הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג' בתרבויות Slice Organotypic

Summary

אנו מציגים פרוטוקול המאפשר להציג וכמותית לתחת המורפולוגיה של העץ הדנדריטי של תאים בודדים פורקינג' גדלו בתרבויות פרוסות cerebellar organotypic. פרוטוקול זה נועד לקדם מחקרים על המנגנונים של התפתחות הדנדריטים תא פורקינג'.

Abstract

תאי פורקינג' הם מערכת מודל אטרקטיבית ללימוד פיתוח הדנדריטים, כי יש להם עץ הדנדריטי מרשים שהוא בהחלט בכיוון במטוס sagittal ומתפתח בעיקר בתקופה שלאחר הלידה במכרסמים קטנים ^3. יתר על כן, כמה נוגדנים זמינים אשר באופן סלקטיבי ואינטנסיביים תאי תווית פורקינג' כולל את כל התהליכים, עם D28K אנטי Calbindin להיות בשימוש הנרחב ביותר. לצפייה של הדנדריטים בתאי חיים, עכברים מבטאים EGFP סלקטיבי בתאי פורקינג' ¹¹ זמינים דרך מעבדות ג'קסון. תאי תרבויות פרוסות cerebellar Organotypic לאפשר מניפולציה ניסויית קלה של התפתחות הדנדריטים תא פורקינג' כי רוב התרחבות הדנדריטים של העץ הדנדריטי תא פורקינג' אכן מתרחש בתקופת התרבות ^4. אנו מציגים פרוטוקול קצר, אמין וקל לצפייה וניתוח המורפולוגיה של תאי דנדריטים פורקינג' גדלה בorganotypi כאןג תרבויות פרוסות מוח הקטנים. למטרות רבות, הערכה כמותית של העץ הדנדריטי תא פורקינג' רצויה. נתמקד להלן בשני פרמטרים, גודל עץ הדנדריטי ומספרי נקודות של סניף, שניתן לקבוע במהירות ובקלות מהתרבויות פרוסות אנטי calbindin המוכתמות cerebellar. שני פרמטרים אלו מניבים מדד אמין ורגיש של שינויים של העץ הדנדריטי תא פורקינג'. באמצעות הדוגמא של טיפולים עם החלבון קינאז C (PKC) activator PMA וקולט metabotropic גלוטמט 1 (mGluR1) אנחנו מדגימים כיצד הבדלים בהתפתחות הדנדריטים הם דמיינו וכמותית הוערכה. שילוב של הנוכחות של עץ הדנדריטים נרחב, שיטות immunostaining סלקטיבית ואינטנסיביות, תרבויות פרוסות organotypic שמכסות תקופה של צמיחת הדנדריטים ומודל עכבר עם ביטוי EGFP פורקינג' תא מסוים להפוך תאי פורקינג' מערכת מודל רבת עצמה עבור לחשוף את המנגנונים של הדנדריטים פיתוח.

Protocol

1. הגדרת תרבויות Slice cerebellar Organotypic

תרבויות פרוסות cerebellar מוכנים מיום לידה 8 P (8) גורי עכברים בשיטת דגירת סטטי ^10. במעבדה שלנו, אנו משתמשים B6CF1 עכברים. בניסויים מסוימים עכברים הטרנסגניים גם שמשו בי להביע EGFP סלקטיבי בתאי פורקינג'. ההכנה של תרבויות פרוסות לוקחת כ 30 דקות לכל עכבר, 3 שעות כלומר גור להמלטה של ​​6 גורי עכברים. כל הפעולות נעשות בתנאים סטריליים בשולחן עבודה של זרימה למינרית במכשירי ניתוח מעוקר.

1. המוח הקטן של P8 גורי עכבר גזור מהמוח במדיום הכנה קרה כקרח (MEM (Gibco מספר 11012) עם glutamax 1:100, 7.3 pH) באמצעות stereomicroscope.
2. המוח הקטן הוא לחתוך לפרוסות עבות 350 מיקרומטר באורינטצית sagittal באמצעות מסוק רקמה McIlwain.
3. את הפרוסות מונחות על מוסיף תא תרבות Millipore (approx.6 פרוסהs להוספה, PICM03050 Millipore) ומודגרת בצלחות 6-כן עם 0.75 מ"ל לטוב של מדיום דגירה (48.35 המ"ל MEM, 25 מיליליטר נשר בינוני, 25 מיליליטר סוס סרום, 1ml glutamax אני, 0.65 מ"ל של גלוקוז 10% סטרילי פתרון, pH 7.3) באווירת humidified עם 5% CO ₂ ב 37 ° C. כל ריאגנטים תרבית הרקמה היו מGibco, Invitrogen.
4. טיפולים תרופתיים מופעלים בדרך כלל בגיל 3 ימים במבחנה (DIV3) על ידי הוספת התרופה בריכוז הרצוי למדיום התרבות. Phorbol 12-13-myristate יצטט (PMA) ו( RS) -3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) היה מTocris, בריטניה. מאז תרופות רבות מחייבות שימוש בDMSO או אתנול להכנת פתרון מניות (למשל PMA) יש להקפיד כי הסכום הכולל של הממס הוסיף לתרבות הבינונית אינו עולה על 1% (7.5 μl לטוב). התרופות מתחדשות יחד עם השינוי של מדיום התרבות כל 2 ^nd או היום ^שלישי 3.

