La detección y aislamiento de las células de melanoma circulantes mediante Flujometría fotoacústica

Resumen

Hemos desarrollado un citómetro de flujo con ultrasonido inducida por láser para detectar las células del melanoma circulando como un indicador temprano de la enfermedad metastásica.

Resumen

Las células tumorales circulantes (CTC) son las células que se han separado de un tumor macroscópico y la difusión a través de los sistemas sanguíneo y linfático a los tumores de semilla secundaria ^1,2,3. CTCs son indicadores de la enfermedad metastásica y su detección en muestras de sangre se pueden utilizar para diagnosticar el cáncer y controlar la respuesta del paciente a la terapia. Desde los CTC son raros, que comprende alrededor de una célula tumoral entre los miles de millones de células sanguíneas normales en pacientes con cáncer avanzado, su detección y la enumeración es una tarea difícil. Aprovechamos la presencia del pigmento en la mayoría de las células de melanoma para generar fotoacústica, o inducida por láser las ondas ultrasónicas en un citómetro de flujo a medida para la detección de células de melanoma circulantes (CMC) ^4,5. Este proceso implica la separación de una muestra de sangre mediante centrifugación y la obtención de la capa de glóbulos blancos. Si está presente en la sangre, los CMC se separarán con las células blancas de la sangre debido a la densidad similar. Estas células se resuspenden entampón fosfato salino (PBS) y se introduce en el medidor de flujo. En lugar de un flujo continuo de la suspensión de células sanguíneas, que induce el flujo de dos fases con el fin de capturar estas células para estudios posteriores. En el flujo de dos fases, dos líquidos inmiscibles en un sistema de microfluidos se encuentran en un cruce y la forma alterna las babosas de líquido ^6,7. PBS suspendidos los glóbulos blancos y las babosas de aire que se forma microlitro de forma secuencial se irradia con luz láser. La adición de un surfactante para la fase líquida permite la formación de bala uniforme y el usuario puede crear diferentes babosas de tamaño mediante la alteración de los caudales de las dos fases. Las babosas de aire y las babosas de PBS con las células blancas de la sangre no contienen absorbentes de luz y por lo tanto, no producen ondas fotoacústica. Sin embargo, los lingotes de glóbulos blancos que contienen incluso CMC solo absorben la luz láser y producir ondas acústicas de alta frecuencia. Estas babosas que generan flujos fotoacústica son secuestradas y se recoge para la tinción citoquímica para verificción de los CMC.

Protocolo

1. Preparación de muestras de sangre

1. Dibuja aproximadamente 10 ml de sangre total de un paciente de cáncer en etapa IV en dos vacutainers 5 ml.
2. Centrifugar los tubos durante diez minutos a 3.000 revoluciones por minuto (rpm).
3. La muestra de sangre se separa en tres capas diferentes: la capa inferior comprende los eritrocitos, la capa intermedia, llamada también la capa leucocitaria, contiene leucocitos y las células del melanoma, y la capa superior contiene el plasma y las plaquetas. Eliminar el plasma tanto como sea posible sin afectar la capa leucocitaria.
4. Colocar 250 ml del Histopaque 1077 en dos tubos de 1 ml Wintrobe.
5. El uso de un 9 pipeta "Pasteur, extraer el plasma restante, toda la capa leucocitaria, e incluso la capa superior de los eritrocitos, asegurándose de recoger <500 mL.
6. Ponga la solución encima de la capa Histopaque y centrifugar los tubos Wintrobe en 15 ml tubos cónicos de 10 minutos a 3000 rpm.
7. La sangre de nuevoseparados, pero esta vez los eritrocitos serán separados por la Histopaque, lo que permite una fácil extracción de la capa leucocitaria. Use un 9 "con una pipeta Pasteur para obtener toda la capa leucocitaria y colocarlo en un tubo de 2 ml eppendorf.
8. Suspensión de la capa leucocitaria en 1,5 ml de PBS con un 2% v / v de Tween 20.

