Rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un citofluorimetro mediante ultrasuoni laser indotto a rilevare in circolo cellule di melanoma come un indicatore precoce della malattia metastatica.

Abstract

Cellule tumorali circolanti (CTC) sono quelle cellule che hanno separato da un tumore macroscopico e diffuso attraverso i sistemi di sangue e la linfa ai tumori secondari seme ^1,2,3. CTC sono indicatori della malattia metastatica e la loro rilevazione in campioni di sangue possono essere utilizzati per diagnosticare il cancro e monitorare la risposta del paziente alla terapia. Dal momento che CTC sono rare, composto da circa una cellula tumorale tra miliardi di cellule del sangue normali in pazienti con cancro avanzato, la loro individuazione e l'enumerazione è un compito difficile. Sfruttiamo la presenza del pigmento nella maggior parte delle cellule di melanoma per generare fotoacustica, o laser indotta onde ultrasoniche in un citofluorimetro personalizzati per la rilevazione di cellule di melanoma circolanti (CMC) ^4,5. Questo processo comporta la separazione di un campione di sangue intero mediante centrifugazione e di ottenere il bianco strato di cellule del sangue. Se presente nel sangue intero, CMC sarà separato con i globuli bianchi a causa della densità simile. Queste cellule sono risospese intampone fosfato (PBS) ed introdotti nel misuratore di portata. Piuttosto che un flusso continuo della sospensione delle cellule del sangue, ci ha indotto due fasi del flusso al fine di catturare queste cellule per ulteriori studi. In due fasi del flusso, due liquidi immiscibili in un sistema di microfluidica si incontrano ad un bivio e la forma si alternano spezzoni di liquido ^6,7. PBS sospesi i globuli bianchi e l'aria lumache microlitro forma che sono in sequenza irradiati con luce laser. L'aggiunta di un tensioattivo alla fase liquida permette di formazione uniforme lumaca e l'utente può creare diversi proiettili di dimensioni modificando le portate delle due fasi. Lumache di aria e lumache di PBS con i globuli bianchi non contengono assorbitori di luce e, di conseguenza, non producono onde fotoacustico. Tuttavia, lumache di globuli bianchi che contengono anche CMC solo assorbono la luce laser e di produrre onde acustiche ad alta frequenza. Queste lumache che generano onde fotoacustico vengono sequestrati e raccolti per la colorazione citochimica per verificzione di CMC.

Protocollo

1. Preparazione del campione di sangue

1. Prelevare circa 10 ml di sangue intero da un paziente Stadio Cancro IV in due vacutainer 5 ml.
2. Centrifugare le provette per dieci minuti a 3.000 giri al minuto (rpm).
3. Il campione di sangue viene separato in tre diversi strati: lo strato inferiore comprende il eritrociti, lo strato centrale, detto anche buffy coat, contiene leucociti e cellule di melanoma, e lo strato superiore contiene plasma e piastrine. Rimuovere il plasma più possibile senza disturbare il buffy coat.
4. Posto 250 microlitri di HISTOPAQUE 1077 in due tubi Wintrobe 1 ml.
5. Utilizzando un 9 "pipetta Pasteur, estrarre il plasma residuo, il cappotto tutto buffy, e anche lo strato superiore degli eritrociti, avendo cura di raccogliere <500 microlitri.
6. Posizionare la soluzione sopra lo strato HISTOPAQUE e centrifugare i tubi Wintrobe in provette da 15 ml conica per 10 minuti a 3000 rpm.
7. Il sangue sarà di nuovoseparati, ma questa volta il eritrociti saranno separati dal HISTOPAQUE, consentendo una facile estrazione del buffy coat. Utilizzare un 9 "pipetta Pasteur per ottenere il cappotto intero buffy e metterla in una provetta 2 ml Eppendorf.
8. Sospendere il buffy coat in 1,5 ml di PBS con il 2% v / v Tween 20.

