר על הקשתית הבא בנתיב קרן הבאים העדשה. לאחר מכן, להתאים את גובה העדשה במאונך כך במרכז האנכי של הקורה הוא במרכז הקשתית. לבסוף, להתאים את המיקום הקורה אופקית על הקורה במרכז הקשתית. ביצוע הליך זה זהה עבור העדשה השנייה.

2. הגדרת את המראה סריקה שנייה סיבוב מיקרוסקופ

1. כדי למצוא את המיקום המדויק של המטוס telecentric השני, לחבר את galvo התהודהיחידת הסריקה שלה להפעיל אותו. השתמש כרטיס ביקור לבן כדי לעקוב אחר הקורה סריקה דרך שתי עדשות. תוכלו למצוא את המטוס telecentric במרחק משוער של 4f מן galvo תהודה, שבו קרן הלייזר יופיעו נייח לחלוטין. מרק עמדה על קרש החיתוך.
2. מקם את המראה סריקה סטנדרטית galvo במיקום המדויק מטוס זה telecentric, ולהתאים את גובה המראה והמיקום כזה הקורה בבית המטוס telecentric שביתות המרכז המדויק של המראה סריקה. זה חיוני לשלטון את החומרה לשלוט במראה ולשים מתח של 0 וולט על קלט את המראה סריקה כך במראה ישקע למצב נייטרלי שלה במהלך תהליך זה. בזהירות לכוון את זווית המראה לכוון את אלומת אנכית, להדק בעדינות את המראה בעמדה.
3. כאשר אנו בונים מיקרוסקופ זקוף, אנחנו עכשיו לצרף את קרש החיתוך שנייה בזווית של 90 מעלות בעזרת 90 מעלות בסוגריים גובר. הקפד לכבותלייזר ואלקטרוניקה סריקה, לנתק את סיב, ונתק את מראות סריקה במהלך תהליך זה. כדי להפוך את שאר יישור קל, לאחר בסוגריים מוברג למקום, בזהירות לסובב את מיקרוסקופ כל כך קרש החיתוך החדש הוא עכשיו שוכב. השתמש מהדק לתקן את קרש החיתוך על משטח העבודה. עכשיו שאר ההתקנה האנכי לשעבר יכול להתבצע בקלות על קרש החיתוך שטוח.

3. הגדרת את הסריקה, שפופרת, ועדשות אובייקטיבי

הבא אנו להגדיר את הסט השני של עדשות ממסר, המכונה רשמית בשם "העדשה לסרוק" ו "העדשה צינור". חשוב לבחור את השילוב הנכון של עדשות כדי להשיג את ההגדלה הנכונה במוקד מטרה לייעל את רזולוציית התמונה הסופית. ראשית, כדי להשיג את מספרי הצמצם המקסימלי (NA) של העדשה כל נתון אובייקטיבי, את קרן הלייזר בולט האחורי של המטרה חייבת למלא אתבחזרה הצמצם לחלוטין, ורק אז את העדשה אובייקטיבי יוכלו ליצור מוקד ההדוקה. עדשות המטרה יש מגוון של גדלים הצמצם חזרה, בחרה יחס הגדלה העדשה מעט תמלא יותר מדי את הצמצם האחורי של המטרה שנבחרה. שנית, על מנת להשיג את ההגדלה נכון, העדשה המטרה חייבת להיות בהתאמה עם אורך מוקד העדשה צינור שלשמה נועד. למרבה הצער, המטרה יצרנים שונים מיקרוסקופ בחרו להשתמש שונים העדשה צינור אורכי מוקד, ולכן חשוב לבנות מיקרוסקופ עם עדשה הצינור הנכון עבור העדשה מטרה ספציפית מועסק. יתר על כן, יצרניות מסוימות, כגון Zeiss, עיצוב עדשות הצינור שלהם כדי לפצות על סטיות כרומטית ספציפי של מטרה מתאימים שלהם, כך באמצעות זוג ראוי אובייקטיבי שפופרת העדשה יהיה למעשה להציג סטיות חדשים שאחרת לא להיות נוכח. בדרך כלל אנו מעדיפים יעדים אולימפוס, כמו כל פיצוי כרומטית מתבצע ההמטרה הדואר עצמו, מה שהופך את העדשה אובייקטיבי / צינור הזיווג קלה יותר. למרות המיקרוסקופ ימשיך לעבוד אם המטרה ואת העדשה הצינור אינם תואמים, ההגדלה במיקרוסקופ בפועל סביר להניח כי לא להתאים את ההגדלה רשום על העדשה אובייקטיבי. בשביל זה מיקרוסקופ לבנות בפרט, גודל הצמצם האופטימלי בחזרה היה נחוש בדעתו להיות 4 מ"מ, הדורש יחס ההגדלה 01:04 בין העדשה לסרוק העדשה צינור. בשביל זה מיקרוסקופ אישית לבנות, נשתמש אורך העדשה סריקה של 75 מ"מ ו עדשה צינור באורך של 300 מ"מ.