2. קיבעון וImmunosTaining תרבויות Slice cerebellar Organotypic

יתרון חשוב של המוח הקטן הוא שנוגדנים שזמינים באופן ספציפי ובהיר להכתים את הנוירונים העיקריים cerebellar, תאים כלומר פורקינג' ותאי גרגיר. המורפולוגיה של תאי דנדריטים פורקינג' יכולה להתגלות על ידי immunostaining עם D28K אנטי calbindin.

1. לקיבעון של התרבויות, התרבות הבינונית מוסר ו3 מ"ל של 4% paraformaldehyde הקר ב0.1M פוספט חיץ (pH 7.4) מתווספים לזהירות המכיל להוסיף Millicell היטב עם פרוסות המוח הקטנות הצמודות לממברנה. תרבויות הנן קבועות במשך הלילה, מקבע מוסר והתרבויות נשטפות עם חיץ פוספט.
2. לimmunostaining את הנוגדנים הבאים משמשים: הארנב נגד calbindin D-28k (Swant, Bellinzona, שוויץ) ב1:1000 להמחשה סלקטיבי תאי פורקינג' ואנטי NeuN חד שבטי (Chemicon, Millipore) בשעת 1:500 להמחשת granu סלקטיביתאי le ^12. ארנב אנטי GFP היה מAbcam, בריטניה. פלורסנט נוגדני Alexa המשניים היו מבדיקות מולקולריות, Invitrogen.
3. התרבויות הם permeabilized ונחסמו על ידי הוספת 3% סרום נורמלי עיזים + 0.3% TritonX100 בחיץ פוספט M 0.1 (חסימת פתרון). אנטי calbindin D28K ואנטי NeuN בדילול בחסימת פתרון והתרבויות מודגרת עם פתרון החסימה המכיל את נוגדני הלילה ב 4 ° C תחת תסיסה קלה. כל הדילולים מסומנים כ% (V / V), טריטון x100 נלקח מתוך 10% מניות פתרון על מנת להקל pipetting.
4. התרבויות נשטפות 3x עם חיץ פוספט 0.1 מ 'ולאחר מכן מודגרת עם נוגדנים מתאימים, 2 העז 568 Alexa למשל נגד הארנב ועיזים אנטי עכבר Alexa 488 מדולל 1:500 בפוספט חיץ 0.1M + 0.1% TritonX100 עבור 2 שעות טמפרטורת חדר. התרבויות אז נשטפות 3x עם חיץ פוספט 0.1M.
5. את הפרוסות המוכתמות יוסרו מהתרבותגם עם מכחול והם רכובים על Superfrost תוספת שקופיות זכוכית וcoverslipped עם מדיום מתאים הרכבה, למשל Mowiol. התרבויות כעת ניתן לצפות במיקרוסקופ רגיל עם ציוד epifluorescence או עם confocal מיקרוסקופ.