2. Flujo de Cámara de Construcción

1. Obtener un cilindro de acrílico, 20 mm de diámetro exterior, diámetro interior 17 mm y 8 mm de alto. Perforar tres agujeros de 5 mm de diámetro a través del lado del cilindro en ángulos de 90 grados uno del otro. Corte tres piezas de tubo de polímero (1,6 mm de diámetro interior, 5 mm de diámetro exterior), y colocarlos en los agujeros perforados.
2. Parafilm tramo en la parte inferior del anillo de acrílico para hacer un sello impermeable. La parafina forma un recipiente poco profundo con el anillo de acrílico y llevará a cabo la solución de acrilamida que se forma una cámara de flujo.
3. Suspender a un alambre de 1,6 mm de diámetro a través de las piezas de tubería que están al otro lado de laentre sí, asegurándose de que el cable solo es visible a través del centro del ring. Llene la tercera pieza de tubo con un alambre de 1,6 mm de diámetro y la posición del tubo de 1 mm de distancia del cable de suspensión. Estos cables impiden la acrilamida de entrar en el tubo. Después de que la acrilamida se solidifica, los cables se extrae, dejando un camino de flujo cilíndrica y un lugar para colocar una fibra óptica se centra en la trayectoria del flujo.
4. Añadir 5 ml de acrilamida preparados [20 g de acrilamida (Sigma Aldrich), 0,7 g de bisacrilamida (Sigma Aldrich), 100 ml de agua destilada] a un vaso pequeño. Medir 0,02 g de persulfato de amonio (Sigma) y agregarlo a la jarra. Mezcle con una barra de agitación durante 3 minutos. Añadir 20 l tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) en el vaso. Rápidamente vierta la mezcla en el anillo de acrílico, relleno de la parte superior. Después de unos segundos, la solución de gel, haciendo un molde de la cámara de flujo. Con cuidado, tire de los cables fuera, con cuidado de no perturbar el gel de acrilamida. El flujo de Chambre ya está listo para su uso.

3. Flujometría fotoacústica set-up

1. Acústicamente un transductor de par fluoruro de polivinilo acústico piezoeléctrico (Panametrics) a una cámara de flujo, utilizando gel de ultrasonidos directamente sobre la trayectoria del flujo.
2. El uso de un Bayoneta, Neill-Concelman (BNC) de cable, conectar el transductor a la entrada de un receptor de banda ancha Ritec-640A (filtro de paso bajo: hacia fuera, filtro de paso alto: 1 MHz, llave de entrada Impedancia: 50 Ohms, la amplificación: 35 dB). Conecte la salida del filtro para el osciloscopio (Tektronix TDS 2024B). Para activar el osciloscopio, un fotodiodo (Thorlabs) se encuentra cerca del transductor y se enchufa en el osciloscopio mediante un cable BNC.
3. Un conector en T (piezas pequeñas) se une a un brazo de la cámara de flujo. Dos bombas de jeringa (Braintree Científico) están conectados a las otras ramas del conector. Una jeringa contiene aire, mientras que el otro contendrá la suspensión celular preparada en la parte 1. Fijar las tasas de flujo para100 L / minuto.
4. Extraer el tubo pequeño de la cámara de flujo hasta una pequeña bolsa de aire de las formas, e insertar un 1 mm de diámetro núcleo de fibra óptica con una apertura numérica 0,37 en esa ranura. Llene la bolsa con agua para reducir las señales de interfaz y aumentar la cantidad de luz del láser aplicado a la trayectoria del flujo. Debido a la apertura numérica de la fibra óptica ya muy poca distancia de la trayectoria del flujo, el láser sólo irradian una babosa de la muestra en un momento dado, asegurando que la muestra directamente en frente del láser es la misma muestra la creación de señales fotoacústica. La energía del láser debe ser de aproximadamente 28 mJ / cm ^2, con un tamaño de spot de 7 mm ^2.
5. A su vez las dos bombas de jeringa. Cuando los dos fluidos inmiscibles llegar al cruce que se dividirá en las babosas homogénea y el flujo más allá del transductor.
6. Irradiar la muestra fluye con un nanosegundo láser pulsado para generar ondas de fotoacústica en las células del melanoma. Como la melanina es un broadby ópticos de absorción, cualquier longitud de onda de láser visible puede utilizarse.
7. Si aparece una señal en el osciloscopio cuando una bala está en la cima del transductor, la babosa contiene melanoma, y ​​deben ser seguidos a través del sistema hasta caer en un vial de recogida.