1. ככל שהמרחק הכולל בין המראה את הסריקה השנייה להתמקד המטרה היא גדולה, זה קטע של המיקרוסקופ לבנות הפריסה הראשונה תהיה המראות צורך לכוון את אלומת האור אל העדשה אובייקטיבי. המקום הראשון גדול, 2 "(50 מ"מ) מראה בקוטר קרוב לקצה קרש החיתוך, לסובב את הר מראה על מנת לשקף את קרן הלייזר כ 90 מעלות. בערך להתאים את השתקפות את המראה כדי לשמור על ביה אנכי אותומ 'גובה. המקום השני 2 "מראה בקצה השני של קרש החיתוך על אוריינטציה שמנתב את אלומת האור כלפי מטה בזווית של 90 מעלות. השתמש בברגים כדי להבטיח התאמה לגובה אנכי של הקורה אינו משתנה. להגדיר שני אירוסים, כמו בשלב 1.4, ולהתאים את שתי מראות כמצוין בשלב 1.5 למרכז הקורה על האירוסים.
2. עם אירוסים עדיין במקום, במקום לסרוק את העדשה בנתיב קרן ולהתאים את המיקום האופקי והאנכי למרכז כתם הלייזר על הקשתית הראשונה. באותו מרחק של 75 מ"מ + 300 מ"מ מן העדשה (בין שתי מראות), בזהירות למקום גדול 2 "עדשה צינור ולהתאים את המיקום האופקי והאנכי למרכז הקורה על הקשתית הראשונה. לצורך שמירה על יישור בעתיד, כדאי להשאיר את האירוסים במקום, עבור יישום זה, כרטיס ביקור עם חור בגודל מתאים יכול להיות דבוק לעמוד ונוסף בנתיב הקורה.
3. עם כל מראות ועדשותעכשיו במקום, להתחיל לסרוק את המראה התהודה galvo והמראה סריקה סטנדרטית. בחודש זה לבנות, במראה סריקה רגילה בסופו של דבר להיות מסונכרנות לקצב סריקה של המראה מהדהד דרך המעגל שהותקן שליטה, כגון זה המתואר באיור 3, זה מספק סנכרון אנכי ואופקי מעולה. עם זאת, לצורך יישור יישומי הדמיה רבים, המראה יכול בקלות להיות סרוקים באמצעות דפוס המשוננת של גנרטור פונקציה. באמצעות כרטיס ביקור, אתר את קרן הלייזר לעבר עמדה 300 מ"מ אחרי העדשה צינור. למרות הקורה היא סריקה במקום אחר המיקרוסקופ הן כיוונים אנכיים ואופקיים, קרן אמור להיות נייח לחלוטין ליד במיקום זה. זה המקום שבו את הצמצם האחורי של העדשה אובייקטיבי יוצב. אם המטוסים נייח אופקי ואנכי אינם חופפים בכל מטוס אותו לאורך השביל קרן, בזהירות unclamp ולתרגם את העדשה צינור לאורך השביל אופטי על מנת להבטיח כישני מטוסים חפיפה ככל האפשר. Re-מרכז את המיקום אנכי ואופקי של העדשה צינור מהדק אותו היטב במצב.
4. מניחים את העדשה אובייקטיבי בנתיב קרן, מוודא למצב העדשה המטרה בחזרה הצמצם קרוב למישור יציב ככל האפשר. הצמצם האמיתי בחזרה אובייקטיבי לא יכול בעצם להיות ממוקם תמיד בפתיחת בחזרה הפיזית של המטרה בשל אפשרויות עיצוב שונות היצרן. לכן תמיד עדיף לבדוק עם היצרן כדי לקבוע את המיקום האמיתי הצמצם בחזרה.
5. הגדרת את הבמה מדגם, מוודא כי הר תרגום שיאפשר תנועה Z-ציר יכול לנוע על פני טווח מלא שלה מבלי להיתקל בהר העדשה אובייקטיבי.