3. צפייה בתאי פורקינג' בודדים בתרבויות Slice Organotypic

1. לאחר immunostaining עם Calbindin D28k הציטופלסמה המלאה של תאי פורקינג' מוכתמת מאור כולל דנדריטים ואקסון. עקב היישור הצפוף של תאי פורקינג' בשכבת תא פורקינג', על הכרמים של רוב התאים דנדריטים פורקינג' חופפים ולכן קשה ללמוד את הסוכה המלאה של תא בודד אחד. עם זאת, בשל מוות של תאים של כמה תאי פורקינג' במהלך תהליך ההכנה, בתרבויות רבות באזורים מסוימים נמצאים בצפיפות מופחתת של תאי פורקינג'. באזורים כאלה אפשר למצוא תאי פורקינג' עם סוכת הדנדריטים שלמה שאינו חופף עם ג האחראמות. בתאים אלה, סוכת הדנדריטים ניתן לראות ולנתח באיכות דומה להכתמת Golgi. כי במוח קטן תאי פורקינג' הם סוג התא רק להביע Calbindin D28K התאים גם מזוהים כתאי פורקינג'.
2. שיטה חלופית היא להשתמש בתרבויות הנגזרות מB6; FVB-Tg (Pcp2-EGFP) עכברי 146.244Yuza / י (כאן נקרא עכברי Pcp2-EGFP, זמין מג'קסון מעבדות) המבטאים EGFP תחת תא פורקינג' L7 אמרגן ספציפי ^11. בתרבויות פרוסות כאלה תאי פורקינג' חיים ניתן דמיינו ידי ביטוי של EGFP. אפשר גם לעקוב אחרי מורפולוגיה הדנדריטים של תא בודד לאורך זמן. לחלופין, לאחר קיבעון, תאי פורקינג' EGFP מבטאים-ניתן immunostained עם נוגדן אנטי-GFP. שני השיטות מתאימות לצביעת הדנדריטים, גופי תא לאקסונים של תאים בתרביות פורקינג' organotypic. בגלל L7 האמרגן בעכברים Pcp2-EGFP אינו מתבטא בכל תא פורקינג' ויש variations בתדירות של תאים מבטאים פורקינג' בין עכברים (Kapfhammer, מידע לא מוצג) פורס תרבויות הנגזרות מעכברים אלו יקלו לדמיין ולמדוד תאי פורקינג' אשר יש עצים הדנדריטים שחופפים עם עצים הדנדריטים סלולריים פורקינג' אחרים. עצים הדנדריטים כאלה ניתן לראות בנפרד כאשר תאי פורקינג' השכנים עם חפיפת עצים הדנדריטים אינם מבטא GFP (איור 1 א ', ב').

4. מדידת גודל פורקינג' תאים דנדריטים עץ ונקודתי ההסתעפות

1. גודל עץ הדנדריטי. עם ניאון התיוג של תאי פורקינג' הגודל של העץ הדנדריטי של תא נתון יכול בקלות להיות נמדד אם העץ אינו חופף עם תאים אחרים. בגלל תוויות immunostaining Calbindin כל תאי פורקינג', זה יכול להיות קשה לזיהוי תאים עם החפיפה הלא עצים הדנדריטים. במקרה זה השימוש בPcp2-EGFP מומלץ לפשט את זיהוי של תא פורקינג' מספיק s עם עצים הדנדריטים שאינם חופפים. ברגע שתא פורקינג' עם עץ הדנדריטי אינם חופף מזוהה, שהיא נתפסת בעדשת 20x ותמונה מתועדת במצלמה דיגיטלית. תמונה זו ואז ניתן לנתח עם תכנית ניתוח תמונה. אנו משתמשים בתמונה Pro Plus, המאפשר מתווה עץ הדנדריטי של התא בלחיצת עכבר יחידה באמצעות שרביט קסם הכלי במצב המדידה (איור 2 א). התכנית ואז מחשבה את האזור מכוסה על ידי העץ הדנדריטי ומייצא אותו לMS Excel. ניתוח סטטיסטי של הנתונים נעשה בתוכנת פריזמה GraphPad (ראה להלן).
2. מספר נקודות של סניף. בשל מורפולוגיה המסועפת ועדינה מאוד של נקודתי פורקינג' התאים דנדריטים עץ הסניף צריכה ייספר באופן ידני. קובץ 20x התמונה של תאי פורקינג' הוא זנק באופן שמכסה את רוב המסך באמצעות Adobe Photoshop. אז כל נקודת סניף נספרת ומסומן בנקודה בהירה (איור 2 ב ').

= "Jove_title"> 5. נציג תוצאות

ניטור הפיתוח של העץ הדנדריטי תא פורקינג' בתקופת התרבות
תרבויות פרוסות Organotypic נגזרות מעכברי Pcp2-EGFP המבטאים EGFP במיוחד בתאי פורקינג' לאפשר ללמוד את המורפולוגיה של תאים בודדים במהלך כמה ימים בתרבות. בדרך זו הצמיחה וההתפתחות של העץ הדנדריטי בתקופת התרבות יכולה להיות מתועדת היטב. תאים זוהו פורקינג' חיים צולמו כל יום ^שלישי 2 ^nd או 3 בתקופת התרבות במטרת 10x. מטרת צריכת חשמל נמוכה זה נבחר כדי למנוע ולמזער את הניזק לתאים phototoxic בשל התאורה עם אור ניאון. איור 3 מציג שתי דוגמאות של תאי פורקינג' צולמו במתגוררות תרבויות. התא הראשון היה אחרי מ2 ימים במבחנה עד 7 ימים במבחנה (3 איור, AC). זה ברור שdendritiעץ ג של תא זה בתקופת זמן זו גדל מספר סניפים חדשים ומרחיב בגודל. בדוגמא השנייה, תא פורקינג' אחרי 4-11 ימים במבחנה (3 איור, DF). העץ הדנדריטי הקטן הנוכח בDIV4 מרחיב באופן משמעותי בתקופת זמן זו. שני הדוגמות מראות כי רוב העץ הדנדריטי של תאי פורקינג' להציג בסוף תקופת התרבות אכן מתפתחים בתרבות.

