كشف وعزل خلايا الميلانوما تعميم استخدام Flowmetry الضوئي

Summary

وضعنا عداد الكريات تدفق باستخدام الموجات فوق الصوتية الليزر التي يسببها للكشف عن تعميم خلايا سرطان الجلد كمؤشر مبكر من المرض المنتشر.

Abstract

تعميم الخلايا السرطانية (التدرجي) هي تلك الخلايا التي فصلت العيانية من الورم وانتشاره من خلال نظم الدم والأورام الليمفاوية الثانوية ^1،2،3 البذور. التدرجي ويمكن استخدام مؤشرات المرض المنتشر والكشف عنها في عينات الدم لتشخيص السرطان ومراقبة استجابة المريض للعلاج. التدرجي منذ نادرة ، أي ما يوازي خلية الورم واحد من بين البلايين من خلايا الدم الطبيعية في مرضى السرطان المتقدمة ، والكشف عنها والتعداد هو مهمة صعبة. نستغل وجود الخلايا الصبغية في الجلد لتوليد معظم الضوئي أو الليزر التي يسببها الموجات فوق الصوتية في عداد الكريات تدفق مخصص للكشف عن خلايا سرطان الجلد المتداولة (CMCS) ^4،5. هذه العملية ينطوي على فصل عينة من الدم الكامل باستخدام الطرد المركزي والحصول على خلايا الدم البيضاء طبقة. إذا كان موجودا في الدم كله ، والمراكز المتعددة الوسائط منفصلة مع خلايا الدم البيضاء بسبب كثافة مماثلة. وهذه الخلايا في معلقالفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، والتي أدخلت على مقياس الجريان. بدلا من استمرار تدفق الدم التعليق الخلية ، التي يسببها تدفق نحن اثنان المرحلة من أجل القبض على هذه الخلايا لمزيد من الدراسة. تدفق في المرحلة الثانية ، واثنين من السوائل إمتزاج في نظام ميكروفلويديك يجتمع في مفترق طرق وتشكيل بالتناوب الرخويات من ^6،7 السائل. علقت PBS خلايا الدم البيضاء والرخويات الهواء ميكروليتر النموذج المشع التي يتم بالتسلسل مع ضوء الليزر. إضافة لبالسطح إلى الطور السائل يسمح موحدة تشكيل عريانة ويمكن للمستخدم إنشاء الرخويات مختلفة الحجم عن طريق تغيير معدلات تدفق من المرحلتين. الرخويات من الهواء والرخويات من برنامج تلفزيوني مع خلايا الدم البيضاء لا تحتوي على امتصاص الضوء ، وبالتالي ، لا تنتج موجات الضوئي. ومع ذلك ، الرخويات من خلايا الدم البيضاء التي تحتوي على المراكز المتعددة الوسائط واحد حتى تمتص ضوء الليزر والموجات الصوتية انتاج عالية التردد. وتحتجز هذه الرخويات التي تولد موجات الضوئي والتي تم جمعها لتلطيخ cytochemical لverificالنسبة من المراكز المتعددة الوسائط.

Protocol

1. إعداد عينة الدم

1. تعادل حوالي 10 مليلتر من الدم الكامل من السرطان المريض في المرحلة الرابعة vacutainers two 5 مل.
2. أنابيب الطرد المركزي لمدة عشر دقائق في 3000 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة).
3. وعينة الدم منفصلة في ثلاث طبقات مختلفة : الطبقة السفلية تتألف من كريات الدم الحمراء ، وطبقة وسطى ، كما دعا الطبقة الشهباء ، ويحتوي على كريات الدم البيضاء وخلايا سرطان الجلد ، وتحتوي الطبقة العليا البلازما والصفائح الدموية. وإزالة البلازما أكبر قدر ممكن من دون إزعاج معطف الشهباء.
4. ميكرولتر من 250 مكان Histopaque 1077 في اثنين من الأنابيب Wintrobe 1 مل.
5. 9 استخدام ماصة باستور "، استخراج البلازما المتبقية ، ومعطف الشهباء بأكملها ، وحتى الطبقة العليا من الكريات الحمراء ، مع التأكد من جمع <500 ميكروليتر.
6. وضع حل فوق طبقة Histopaque الطرد المركزي وأنابيب Wintrobe في أنابيب مخروطية 15 مل لمدة 10 دقيقة في 3000 دورة في الدقيقة.
7. ومرة أخرى في الدممنفصلة ، ولكن هذه المرة سوف يتم فصل الكريات الحمراء التي Histopaque ، مما يسمح للاستخراج من معطف سهل الشهباء. استخدام 9 "باستور الماصة للحصول على معطف الشهباء بأكملها ووضعها في أنبوب إيبندورف 2 مل.
8. تعليق معطف الشهباء في 1.5 مل من برنامج تلفزيوني مع 2 ٪ V / V توين 20.