4. הגדרת והתאמת חריר גלאי confocal ו

1. נתק את כל ספקי כוח סיבים אופטיים, וסובב את הרכבה מיקרוסקופ כך זה שוב נשענת על קרש החיתוך מחזיק את resoראי סריקה nant. קלאמפ ארובה בבטחה במקום, ולאחר מכן להתחבר מחדש סיבים collimator, ואת שניהם לחבר מחדש galvos וכבלים לשליטתם. כמו קודם, במקום 0 וולט מתח על השליטה נהיגה galvo סריקה סטנדרטית.
2. על הבמה המדגם, במקום כרטיס ביקור או נפח קטן של צבע בהיר בפוקוס המטרה, דחוקה בין שתי coverslips. הבחירה לצבוע יהיה תלוי לייזר ו dichroic הנבחר; במקרה הזה נשתמש פליטת הקרינה מן כרטיס ביקור לבן כדי ליישר את מערכת זיהוי confocal. נקודות קוונטיות יכולה להיות שימושית גם לצורך יישור, כפי שהם בהירים לא photobleach. חלופות אחרות כוללות חרוזי ניאון ו / או דוגמאות בד חשוף brightener צבע / כביסה, שניהם לזרוח באור יקרות. הפעל את מקור הלייזר ולהביא את המדגם אל המוקד באמצעות מיקרוסקופ שלב התרגום. פעם להתמקד, את הקרינה שנוצר מן המדגם צריך להיות גלוי מאחורי tהוא מראה dichroic, כפי שמתואר בשלב הבא. מקסם הכוח לייזר על מנת להפוך את הקרינה כמו בהיר ככל האפשר.
3. באמצעות כרטיס ביקור, לעקוב אחר פליטת הקרינה מן המדגם דרך העדשה חזרה אובייקטיבי באמצעות מערכת סריקה במראה dichroic. המראה dichroic תשדר את פליטת הקרינה בזמן המשקף את קרן הלייזר; למצוא את האות הקרינה בצד השני של המראה dichroic. עכשיו, במקום המראה מאחורי הראי dichroic ולהשתמש בו כדי לשקף את פליטת בזווית של 90 מעלות. קח איריס, כפי שנעשה בשלב 1.1, ולהשתמש בו יחד עם המראה לכוון את אלומת הקרינה כמו ישרות ומקבילות אל קרש החיתוך ככל האפשר. שלב זה עשוי להתבצע הטוב ביותר באור עמום.
4. הגדרת יחידת חריר confocal כמתואר באיור 2. מצאנו כי המרחבי לסנן כלוב הר הרכבה של ThorLabs אידיאלית עבור משימה זו. חשוב לבחור pinhol המתאיםגודל הדואר על מנת להבטיח כי מערכת confocal מגיע ברזולוציה אופטימלית שלה בלי להקריב את האות יותר מדי. עבור מיקרוסקופ זה אישית, גודל חריר של 100 מיקרומטר נבחר. הנח את יחידת מסנן מרחבי בקנה אחד עם נתיב קרן הקרינה, מקפיד במרכז הר first עדשה תוך התמקדות הקורה פליטת הקרינה. לאחר הרכבה עדשה אורך מוקד קצר ביחידה (מטרה מיקרוסקופ יכול לשמש גם), החלק את Z-תרגום עד הר מוקד ברור ניתן להבחין על פני השטח חריר. ודא כי היחידה כולה מכוונת לאורך קו ישר המדויק נקבע על ידי אלומת הקרינה. הצמד את המכשיר קרש החיתוך.
   הפליטה מרוב דגימות חלש לעומת רמות אור הסביבה אפילו בחדרים חשוכים. זה חיוני, אפוא, כי מיגון הולם / אור מביך לשמש לאורך השביל פליטה כדי להגן מפני זיהום אור תועה. יתר על כן, רמות גבוהות של אור הסביבה עומס ונזק PMTs רבים, במיוחד אלה עם ג לא יהיהurrent הגנה. הקוראים ולכן הם הפצירו מאוד להשתמש צינורות עדשה לצרף את קרן נתיב פליטה, מערכת מוגן כראוי, כמו זה הוכיח כאן, הוא מסוגל המבצע לאור חדר עם מעט לזיהום אין אור תועה.
5. כעת, באמצעות ידיות הסתגלות על הבמה בתרגום, באופן שיטתי להעביר את חריר confocal כדי למצוא את הנקודה בה את האות דרך חריר הקרינה היא מרבית. עמדה זו מזוהה בקלות על ידי התאמת איטרטיבי של שני צירים כדי לבצע חיפוש 2D על פני הר חריר. לאחר מיקום האות למקסם נמצא, במקום עדשה collimating בהר כלוב לאחר חריר. מצא את פליטת הקרינה שעוברת דרך יחידת confocal באמצעות כרטיס ביקור, והחלק את העדשה לאורך collimating הודעות עד האות הקרינה הנפלטת היא collimated ככל האפשר. לאחר הקורה collimated, כדי להיות בטוח במקום מסנן מתאים בנתיב קרן באמבטיה עדשהה
6. הגדר את הצינור מכפיל (PMT) הרכבה. מניחים 50 מ"מ אורך מוקד העדשה נתיב פליטת הקרינה הקורה ולמצוא מוקד שלה באמצעות כרטיס ביקור. מרק עמדה על קרש החיתוך. עכשיו, לכבות את הלייזר לחלוטין - זה חשוב, כמו אור לייזר תועה או המתחדדת יכול לגרום לנזק בלתי הפיך ביותר PMTs. מקם את PMT כך האזור הפעיל שלה ממוקם קרוב למוקד מסומנים ככל האפשר. חבר את הרכבה PMT העדשה מתמקדת באמצעות צינורות עדשה מתכווננת, בזהירות לעטוף קלטת כהה סביב כל השבילים קרן חשוף הבאים חריר.
7. הפעל את הלייזר, אך הקפד לשמור על צריכת חשמל נמוכה ביותר שלה כך את פליטת הקרינה היא בקושי נראית לעין. הפעל PMT, בזהירות לקרוא את המתח שלו על אוסצילוסקופ כמו מתח שליטה מוגברת. PMT מייצר אותות דרך סדרה של שלבים הכפלת אלקטרונים, אם פוטוני גבוה מדי עבור רמת לאור האירוע, הצינור יכול להיותPMTs ניזוק באופן בלתי הפיך. המעגלים עם הגבלת זרם ולכן מומלץ מאוד, במיוחד עבור משתמשים שלא עבד עם גלאי כזה לפני כן.
   הגדלת מתח בקרה PMT עד readout ספייק דמוי ו / או לקזז DC ניתן לראות על המסך אוסצילוסקופ, עבור רוב PMTs, האות הזה יהיה שלילי יחסית לקרקע. ודא אות זו אכן נובעת הקרינה על ידי סיבוב כוח לייזר מעל להתבונן הפסד של האות.
8. לבסוף, iteratively ליישר את חריר עבור האות המרבי על האוסילוסקופ הראשון על ידי מניפולציה של העדשה למקד Z-המיקום, ולאחר מכן להתאים את שלב התרגום YZ.
9. חומרה וידאו שער מיקרוסקופ הושלמה! עכשיו לחבר את המראות, לוחות בקרה מותאם אישית, ואת המחשב ניתח כמו באיור 3. כאמור לעיל, מומלץ להשתמש במערכת הדמיה קודם לדמיין רגיל בגודל הידוע כדי למצוא את הפתרון האופטימלי של המיקרוסקופ ולחשב את הפיקסלל-רזולוציה קבוע עבור מערכת הדמיה. יש סטנדרטים גודל רבים שניתן להשתמש בהם, כגון כרטיסי ביקור לבן עם ידועה בגדלים מכתב, פלואורסצנציה או רעיוני כוח מטרות באוויר, פלורסנט microspheres.