2. Camera di flusso Costruzione

1. Ottenere un cilindro in acrilico, 20 mm di diametro esterno, 17 mm di diametro interno, e 8 mm di altezza. Praticare tre fori di 5 mm di diametro attraverso il lato del cilindro ad angoli di 90 gradi l'uno dall'altro. Tagliate tre pezzi di tubo di polimeri (1,6 mm di diametro interno, 5 mm di diametro esterno), e metterli nei fori.
2. Stretch Parafilm nella parte inferiore dell'anello acrilico per fare una perfetta tenuta d'acqua. Il parafilm forma una ciotola con l'anello in acrilico e terrà la soluzione di acrilammide che si forma una camera di flusso.
3. Sospendere un filo di 1,6 mm di diametro attraverso i pezzi di tubo che sono di fronte al'altro, facendo in modo che il filo da solo è visibile attraverso il centro del ring. Riempire il terzo pezzo di tubo con un filo di 1,6 millimetri di diametro e la posizione del tubo di 1 millimetro di distanza dal filo sospeso. Questi fili impedisce di acrilammide di entrare nel tubo. Dopo l'acrilamide si solidifica, i cavi saranno estratti, lasciando un sentiero cilindrico flusso e un posto per posizionare una fibra ottica si concentra sul percorso del flusso.
4. Aggiungere 5 mL di acrilamide preparati [20 g di acrilammide (Sigma Aldrich), 0,7 g bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 ml di acqua distillata] in un recipiente di piccole dimensioni. Misurare 0,02 g di persolfato di ammonio (Sigma) e aggiungerlo al bicchiere. Mescolare con ancoretta per 3 minuti. Aggiungere 20 l tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) al bicchiere. Velocemente versare il composto sul ring acrilico, riempiendo verso l'alto. Dopo pochi secondi, la soluzione in gel, facendo uno stampo camera di flusso. Estrarre delicatamente i fili fuori, facendo attenzione a non disturbare il gel di acrilammide. Il flusso di ChamBER è ora pronto per l'uso.

3. Flussimetria fotoacustico set-up

1. Acusticamente paio di fluoruro di polivinile trasduttore acustico piezoelettrico (Panametrics) per una camera di flusso usando gel per ultrasuoni direttamente sopra il percorso del flusso.
2. Utilizzando un Bayonet Neill-Concelman (BNC), cavo, collegare il trasduttore con l'ingresso di un ricevitore a banda larga RITEC-640A (filtro passa-basso: fuori, filtro passa-alto: 1 MHz, Impedenza d'ingresso: 50 Ohm, amplificazione: 35 dB). Collegare l'uscita del filtro per l'oscilloscopio (Tektronix TDS 2024B). Per attivare l'oscilloscopio, un fotodiodo (Thorlabs) è istituito presso il trasduttore ed è collegato a dell'oscilloscopio utilizzando un cavo BNC.
3. Un connettore a T (minuteria) è collegato a un braccio della camera di flusso. Due pompe siringa (Braintree scientifico) sono collegati ad altri rami del connettore. Una siringa contiene aria, mentre l'altro conterrà la sospensione cellulare preparata nella parte 1. Impostare la velocità di flusso di100 l / minuto.
4. Estrarre il tubo piccolo della camera di flusso fino a quando una piccola tasca di forme d'aria, e inserire un diametro di 1 millimetro in fibra ottica core con un apertura numerica 0,37 in quello slot. Riempire la tasca con acqua per ridurre segnali di interfaccia e di aumentare la quantità di luce laser applicata al percorso del flusso. A causa della apertura numerica della fibra ottica e breve distanza dal percorso del flusso, il laser solo irradiare uno slug del campione in qualsiasi momento, assicurando che il campione direttamente di fronte al laser è lo stesso campione di creare segnali fotoacustico. L'energia laser dovrebbe essere circa 28 mJ / cm ² con uno spot di 7 mm ^2.
5. Accendere entrambe le pompe siringa su. Quando i due fluidi immiscibili raggiungere la t-giunzione saranno suddivisi in omogenei lumache e il flusso di oltre il trasduttore.
6. Irradiare il campione scorre un nanosecondo a impulsi laser per generare onde fotoacustico nelle cellule di melanoma. Come melanina è un broadbe ottiche assorbitore, ogni lunghezza d'onda laser visibile può essere utilizzato.
7. Se un segnale appare sul oscilloscopio quando una lumaca è in cima al trasduttore, la lumaca contiene melanoma, e dovrebbero essere monitorati attraverso il sistema fino a cadere in una fiala di raccolta.