2. تدفق دائرة البناء

1. الحصول على اسطوانة الاكريليك ، 20 مم الخارجي ، وقطرها الداخلي 17 ملم و 8 ملم طول. حفر ثلاثة ثقوب قطرها 5 ملم من خلال الجانب من الاسطوانة في زوايا 90 درجة عن بعضها البعض. قطع ثلاث قطع من أنابيب البوليمر (1.6 مم الداخلية ، 5 ملم القطر الخارجي) ، ووضعها في الثقوب المحفورة.
2. Parafilm تمتد عبر الجزء السفلي من الحلقة الاكريليك لجعل المياه ختم مشددة. وparafilm أشكال وعاء الضحلة مع عصابة الأكريليك وسوف يعقد الحل الأكريلاميد التي ستشكل غرفة التدفق.
3. تعليق يبلغ قطرها 1.6 ملم سلك طريق قطعة من الأنابيب التي هي على الجانب الآخر منبعضها البعض ، والتأكد من أن الأسلاك وحده وضوحا من خلال منتصف الحلبة. ملء القطعة الثالثة من الأنابيب مع سلك قطره 1.6 ملم وموقف أنبوب 1 ملم بعيدا عن السلك مع وقف التنفيذ. هذه الأسلاك الأكريلاميد منع من دخول الأنبوب. بعد الأكريلاميد يتصلب ، سيتم استخراج الأسلاك ، وترك مسار تدفق اسطواني ومكانا للموقف من الألياف البصرية ويركز على مسار التدفق.
4. أضف 5 مل من الأكريلاميد أعدت [الأكريلاميد ز 20 (سيغما الدريتش) ، 0.7 غرام bisacrylamide (سيغما الدريتش) ، و 100 مل من الماء المقطر] لكوب صغير. قياس من 0،02 غراما من بيرسلفات الأمونيوم (سيغما) ، وإضافته إلى الدورق. المزيج مع التحريك لمدة 3 دقائق. إضافة 20 tetramethylethylenediamene ميكرولتر (فيشر العلمية) إلى الدورق. يصب الخليط بسرعة الى الحلبة الاكريليك ، وملء إلى الأعلى. بعد ثوان قليلة ، فإن الحل هلام ، مما يجعل من العفن غرفة التدفق. سحب الأسلاك بعناية من أصل ، والتأكد من عدم تعكير صفو هلام الأكريلاميد. تدفق شامBER الآن جاهزة للاستخدام.