5. הכנת מערכת confocal סריקה microendoscopy

בחודש זה לבנות נשתמש בסיבים תמונה קוהרנטית, אשר מורכב צרור של אלפים רבים של גרעינים סיבים; הסדר כזה מאפשר דימוי להיות מועבר באמצעות סיב ושיחזר בקלות ו / או מורחבת בקצה השני (איור 4). צרור הסיבים קוהרנטית המשמשים לבניית אנדוסקופ זה מלוטש בשני קצותיו, מה שהופך אותו מה שנקרא "קשר למצב" microendoscope. תמונה ב-להתמקד ולכן יהיה רק ​​להיווצר כאשר קצה microendoscope מובא בקשר הדוק עם אובייקט. בהסדר פסאודו confocal זה, פעולה הסריקה של מיקרוסקופ מתמקד הלייזר על f oneiber הליבה בכל פעם, בעוד חריר confocal מבטיח כי אין אור מחוץ המוקד מן הסיבים המקיפים מותר לעבור אל הגלאי. עבור יישומי הדמיה שונים, סט של עדשות ניתן להוסיף על קצה דיסטלי כדי לאפשר הדמיה הפונה קדימה למרחקים ארוכים, פלואורסצנטי. עדשות Microoptic, כמו גם השבירה שיפוע מדד (והחיוך) עדשות יכול בקלות להיות מותאם לשימוש זה, והוא יכול להיות מודבקת על קצה דיסטלי סיבים באמצעות דבקים איכות אופטית.

1. כדי להגדיר את מערכת הדמיה עבור microendoscopy, להסיר בזהירות את הבמה מדגם ולהחליף אותו בשלב סיבים מחזיק (איור 5). טובלים קצה אחד של צרור סיבים בתמיסה חלשה של צבע, כך פליטת הקרינה נוצרת באופן שווה על פני כל הליבות סיבים. הפעל את מערכת הסריקה ולהתאים את בעל סיבים כדי להביא את הקצה השני של צרור סיבים (סוף הפרוקסימלי, או סוף הקרוב אופטיקה מיקרוסקופ) בפוקוס. ראשית, השימוש בתרגום התאמה scrEWS למרכז סיבים בתחום סרוקות. עכשיו, להסתכל על התמונה פליטת הקרינה מקצה סיב הפרוקסימלי בזמן הסריקה. כאשר פני השטח microendoscope להשלים הוא במישור המוקד של המטרה, את פליטת הקרינה בכל ליבות סיבים יהיה אחיד ככל האפשר. השתמש ידיות התאמת הזווית כדי להתאים את הפנים סיבים כדי להפוך את כל ליבות סיבים בהיר באופן שווה. במהלך הסתגלות זו, סביר להניח שיהיה צורך להתאים מחדש את עמדת התרגום מחדש במרכז סיבים בתחום סרוקות. לחזר באמצעות התאמות אלה עד קצה סיב כולו נכונה בפוקוס.
2. לפני השימוש microendoscope, לנקות בעדינות את קצה דיסטלי באמצעות ניקוי עדשות הנייר הרטובות מעט עם מתנול HPLC כיתה. כמו קודם, לשימוש רגיל בגודל ידוע למדוד ולחשב את הרזולוציה של מערכת דימות microendoscope.