4. Immunocitochimica

1. Prendere le lumache acquisiti in un Centrifuga 4 Cytospin (Thermo Scientific), al fine di correggerli per vetrini. Collocare i vetrini in vetro Cytofunnels (Shandon Cytofunnel EZ singola con Brown filtro carta Thermo Scientific) e li carico in centrifuga 4 Cytospin. Mettere 100 ml di 1% di albumina di siero bovino (Sigma) in PBS in ciascun imbuto, quindi si centrifuga a 600 giri al minuto per 3 minuti per aiutare le cellule catturate bastone alle diapositive di vetro.
2. Dopo la centrifugazione, aggiungere i campioni delle cellule al Cytofunnels, quindi si centrifuga a 600 giri al minuto per 3 minuti. Quindi spruzzare le diapositive con un fissativo a base di etanolo.
3. Lavare i vetrini in PBS per 10 minuti due volte.
4. Per bloccare legame aspecifico, incubare ogni diapositiva con una miscela di 10 ml di siero di capra (Sigma) e 90 ml di PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
5. Dopo l'incubazione, far decantare le diapositive e incubare con la soluzione di anticorpo primario per 1 ora in una camera umidificata a temperatura ambiente. Ogni diapositiva deve contenere l'1% MART-1 anticorpi cresciuto a coniglio, 1% CD-45 anticorpi cresciuto nel topo, nel siero di capra 10%, 89% e PBS.
6. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini in PBS per 10 minuti tre volte.
7. I vetrini vengono poi incubate in una soluzione di anticorpo secondario, che ha fluoroforo legate agli anticorpi. La miscela contiene 0,05% di capra anti-coniglio di anticorpi, 0,05% di capra anti-topo, siero di capra 0,1%, e il 99% PBS. Le diapositive vengono incubate al buio per 1 ora a temperatura ambiente.
8. Dopo l'incubazione, decantare le diapositive lavare in PBS per 5 minuti tre volte.
9. A macchia di un nucleo, incubare le cellule con 0,1 mg / ml di DAPI (Invitrogen) per1 minuto. Poi decantare le diapositive e lavare in PBS.
10. Montare un vetrino sul campione cellulare utilizzando 20 l di un supporto di montaggio a base di resina per vetrino. Sigillare il coprioggetto con smalto trasparente per preservare la diapositiva. Ora le diapositive sono pronti per essere ripreso con un microscopio a fluorescenza.

5. Rappresentante dei risultati:

Figura 1. Le forme d'onda fotoacustico da globuli bianchi e cellule di melanoma sono mostrati qui. I globuli bianchi, non avendo pigmentazione intrinseca, non producono onde fotoacustico e si manifestano come una linea piatta di rumore elettronico (a sinistra). Le cellule di melanoma pigmentato produce un'onda robusto fotoacustico (a destra).

Figura 2. Dopo la colorazione immunocitochimica, cellule di melanoma in coltura mostrano segnali DAPI in blue mentre MART1 è evidenziato in verde.

Figura 3. Sovrapposizione delle immagini per DAPI e MART1, come in Figura 2, con CD45 come un indicatore di leucociti, questa figura mostra cellule di melanoma tra le diverse cellule bianche del sangue.

Discussione

Rilevare CTC è ancora un campo di intensa ricerca con applicazioni cliniche pochissime a causa del difficile problema di isolare le cellule tumorali rare. Molte altre tecniche sono in corso di valutazione per la rilevazione CTC, tra RT-PCR, la cattura delle cellule microfluidica, la cattura immunomagnetica, e altri metodi ^8-12. Tuttavia, l'individuazione fotoacustico di spettacoli CMC promessa in quanto è l'etichetta gratuita e fornisce un mezzo rapido e preciso per catturare piccole particelle che assorbono la luce.

Il protocollo descritto per isolare le cellule bianche del sangue è altamente efficiente, ma un numero basso di globuli rossi presenti nel campione. Queste cellule rouge contaminando anche assorbire la luce laser, ma ad un livello notevolmente diminuito. Per garantire i globuli rossi non interferiscono con il nostro sistema di rilevazione melanoma, cinque campioni di pazienti sani sono stati introdotti attraverso il sistema e nessuno ha dato un segnale, indicando che i globuli rossi sono presenti a basse concentrazioni abbastanzaessere ignorato.

Una serie di studi di concentramento sono stati condotti utilizzando cellule di melanoma in coltura e del sistema a flusso fotoacustico si è dimostrato sensibile a 1 cellula / mL (dati non pubblicati). Questi studi sono in corso e presto includere prove usando campioni di pazienti di cancro.

Questa tecnica fotoacustico è anche in corso di valutazione per l'uso in non pigmentate CTC, come al seno e alla prostata allegando cromofori esogeni. Abbiamo effettuato un lavoro preliminare utilizzando nanoparticelle d'oro sul cancro cells13. Questi test hanno dimostrato che le nanoparticelle in grado di fornire il necessario assorbimento ottico per generare onde fotoacustico. La sfida restante tecnico è quella di allegare tali particelle selettivamente alle cellule tumorali.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Invitrogen	ABCD1234