4. Inmunocitoquímica

1. Tome las babosas capturadas en una centrífuga Cytospin 4 (Thermo Scientific) con el fin de fijar las diapositivas de cristal. Colocar los portaobjetos de vidrio en Cytofunnels (Shandon Cytofunnel EZ Individual con Tarjeta de Brown filtro Thermo Scientific) y cargar en la Cytospin 4 centrífuga. Ponga 100 L de bovino al 1% de albúmina sérica (Sigma) en PBS en cada embudo y centrifugar a 600 rpm durante 3 minutos para ayudar a las células capturadas se adhieren a las diapositivas de cristal.
2. Después de la centrifugación, añadir las muestras de células de la Cytofunnels y luego se centrifuga a 600 rpm durante 3 minutos. Luego rocíe las diapositivas con un fijador de etanol a base.
3. Se lavan los portas en PBS durante 10 minutos dos veces.
4. para bloquear la unión inespecífica, se incuba cada diapositiva con una mezcla de 10 l de suero de cabra (Sigma) y 90 l de PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.
5. Después de la incubación, se decanta de las diapositivas y se incuban con la solución de anticuerpo primario durante 1 hora en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Cada diapositiva debe contener 1% MART-1 anticuerpo producido en conejo, el 1% de CD-45 anticuerpo en ratones, el 10% de suero de cabra, y el 89% PBS.
6. Después de la incubación, lavar los portaobjetos en PBS durante 10 minutos tres veces.
7. Las diapositivas se incuban en una solución de anticuerpo secundario, que ha fluoróforo unido a los anticuerpos. La mezcla contiene 0,05% de cabra anti-conejo de anticuerpos, 0,05% de anticuerpo de cabra anti-ratón, el 0,1% de suero de cabra, y el 99% PBS. Los portas se incuban en la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente.
8. Después de la incubación, se decanta de las diapositivas de lavado en PBS durante 5 minutos, tres veces.
9. Para la tinción de un núcleo, incubar las células con 0,1 mg / ml de DAPI (Invitrogen) para1 minuto. Entonces decantar las diapositivas y de lavado en PBS.
10. Montar un cubreobjetos sobre la muestra de células con 20 L de un medio a base de resina de montaje en cada diapositiva. Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente para preservar la diapositiva. Ahora las diapositivas están listos para ser fotografiado con un microscopio de fluorescencia.

5. Los resultados representativos:

Figura 1. Las formas de onda fotoacústica de las células blancas de la sangre y las células del melanoma se muestran aquí. Los glóbulos blancos, que no tienen pigmentación inherente, no producen ondas de fotoacústica y se manifiestan como una línea plana de ruido electrónico (izquierda). Las células de melanoma pigmentado produce una onda fuerte fotoacústica (derecha).

Figura 2. Después de la tinción inmunohistoquímica, las células cultivadas de melanoma muestran señales de DAPI en blue mientras MART1 se resalta en verde.

Figura 3. Superposición de imágenes para DAPI y MART1, como en la figura 2, con CD45 como un indicador de leucocitos, esta figura muestra las células de melanoma entre varios glóbulos blancos.

Discusión

La detección de CTCs es todavía un campo de investigación intensiva con aplicaciones clínicas muy pocos debido al difícil problema de aislar las células del tumor raro. Muchas otras técnicas están siendo evaluados para la detección de CTC, como RT-PCR, la captura de células de microfluidos, la captura inmunomagnética, y otros métodos de ^8-12. Sin embargo, la detección fotoacústica de CMC muestra promesa, ya que es la etiqueta libre y proporciona un medio rápido y preciso para capturar las partículas pequeñas, que absorbe la luz.

El protocolo descrito para aislar las células blancas de la sangre es muy eficiente, sin embargo, un número bajo de glóbulos rojos existen en la muestra. Estas células rouge contaminantes que absorben la luz láser, pero a un nivel mucho menor. Para asegurarse de que los glóbulos rojos no interfieren con nuestro sistema de detección de melanoma, cinco muestras de pacientes sanos fueron introducidos a través del sistema y no dio una señal, lo que indica que los glóbulos rojos están presentes en bajas concentraciones suficientes paratenerse en cuenta.

Una serie de estudios sobre la concentración han llevado a cabo utilizando cultivos de células de melanoma y el sistema de flujo fotoacústica ha demostrado ser sensible a 1 células / l (datos no publicados). Estos estudios están en marcha y pronto incluirá los ensayos con muestras de pacientes con cáncer.

Esta técnica fotoacústica está siendo evaluado para su uso en no pigmentados CTC, como el de mama y cáncer de próstata adjuntando cromóforos exógenos. Hemos realizado el trabajo preliminar con nanopartículas de oro sobre el cáncer de cells13. Estas pruebas han demostrado que las nanopartículas pueden proporcionar la absorción óptica necesaria para generar ondas de fotoacústica. El desafío técnico que todavía es unir estas partículas a las células cancerosas de manera selectiva.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Invitrogen	ABCD1234