6. נציג תוצאות:

איור 6 מציג דוגמה UPR סייםסריקה ight מיקרוסקופ confocal מוגדר microendoscopy. אלומות לייזר פליטת צוירו כמדריך לעין. הר סיבים סיב מחזיק תמונה במקום במהלך מבצע microendoscopy. הר זה סיבים אפשר להחליף בקלות עם xy או xyz שלב התרגום לשימוש כפלטפורמה מיקרוסקופ זקוף. ThorLabs חלקים PT3 (XYZ תרגום) או שניים מוערמים PT1 שלבים (XY תרגום) עובד היטב עבור יישום זה, יחד עם סוגר בזווית ישרה כמו חלק ThorLabs AP90.

כרטיס וידאו שער framegrabber משמש להפקת תמונות האות הנכנס. איור 7 מראה תמונה מבחן נציג של כל מקרה נלקח נמוך "m" מודפס על כרטיס ביקור לבן באמצעות מערכת וידאו שער מיקרוסקופ סורק. נייר לבן מולבן מכיל fluorophores כי נרגשים על ידי אור אולטרה סגול וכחול, וכתוצאה מכך רקע בהיר מאחורי מכתב כהה "m". מסנן פליטה מרוכז ב 515 ננומטר נבחר כדי לאסוף את פליטת ניאון. מ 'inor עיוות של התמונה ניתן לראות, בעיקר ליד הקצוות לרוחב של מסגרת התמונה. תוצאות זה עיוות מהתבנית סריקה סינוסי המראה gavlo 8kHz ו יידונו בפירוט להלן.

באיור 1. תרשים הממחיש את עקרון הפעולה של מיקרוסקופ confocal. הקרניים שמקורם להתמקד המטרה מועברים בחזרה דרך מערכת וממוקד דרך חריר confocal (אדום). הקרניים שמקורם לעיל או (כחול) או למטה (ירוק) מוקד המטרה לא לצאת מן המטרה collimated, ולכן לא מועברים באופן יעיל דרך חריר confocal.

באיור 2. דיאגרמה המציגה את כל נתיבי האור באמצעות מערכת סריקה הקורה. מראות סריקה לשבת ליד המטוסים telecentric עם stationary, חזרה אובייקטיבי פתח המטוס. זוגות של עדשות בין המטוסים נייח לפעול להעביר את קורות סרוקות. הראשון שתי עדשות ממסר יש אורכי מוקד שווה, להרכיב טלסקופ 01:01. הזוג השני של עדשות, הידוע רשמית העדשה לסרוק העדשה צינור, לא צריך להיות שווה אורך מוקד, ולעתים קרובות לשמש טלסקופ קרן הרחבת כדי להבטיח את המטרה גב הצמצם הוא יתר על המידה. האור הנפלט מן המדגם נוסע בחזרה דרך מערכת סריקה עובר דרך המראה dichroic. העדשה למקד את האור מתמקד קצר פליטה דרך חריר confocal, אשר collimated מכן על ידי העדשה. העדשה מתמקדת הסופי פליטת confocal-מסונן על גבי צינור מכפיל. לחץ כאן כדי להציג גרסה בגודל מלא של תמונה זו.

