איתור בידוד של תאים מלנומה במחזור באמצעות Flowmetry photoacoustic

Summary

פיתחנו cytometer הזרימה באמצעות אולטרסאונד לייזר המושרה לזהות במחזור בתאי מלנומה אינדיקטור מוקדם של מחלה גרורתית.

Abstract

בתאי הגידול במחזור (CTCs) הם תאים אלה, כי יש להפריד בין גידול מאקרוסקופיים להתפשט דרך מערכות הדם והלימפה גידולים משניים זרע ^1,2,3. CTCs סימנים של מחלה גרורתית וזיהוי שלהם דגימות דם ניתן לאבחן סרטן ולעקוב אחר תגובת החולה לטיפול. מאז CTCs הם נדירים, המהווים כ תא אחד הגידול בקרב מיליארדי תאים דם נורמלי אצל חולי סרטן מתקדמים, זיהוי שלהם ספירה היא משימה קשה. אנחנו מנצלים את נוכחותם של פיגמנט בתאי מלנומה ביותר ליצור photoacoustic, לייזר או גלי המושרה קולי cytometer זרימה אישית עבור זיהוי של תאים מלנומה מחזורי (CMCs) ^4,5. תהליך זה כרוך הפרדת דגימת דם שלם באמצעות צנטריפוגה וקבלת שכבה כדוריות הדם הלבנות. אם נוכח הדם כולו, CMCs יפרידו עם כדוריות הדם הלבנות בשל צפיפות דומה. תאים אלה הם resuspended בפוספט בופר סליין (PBS) והציג לתוך flowmeter. במקום זרימה רציפה של ההשעיה תא דם, אנו המושרה שני מדי הזרימה שלב כדי ללכוד תאים אלה למחקר נוסף. ב תזרים two שלב שני נוזלים immiscible במערכת microfluidic להיפגש בצומת לסירוגין ויוצרים שבלולים של ^6,7 נוזלי. PBS מושעה בתאי הדם הלבנים טופס האוויר שבלולים microliter כי הם מוקרן ברצף עם אור לייזר. תוספת של פעילי שטח לשלב נוזלי מאפשר היווצרות כדור אחיד המשתמש יכול ליצור שבלולים בגדלים שונים על ידי שינוי שיעורי הזרימה של שני שלבים. חלזונות אוויר וחלזונות של PBS עם כדוריות הדם הלבנות מכילות בולמי אור ולכן, אינם מייצרים גלי photoacoustic. עם זאת, שבלולים של תאי הדם הלבנים מכילים אפילו CMCs יחיד לקלוט אור לייזר לייצר גלים בתדירות גבוהה אקוסטי. שבלולים אלה שיוצרים גלים photoacoustic הם מוחרם, אסף עבור מכתים cytochemical עבור verification של CMCs.

Protocol

1. דגימת דם הכנה

1. צייר כ 10 מ"ל של דם מלא של חולה סרטן שלב IV לשתי vacutainers 5 מ"ל.
2. צנטריפוגה צינורות במשך עשר דקות ב 3000 סיבובים לדקה (סל"ד).
3. דגימת דם יפרידו לשלוש שכבות שונות: השכבה התחתונה כוללת את אריתרוציטים, השכבה האמצעית, המכונה גם מעיל באפי, מכיל לויקוציטים ותאי מלנומה, ואת השכבה העליונה מכיל פלסמה וטסיות. הסר כמו פלזמה כמה שיותר מבלי להפריע את המעיל באפי.
4. מקום 250 μL של Histopaque 1077 בשני צינורות 1 מ"ל Wintrobe.
5. באמצעות 9 "פיפטה פסטר, לחלץ את הפלזמה הנותרים, את המעיל כולו באפי, ואפילו את השכבה העליונה של אריתרוציטים, מוודא לאסוף <500 μL.
6. מניחים את הפתרון על גבי שכבת Histopaque ו צנטריפוגות צינורות Wintrobe ב 15 צינורות חרוטי מ"ל במשך 10 דקות ב 3000 סל"ד.
7. הדם שובנפרדים, אבל הפעם אריתרוציטים יהיו מופרדים Histopaque, המאפשר חילוץ קל של המעיל באפי. השתמש 9 "פיפטה פסטר להשיג את המעיל כולו באפי ולמקם אותו צינור 2 Eppendorf מ"ל.
8. להשעות את המעיל באפי ב 1.5 מ"ל של PBS עם 2% v / v Tween 20.