3. الضوئي flowmetry انشاء

1. الزوجان سمعيا a فلوريد البولي فينيل محول الصوتية كهرضغطية (Panametrics) إلى غرفة تدفق باستخدام الموجات فوق الصوتية هلام مباشرة فوق مسار التدفق.
2. باستخدام الحربة نيل Concelman (BNC) الكابل ، وربط محول لإدخال النطاق العريض لاستقبال - 640A RITEC (lowpass فلتر : الخروج ، highpass التصفية : 1 ميغاهرتز ، imput المعاوقة : 50 أوم ، والتضخيم : 35 ديسيبل). ربط ناتج التصفية على الذبذبات (TDS تكترونكس 2024B). لتحريك الذبذبات ، يتم تعيين الثنائي الضوئي (Thorlabs) قرب محول وموصول الذبذبات باستخدام كبل BNC.
3. ومرفق T - الموصل (أجزاء صغيرة) للذراع واحدة من الغرفة التدفق. يتم توصيل مضخات المحاقن اثنين (برينتري العلمية) إلى فروع أخرى من الموصل. حقنة واحدة تحتوي على الهواء ، في حين أن الآخر سوف تحتوي على تعليق خلية أعدت في الجزء 1. ضبط معدلات التدفق إلى100 ميكروليتر / دقيقة.
4. استخراج أنابيب صغيرة من الغرفة حتى تدفق جيب صغير من أشكال الهواء ، وادخال وقطرها 1 مم الألياف البصرية الأساسية مع فتحة 0.37 العددية في تلك الفتحة. ملء الجيب مع الماء للحد من إشارات واجهة وزيادة كمية ضوء الليزر تطبيقها على مسار التدفق. بسبب الفتحة العددية للألياف الضوئية وبعد مسافة قصيرة إلى مسار التدفق ، وأشرق ليزر واحد فقط من عينة سبيكة في أي وقت من الأوقات ، وضمان أن العينة مباشرة أمام الليزر هو نفس العينة خلق إشارات الضوئي. ينبغي أن تكون طاقة الليزر حوالي 28 ميغا جول / سم ² مع حجم البقعة من 7 ملم ^2.
5. بدوره على كل من مضخات المحاقن. وعندما تكون السوائل إمتزاج two تصل إلى تقاطع تي يمكن تقسيم أنها متجانسة في الرخويات وتدفق الماضية محول.
6. أشرق العينة التي تتدفق مع النانوسيكند نابض الليزر لتوليد موجات الضوئي في خلايا سرطان الجلد. والميلانين هو broadbوالبصرية امتصاص ، ويمكن استخدام أي الطول الموجي ليزر مرئية.
7. إذا إشارة تظهر على الذبذبات عندما سبيكة هو فوق محول ، ويحتوي على سبيكة سرطان الجلد ، وينبغي أن تتبع من خلال اسقاط النظام حتى إلى قارورة جمع.

4. كيمياء سيتولوجية مناعية

1. اتخاذ الرخويات القبض على 4 Cytospin جهاز طرد مركزي (الحرارية العلمية) من أجل معالجتها على الشرائح الزجاجية. الشرائح الزجاجية في المكان Cytofunnels (EZ Shandon Cytofunnel واحدة مع فلتر براون العلمية الحرارية بطاقة) ، وتحميلها الى جهاز طرد مركزي 4 Cytospin. وضع 100 ميكرولتر من الزلال 1 ٪ المصل البقري (سيغما) في برنامج تلفزيوني في كل قمع ثم الطرد المركزي في 600 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق للمساعدة في القبض على الخلايا العصا على الشرائح الزجاجية.
2. بعد الطرد المركزي ، إضافة إلى عينات الخلايا Cytofunnels ثم الطرد المركزي في 600 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. ثم رش الشرائح مع تثبيتي الايثانول القائمة.
3. تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق مرتين.
لحظر ملزم غير محدد ، احتضان كل شريحة بمزيج من 10 ميكروليتر من المصل عنزة (سيغما) و 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. بعد الحضانة ، صب الشرائح واحتضان الضد مع الحل الأساسي لمدة 1 ساعة في غرفة ترطيب في درجة حرارة الغرفة. وينبغي أن تحتوي كل شريحة 1 ٪ مارت 1 الأضداد التي أثيرت في الأرانب ، 1 ٪ CD - 45 الأضداد التي أثيرت في الماوس ، و 10 ٪ مصل عنزة ، وبرنامج تلفزيوني 89 ٪.
5. بعد الحضانة ، وتغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات.
6. ثم يتم تحضين الشرائح في محلول الأجسام المضادة الثانوية ، والتي تلتزم fluorophore إلى الأجسام المضادة. الخليط يحتوي على 0.05 ٪ الماعز المضادة للأرنب الأضداد ، 0.05 ٪ الماعز الأضداد المضادة للماوس ، و 0.1 ٪ مصل الماعز ، وبرنامج تلفزيوني من 99 ٪. يتم تحضين الشرائح في الظلام لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
7. بعد الحضانة ، صب الشرائح يغسل في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ثلاث مرات.
8. وصمة عار للنواة ، احتضان خلايا بنسبة 0.1 ميكروغرام / مل من دابي (Invitrogen) لل1 دقيقة. ثم صب الشرائح ، ويغسل في برنامج تلفزيوني.
9. شن ساترة على عينة الخلية باستخدام 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام للراتنجات المتصاعد لكل شريحة. ختم ساترة مع طلاء الأظافر واضحة للحفاظ على الشريحة. الآن الشرائح جاهزة للتصوير مع المجهر الفلورسنت.