באיור 3. (א) תרשים כללי של תוכנית ההתקנה האלקטרוניקה סריקה. אות התייחסות הכוללת של המיקרוסקופ timebase הוא "סנכרון" פלט TTL של המראה ציר מהיר התהודה galvo, אשר מייצר פולסים TTL בסוף כל שורה סרוקים (כלומר, כאשר galvo השלימה מחזור סריקה). זה מספק את האות H-Sync לכרטיס framegrabber. פלט סינכרון של galvo קשור גם ה-V-Sync לוח בקרה, אשר מגדיל באופן הדרגתי מתח המוצא שלו בתגובה הדופק בכל H-Sync על מנת ליצור את צורת גל זיגזג שמניע את ציר סריקה איטית. לאחר כל הקווים נסרקו, ה-V-Sync הלוח מאפס את waveform זיגזג ומייצר הדופק TTL, אשר משמש אות של framegrabber V-Sync. הקלט סופי לכרטיס framegrabber הוא אות אנלוגי מהצינור מכפיל (שים לב PMTs רבים ליצור מתח המוצא שלילי; הקפד תכנון מעגלים שלךד לבחור את החומרה בהתאם). וידאו קצב התמונות נוצרות ומוצגים התוכנה framegrabber Matrox. (ב) השליטה דוגמה מעגל. בעיצוב זה, מתח של הדופק בכל H-Sync הוא "הוסיף" / משולב ב אינטגרטור המגבר אופ כדי ליצור את הרמפה waveform זיגזג, קטניות נספרים במקביל בשלב הדלפק TTL. כאשר המספר הרצוי של קווי הושג (כלומר, כאשר הסריקה סריקה הושלמה), הדלפק יוצר פעיל נמוך "לבצע את" הדופק, אשר מניע את ההדק שמיט כדי ליצור הדופק לאפס עבור אינטגרטור. זו מאפסת הן את המונה ואת אינטגרטור המגבר אופ, מכין את המעגל למחזור הבא. הבחירה רכיב מתאים עושה מעגל זה רלוונטי נרחב במגוון גדלים raster. זוהי רק אחת ליישום, מימושים רבים אחרים אפשריים ועשוי להיות המועדפת בנסיבות מסוימות. כמו כן, מעגל זה מיועד לשימוש עם כרטיס Matrox framegrabbers, אשר לזהות ולתקן שלב התמונה באופן אוטומטי. אם המעגל היא לשמש framegrabbers עם זאת, תיקון שלב המעגלים או תוכנה עשוי להידרש. לחץ כאן כדי להציג גרסה בגודל מלא של תמונה זו.

4. איור תמונה שידור באמצעות צרור סיבים קוהרנטית. ב סכמטית זו, עדשות צידיו של הצרור נמצאים במקום בקנה מידה הן את התמונה מוקרנת על הקלט צרור סיבים כמו גם להרחיב את התמונה על הפלט צרור סיבים.

איור 5. דוגמה צרור סיבים רכוב בהר 5-ציר. קטן 1 "בלוק אלומיניום בקוטר השתעמם כך חבילת סיבי תמונה יכול להיות מוכנס. סיבים היה epoxied בתוך בלוק אלומיניום בוטח את החלק העליון והתחתון של הבלוק ליציבות.

איור 6. תמונה של מערכת מיקרוסקופיה השלים עם microendoscope המצורפת. כדי להמחיש טוב יותר את שבילי אור, נתיב קרן עירור מצויר בכחול, בעוד פליטת קרן נתיב אחרי המראה dichroic מצויר כקו אדום.

איור 7. תמונה דוגמה שנוצר על ידי מערכת וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית confocal. כהה נמוך מכתב במקרה "m" מופיע על רקע הקרינה בהיר של כרטיס ביקור לבן.

Discussion

זו מערכת וידאו שער הדמיה עושה שימוש ההפעלה במראה התהודה galvanometric ב kHz 8 בערך. מראות תהודה יכול להיות חזק למדי כאשר לרוץ במלוא העוצמה, ועל המגרש גבוה שלהם יכול להיות מטריד או אפילו מסוכן בזמנים חשיפה מספקת. אמנם לא הוכיח כאן, מומלץ להגן על המראה galvanometric מהדהד בתוך תיק שקוף כדי להפחית באופן משמעותי את נפח המערכת ו / או ללבוש ציוד מגן מתאים שמיעה, כמו אטמי אוזניים.

המראה galvanometric סריקות התהודה דפוס סינוסי. עם זאת, כרטיסי framegrabber לקרוא אות בהנחה בשיעור לטאטא ליניארי לחלוטין בשני הכיוונים האופקיים והאנכיים. מאחר לטאטא סינוסי מאיטה בשולי הסריקה, דחיסה artifacts התמונה ניתן לראות לאורך ציר (אופקי) מהיר התמונה. אחת הדרכים לצמצם בעיה זו היא בכוונה כונן סריקת תהודה galvo טווח מראה גדול יותר באופן משמעותי מאשרקוטר העדשה ממסר. בעשותו כך, רק לטאטא מרכזי ליניארי כמעט דפוס סריקה סינוסואידלי יהיה לחצות את המדגם, צמצום עיוותים בתמונה. גישה אחרת יהיה שלאחר תהליך תמונות שנאספו על linearize ציר מהר. ניתן להשיג זאת על ידי הדמיה דפוס ניאון ידוע (כגון רשת) ושימוש ממדים דפוס ידוע ליצור סקריפט עיבוד unwarps התמונות שנאספו.