2. לשכת תזרים בניה

1. קבל גליל אקריליק, 20 מ"מ קוטר חיצוני, קוטר פנימי 17 מ"מ, 8 מ"מ גבוה. מקדחה three חורים בקוטר 5 מ"מ דרך הצד של הגליל ב 90 מעלות זה מזה. גזור שלוש חתיכות של צינורות פולימר (1.6 מ"מ קוטר פנימי, קוטר חיצוני 5 מ"מ), ומניחים אותם לתוך חורים שנקדחו.
2. מתיחה Parafilm ברחבי התחתון של הטבעת אקריליק לעשות חותמת מים חזק. Parafilm טפסים קערה רדודה עם הטבעת אקריליק יקיים את הפתרון acrylamide שיהוו תא הזרימה.
3. להשעות חוט בקוטר 1.6 מ"מ באמצעות חתיכות של צינורות כי הם מולאחד את השני, לוודא את החוט לבד גלוי דרך מרכז הטבעת. מלא את החלק השלישי של צינורות עם חוט 1.6 מ"מ בקוטר בעמדה 1 שפופרת מ"מ במרחק חוט תנאי. חוטים אלה מונעים acrylamide מלהיכנס צינורות. לאחר acrylamide מבצרת, את החוטים יחולצו, עוזב נתיב זרימת גלילי ומקום עמדת סיב אופטי מתמקד על נתיב הזרימה.
4. הוסף 5 מ"ל של acrylamide מוכן [20 גרם acrylamide (Sigma Aldrich), 0.7 bisacrylamide גרם (Sigma Aldrich), 100 מ"ל של מים מזוקקים] אל כוס קטנה. מדוד את 0.02 גרם של persulfate אמוניום (Sigma) ולהוסיף אותו בספל. מערבבים עם בר ומערבבים במשך 3 דקות. הוסף 20 tetramethylethylenediamene μL (פישר סיינטיפיק) עד כוס. במהירות יוצקים את התערובת לתוך הטבעת אקריליק, מילוי למעלה. לאחר מספר שניות, הפתרון יהיה ג'ל, עושה עובש תא הזרימה. משוך בזהירות את החוטים החוצה, מוודא שלא להפריע את הג'ל acrylamide. זרימת צ'אםבער עכשיו הוא מוכן לשימוש.

3. Flowmetry photoacoustic הגדרת

1. אקוסטית כמה פלואוריד polyvinylidene פיזואלקטריים אקוסטי מתמר (Panametrics) לחדר זרימה באמצעות ג'ל אולטרסאונד ישירות מעל נתיב הזרימה.
2. באמצעות כידון ניל-Concelman (BNC) כבל, לחבר את מתמר לקלט של פס רחב RITEC המקלט-640A (lowpass מסנן: החוצה, highpass מסנן: 1 MHz, imput עכבה: 50 אום, הגברה: 35 dB). חבר את הפלט של המסנן כדי האוסילוסקופ (Tektronix TDS 2024B). כדי לעורר את אוסצילוסקופ, photodiode (Thorlabs) מוגדר ליד מתמר והוא פקוק לתוך אוסצילוסקופ באמצעות כבל BNC.
3. T-מחבר (חלקים קטנים) מחובר לזרוע אחת של החדר לזרום. שתי משאבות מזרק (Braintree Scientific) מחוברים בענפים אחרים של המחבר. אחת מזרק מכיל אוויר, ואילו השני יכיל את ההשעיה תא שהוכנו חלק 1. הגדר את שיעורי הזרימה100 μL / דקה.
4. חלץ את צינור קטן של החדר לזרום עד כיס קטן של צורות באוויר, להוסיף 1 מ"מ קוטר הליבה סיב אופטי עם צמצם 0.37 מספרית בחריץ זה. ממלאים את הכיס עם מים כדי להפחית את אותות ממשק להגדיל את כמות אור לייזר להחיל נתיב הזרימה. בשל הצמצם המספרי של סיבים אופטיים מרחק קצר לנתיב הזרימה, הלייזר רק מקרינים one שבלול המדגם בכל זמן נתון, על מנת להבטיח כי מדגם ישירות מול לייזר הוא מדגם זהה יצירת אותות photoacoustic. אנרגיית הלייזר צריך להיות כ 28 mJ / ² ס"מ עם גודל נקודה של 7 מ"מ ^2.
5. הפעל את שתי משאבות מזרק ב. כאשר שני נוזלים immiscible מגיעים לצומת T-הם תחולק שבלולים הומוגנית וזרימה בעבר מתמר.
6. מקרינים את המדגם זבת שבריר שנייה פעמו לייזר כדי ליצור גלים photoacoustic בתאי מלנומה. כאשר המלנין הוא broadbאופטיות בולם, כל אורך גל לייזר גלוי ניתן להשתמש.
7. אם אות מופיעה על אוסצילוסקופ כאשר הקליע הוא מעל מתמר, שבלול מכיל מלנומה, ויש להיות במעקב באמצעות המערכת עד נשירה לתוך בקבוקון אוסף.