5. ممثل النتائج :

الشكل 1. ويبين الطول الموجي الضوئي من خلايا الدم البيضاء وخلايا سرطان الجلد هنا. خلايا الدم البيضاء ، عدم وجود تصبغ الأصيل ، لا تنتج موجات الضوئي وتظهر كخط مسطح من الضوضاء الإلكترونية (يسار). وتنتج خلايا سرطان الجلد المصطبغة موجة قوية الضوئي (يمين).

الشكل 2 بعد تلطيخ immunocytochemical ، خلايا سرطان الجلد مثقف تظهر اشارات دابي في BLويبرز في حين رق MART1 باللون الأخضر.

الشكل 3. تتراكب الصور لدابي وMART1 ، كما في الشكل 2 ، مع CD45 كمؤشر على الكريات البيض ، وهذا الرقم يدل خلايا سرطان الجلد بين عدة خلايا الدم البيضاء.

Discussion

كشف التدرجي لا يزال هناك مجال بحوث مكثفة مع عدد قليل جدا من التطبيقات السريرية بسبب مشكلة صعبة من عزل الخلايا السرطانية النادرة. ويجري حاليا تقييم تقنيات أخرى للكشف عن العديد من لجنة مكافحة الإرهاب ، بما في ذلك RT - PCR ، ميكروفلويديك القبض على الخلية ، والتقاط immunomagnetic ، وغيرها من الأساليب ^8-12. ومع ذلك ، كشف الضوئي من المراكز المتعددة الوسائط يبين الوعد كما هي التسمية حرة وتوفر وسيلة سريعة ودقيقة لالتقاط الصور ، امتصاص الجزيئات الصغيرة الخفيفة.

وصف بروتوكول لعزل خلايا الدم البيضاء ذات كفاءة عالية ، بعد انخفاض عدد خلايا الدم الحمراء موجودة في العينة. هذه الخلايا شفتين تلويث تمتص ضوء الليزر أيضا ، ولكن على المستوى انخفض بشكل كبير. لضمان خلايا الدم الحمراء لا تتداخل مع شركائنا في نظام الكشف عن سرطان الجلد ، وأدخلت خمس عينات المريض الصحية من خلال النظام وأيا أعطى إشارة ، مشيرا إلى أن خلايا الدم الحمراء موجودة بتركيزات منخفضة بما فيه الكفاية ليمكن التغاضي عنها.

وقد أجريت سلسلة من الدراسات تركيز باستخدام خلايا سرطان الجلد مثقف ونظام التدفق الضوئي أثبت الحساسة وصولا الى 1 خلية / ميكروليتر (بيانات غير منشورة). هذه الدراسات مستمرة وستشمل المحاكمات قريبا باستخدام عينات المريض بالسرطان.

كما أن هذه التقنية التي يجري تقييمها الضوئي لاستخدامها في غير مصطبغة التدرجي ، مثل سرطان الثدي وسرطان البروستات عن طريق ربط chromophores الخارجية. لقد أجرينا العمل الأولي باستخدام جزيئات الذهب على سرطان cells13. وقد أظهرت هذه الاختبارات أن النانوية يمكن أن توفر الاستيعاب اللازمة لتوليد الموجات الضوئية الضوئي. التحدي هو أن التقنية المتبقية نعلق على مثل هذه الجزيئات الخلايا السرطانية بشكل انتقائي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
DMEM	Invitrogen	ABCD1234