מערכת זו תוכננה במיוחד סריקה לצורך הדמיה in vivo, אשר לעתים קרובות דורש אוריינטציה זקוף וידאו שער מיקרוסקופ. עבור ניסויים הדמיה הסלולר, מיקרוסקופים הפוכה משמשים יותר בדרך כלל. העיצוב המוצגים כאן ניתן לשנות בקלות לבנות כזה מיקרוסקופ הפוכה, כל שנדרש הוא סיבוב של המראה הסופי "2 קוטר. במקום המכוונת את המראה לכוון את אלומת סריקה כלפי מטה, המראה יכול לכוון את אלומת האור כלפי מעלה. הצבת מטרה עדשהלא באותו מרחק מן המראה, יחד עם הבמה מדגם תאפשר הדמיה בגיאומטריה הפוכה. אם מערכת הדמיה נבנית אך ורק הדמיה microendoscopic, אין שום סיבה "לקפל" את העיצוב מיקרוסקופ אנכית בכלל. במקום זאת, מערכת הסריקה כולו יכול להיות בנוי על קרש החיתוך אופקי אחד עם מקביל את העדשה אובייקטיבית מונחה על השולחן האופטי.

שים לב, את המיקרוסקופ הזה לבנות משתמשת חריר תצורה קבועה, ואילו זה מספק פשטות לבנות הגדולה וקלות יישור, משתמשים המבקשים מערכת צדדי יותר לשקול שילוב חריר משתנה, כפי שניתן למצוא מיקרוסקופים confocal מסחרי ביותר. בכך שהוא מאפשר למשתמש להתאים את גודל חריר, כדי לפצות על דוגמאות שונות של עוצמת הפליטה, זה מאפשר למשתמש יותר לייעל את האיזון בין עוצמת האות ברזולוציה למדגם נתון.

ChOICE של סיבים התמונה שנבחרה עבור המיקרוסקופ חשוב. אנו ממליצים להשתמש בסיבי Sumitomo תמונה קוהרנטית בשל לסגור המרווח שלהם סיבים הליבה autofluorescence נמוך יחסית. סיבים תמונה מתוצרת Fujikura נמצאו יש כמויות גבוהות של autofluorescence ^10, אשר יכול להציף אותות הקרינה חלשה ממדגם ולהגביל את הרגישות האולטימטיבי של microendoscope. סיבים Sumitomo מיוצרים, כמו 8-30N משמש ההתקנה המסוים הזה, יש רמות autofluorescence נמוך בהרבה ושווי Fujikura שלהם. בעוד צרורות סיבים חלחל עשוי להיחשב אטרקטיבי עבור microendoscopy, העיצוב שלהם בדרך כלל במקומות ליבות סיבים בודדים מדי רחוק, כלומר ליבות סיבים בדלילות עצמים המדגם, עוזב את אזורים משמעותיים עניין פוטנציאליים.