4. Immunocytochemistry

1. קח את הכדורים שנתפסו צנטריפוגה Cytospin 4 (Thermo Scientific) על מנת לתקן אותם שקופיות זכוכית. המקום שקופיות זכוכית לתוך Cytofunnels (Shandon Cytofunnel EZ יחיד עם סינון בראון כרטיס Thermo Scientific) ולטעון אותם לתוך צנטריפוגה Cytospin 4. שימי 100 μL של 1% אלבומין בסרום שור (Sigma) ב-PBS לתוך משפך, ואז כל צנטריפוגה בסל"ד 600 במשך 3 דקות כדי לסייע לתאי שנתפסו להיצמד שקופיות זכוכית.
2. לאחר צנטריפוגה, מוסיפים את דגימות תאים על Cytofunnels ואז צנטריפוגות בסל"ד 600 במשך 3 דקות. לאחר מכן לרסס את השקופיות עם מקבע אתנול מבוסס.
3. שטפו את השקופיות PBS במשך 10 דקות פעמיים.
4. כדי לחסום מחייב ספציפי, דגירה כל שקופית בתערובת של μL 10 סרום של עיזים (Sigma) ו 90 μL של PBS שעה 1 בטמפרטורת החדר.
5. לאחר דגירה, למזוג את השקופיות ו דגירה עם פתרון נוגדן ראשוני שעה 1 בתא humidified בטמפרטורת החדר. כל שקופית צריכה להכיל 1% מארט-1 נוגדן וגדל ארנב, 1% CD-45 נוגדן וגדל העכבר, סרום עיזים 10%, 89% ו - PBS.
6. לאחר דגירה, לשטוף את שקופיות PBS במשך 10 דקות שלוש פעמים.
7. השקופיות מודגרת מכן בתמיסה הנוגדן משנית, אשר מחויב fluorophore את הנוגדנים. התערובת מכילה עז 0.05% אנטי ארנבת הנוגדן, 0.05% אנטי עכבר נוגדן עז, עז בסרום 0.1%, ו-PBS 99%. השקופיות מודגרת בחושך במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
8. לאחר דגירה, למזוג השקופיות להתרחץ PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים.
9. כדי להכתים עבור גרעין, דגירה התאים עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של DAPI (Invitrogen) עבור1 דקה. ואז למזוג את השקופיות ולשטוף ב PBS.
10. הר coverslip על מדגם התא באמצעות 20 μL של שרף מבוסס מדיה הרכבה לכל שקופית. החותם coverslip עם לק ברור לשמר את השקופית. עכשיו השקופיות מוכנים להיות צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. נציג תוצאות:

באיור 1. גל photoacoustic מתאי הדם הלבנים בתאי מלנומה מוצגים כאן. כדוריות הדם הלבנות, ללא פיגמנטציה הטבועה, לא לייצר גלים photoacoustic וגלוי כמו קו ישר של רעש אלקטרוני (משמאל). בתאי מלנומה פיגמנט מייצרת גל photoacoustic חזקים (מימין).

באיור 2. מכתים לאחר immunocytochemical, בתאי מלנומה בתרבית להראות אותות DAPI ב BLue בעוד MART1 מסומן בירוק.

באיור 3. שכיסה תמונות DAPI ו MART1, כמו באיור 2, עם CD45 אינדיקטור לויקוציטים, נתון זה מראה בתאי מלנומה בקרב מספר כדוריות הדם הלבנות.

Discussion

זיהוי CTCs עדיין שדה מחקר אינטנסיבי עם יישומים קליניים מעט מאוד עקב בעיה קשה של בידוד תאים סרטניים נדירים. טכניקות רבות אחרות, נבחנות לאיתור CTC, כולל RT-PCR, ללכוד תאים microfluidic, ללכוד immunomagnetic, ושיטות אחרות ^8-12. עם זאת, זיהוי photoacoustic של מראה CMCs ההבטחה כפי שהוא התווית חופשית מספק אמצעי מהיר ומדויק כדי ללכוד קטן, קליטת חלקיקי האור.

הפרוטוקול המתואר לבודד את כדוריות הדם הלבנות היא היעילה ביותר, אך מספר נמוך של כדוריות דם אדומות קיים במדגם. תאים אלה אודם לזהם גם לספוג אור הלייזר, אבל ברמה משמעותי. כדי להבטיח את כדוריות הדם האדומות לא להפריע המערכת שלנו זיהוי מלנומה, חמש דגימות החולה בריא הוצגו באמצעות המערכת ואף אחד נתן את האות, המציין כי כדוריות דם אדומות נמצאים בריכוזים נמוכים מספיק כדילהתעלם.

בסדרה של מחקרים ריכוז נערכו באמצעות תאים בתרבית מלנומה ומערכת זרימת photoacoustic הוכיחה רגיש למטה לתא 1 / μL (נתונים שלא פורסמו). מחקרים אלה ללכת ובקרוב כוללים ניסויים באמצעות דגימות החולה בסרטן.

טכניקה זו photoacoustic גם נבדקים לשימוש ללא פיגמנט CTCs, כגון סרטן השד וסרטן הערמונית על ידי הצמדת chromophores אקסוגניים. ביצענו עבודה ראשונית באמצעות חלקיקי זהב על סרטן cells13. בדיקות אלו הראו כי חלקיקים יכולים לספק קליטה אופטית צורך ליצור גלים photoacoustic. האתגר הטכני שנותר הוא לצרף חלקיקים כאלה תאים סרטניים באופן סלקטיבי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
DMEM	Invitrogen	ABCD1234