לבסוף, יש לציין כי בעוד מיקרוסקופ המתואר כאן יהיה שימושי במגוון במבחנה in vivo applicatiתוספות וניתן ליצור עבור חלק מן העלות של מערכת הכוללת את כל התכונות מסחרי, אין לו תכונות כגון זיהוי האור המועבר, העינית לצורך צפייה, או נתיב קרן שאינם confocal widefield epifluorescence. אמנם זה אפשרי לבנות מערכת עם תכונות אלה מאפס, הקוראים המבקשים מערכת כזו עשויים לרצות לשנות מערכת מסחריים הקיימים כדי לענות על הצרכים שלהם ולא ליזום חדש לגמרי לבנות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
חלק שם	יצרן	פריט מספר	מפרטים	כמות
515 ננומטר Band Pass Filter	Chroma	HQ515/50M	46 FWHM	1
כפיל אכרומטי עדשה 25.4mm Dia. x 50mm פלורידה, ציפוי MgF2	אדמונד אופטיקה	NT49-766		1
כפיל אכרומטי עדשה 25.4mm Dia. x 76.2mm פלורידה, ציפוי MgF2	אדמונד אופטיקה	NT49-768		1
כפיל אכרומטי עדשה 25.4mm Dia. x 88.9mm פלורידה, ציפוי MgF2	אדמונד אופטיקה	NT49-769		2
כפיל אכרומטי עדשה 50mm Dia. פלורידה x 300 מ"מ, ציפוי MgF2	אדמונד אופטיקה	NT45-179		1
8 R kHz תדירות גבוהה סורק אופטי	אלקטרו אופטי מוצרים Corporation (EOPC)	SC-30	8 kHz	1
AGC Driver	אלקטרו אופטי מוצרים Corporation (EOPC)	ACG: 8K
H7422-PA Photosensor מודול	Hamamatsu	H7422-PA	מומלץ להגביל נוכחית	1
M9012 Power Supply	Hamamatsu	M9012	לשימוש עם H7422-PA	1
בג"צ PL APO CS המטרה	לייקה	11506284	10x/0.40	1
Solios EA / XA Framegrabber קארד	Matrox	Solios EA / XA	MIL התוכנה הנדרשת; OEM חיבורים מומלץ	1
12V ספק כוח	LPV-100-12	12 V, 8.5A	1
מיקרוסקופ 5x המטרה עדשה	ניופורט	M-5X	0.10 NA, אורך מוקד 25.4 מ"מ	1
תמונה קוהרנטית Fiber	Sumitomo	8-30N		1
1 / 4 "-20 בורג שווי וקיט חומרה	ThorLabs	HW-KIT2		1
100 מיקרומטר רכוב Pinhole	ThorLabs	P100S	אידיאלי לבניית מסננים מרחביים	1
קייג' 30 מ"מ Cube קלאמפ	ThorLabs	B6C		1
קייג' 30 מ"מ Cube מערכת, 4-Way	ThorLabs	C4W		1
406 ננומטר, 5 mW, ב Pin Code, SM דיודות לייזר סיב הצמה, FC / PC	ThorLabs	LPS-406-FC	מוצר מיושן, מוחלף על ידי LP405-SF10	1
אפוקסי של 5 דקות, 1 אונקיה	ThorLabs	G14250		1
6 הציר kinematic אופטיים הר	ThorLabs	K6X		1
8-32 שווי בורג ואת ערכת חומרה	ThorLabs	HW-KIT1		1
8-32 Setscrew וקיט חומרה	ThorLabs	HW-KIT3		1
מתאם חיצוני עם נושאים RMS ו פנימי נושאים SM1	ThorLabs	SM1A4		1
Adj. FC / PC ו-FC / APC Collimator, f = 2.0 מ"מ, ARC: 400-600 ננומטר	ThorLabs	CFC-2X-A	f = 2.0 מ"מ	1
סיבים מתכוונן מתאם Collimator, SM1 משורשר	ThorLabs	AD9.5F		1
ארובה אלומיניום, 12 "x 18" x 1 / 2 "	ThorLabs	MB1218	1 / 4 "-20 משורשר	2
Benchtop לייזר דיודה / TEC Controller	ThorLabs	ITC4001	1 A/96 W	1
DMLP 425 ננומטר ארוך Pass dichroic Mirror	ThorLabs	DMLP425		1
הר kinematic O1 עבור "אופטיקה	ThorLabs	KM100		3
LD / TEC הר עבור ThorLabs סיבים הצמה דיודות לייזר	ThorLabs	LM9LP		1
עדשה הר עבור Ø18 אופטיקה מ"מ	ThorLabs	LMR18	שמירה על טבעת אחת כללה	1
עדשה mounts עבור 2 "אופטיקה	ThorLabs	LMR2S	עם פנימיים וחיצוניים השחלה; טבעת שכר כלל	2
מיני סדרה קייג' העצרת רוד, 6 "מ"מ אורך, Ø4, כמות 1.	ThorLabs	SR6		4
Ø1.0 "עמוד Pedestal פוסט, 8-32 ברזים, 1" לונג	ThorLabs	RS1P8E		4
O1 "הודעה נדבך הרחבה, אורך = 0.5	ThorLabs	RS05		4
O1 "הודעה על הארכת עמוד, אורך = 0.75"	ThorLabs	RS075		4
O1 "מוגן כסף מראה, 3.2 מ"מ עובי	ThorLabs	ME1-P01		1
O1 "SM1 סיבוב אלמנט התמקדות מתכוונן, L = 1"	ThorLabs	SM1V10		1
O2 "מוגן כסף מראה, 3.2 מ"מ עובי	ThorLabs	ME2-P01		2
P100S - Ø100 מיקרומטר רכוב Pinhole	ThorLabs	P100S		1
פולאריס הסחף נמוכה O1 "kinematic מראה בהר	ThorLabs	POLARIS-K1	נמוכה להיסחף	1
SM1 עדשה Tube, L = 1 "	ThorLabs	SM1L-10	שמירה על טבעת אחת כללה	4
SM1 קייג' משורשר פלייט 30 מ"מ, 0.35 "עבה	ThorLabs	CP02		2
SM1 ל M25 רכיב מתאם אופטי Threading	ThorLabs	SM1A24	חיצוני פנימי ו SM1 אשכולות אשכולות M25.5x0.5	1
קרן קטנה קוטרeter Galvo מערכת	ThorLabs	GVSM001		1
מזלג Clamping קטנים	ThorLabs	CF125	1 / 25 "counterbored חריץ, אוניברסלי	15
מערכת סינון מרחבי	ThorLabs	KT310	Pinhole נמכר בנפרד	1
TE מקורר הר עבור 5.6 & 9 מ"מ לייזרים	ThorLabs	TCLDM9		1
זרוע אנכית עבור Breadboards	ThorLabs	VB01	כל	2
תכנית-Apochromat	Zeiss	1101-957	20x/0.75 NA	1