פיתוח של העץ הדנדריטי תא פורקינג' הוא מעוכב על ידי PKC או גירוי mGluR1
תרבויות פרוסות cerebellar Organotypic היו בתרבית במשך 11 יום. החל ביום ² במבחנה, חלק מהתרבויות טופלו גם עם PMA (50 ננומטר), אסתר phorbol הגירוי PKC או DHPG (10 מיקרומטר), mGluR1 אגוניסט, עד שהתרבויות היו קבועות. שני התרכובות הוכחו בעבר כדי לדכא ולהגביל את צמיחת פורקינג' תאים דנדריטים ^{7, 8, 9, 5.}בשליטת מטופל פרוסות תאי פורקינג' פתחו עץ גדול ומסועף מאוד טיפוסי הדנדריטים שדמיין או על ידי immunostaining אנטי Calbindin (איור 4 א) או בתרבויות עם EGFP-להביע תאי פורקינג', על ידי immunostaining עם אנטי-GFP (האיור 4D). בתרבויות שטופלו בPMA המורפולוגיה של העץ הדנדריטי הייתה שינוי מרחיק לכת. הדנדריטים הופיעו מעובים והיו רק כמה ענפי צד קצרים. תאי פורקינג' רבים, שלא כמו בתרבויות בקרה, כבר לא היו חד קוטביים, עם דנדריט אחד העיקרי שיוצא מגוף התא, אך פתחו שניים או אפילו יותר דנדריטים עיקריים (איור 4B, E). השטח המכוסה על ידי העץ הדנדריטי הופחת במידה ניכרת (ראה להלן). מצב דומה היה קיים בתרבויות DHPG שטופלה. העץ הדנדריטי של תאי פורקינג' היה פחותים בהרבה בגודל ובהסתעפות הייתה ניכר מופחתת (האיור 4C, ו). עם זאת, היו גם כמה qualitatהבדלי ive השוואה לתרבויות PMA שטופל. לא היה עיבוי של הסניפים דנדריטיים, והדנדריטים העיקריים מתבצעים הדנדריטים שניים מאוד קצרים רבים (האיור 4C, F) המצביעים על כך שאירועי האיתות קורים בתאי פורקינג' DHPG טופל PMA ועשוי להיות דומה, אבל לא זהה.

הערכה כמותית של גודל פורקינג' תאים דנדריטים עץ ונקודתי הסתעפות להערכה כמותית, בגודל של עץ פורקינג' התאים דנדריטים ומספר נקודתי הסתעפות לכל תא פורקינג' נמדדה כמתואר לעיל. תוצאות מלפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים אספו יחד, ומינימום של 20 תאים צריך להיות מנותח. הממוצע של השטח המכוסה בעצים הדנדריטים לניסויים השליטים נקבע וייקבע כ100%, ואת הערכים עבור ניסויים האחרים באים לידי ביטוי בערכים באחוזים בהתאמה. ניתוח סטטיסטי של הנתונים נעשה בתוכנת פריזמה GraphPad. כי אנחנו לאתניח שכל הערכים שנקבעו הם חלק מהפצת גאוס, אנו משתמשים בבדיקות סטטיסטיות שאינו מניחות התפלגות כזו של הערכים המדודים. להשוואת תנאים ובדיקות מרובים למובהקות סטטיסטיות, אנו משתמשים במבחן Kruskal-ואליס ואחרי הליך מתאים לפוסט הוק בדיקות לסטטיסטיקת דרגה מבוססת, כמו, למשל, יושם בהעברת המבחן של דאן בפריזמה GraphPad. תוצאות מוצגות בדרך כלל כגרף עמודות. דוגמה להערכה כזו סטטיסטית ניתנת באיור 5. שניהם הניתוח של גודל העץ הדנדריטי (האיור 5A) ואת מספר הנקודות של סניף לכל תא פורקינג' (איור 5 ב) מראים הבדלים מובהקים בין תנאי הבקרה וטיפול DHPG או PMA. שני הפרמטרים היו שונים עם מובהקות סטטיסטיות של p <0.001 לפי מבחן Kruskal-אליס.

Figuמחדש 1. EGFP שכותרת תא פורקינג'. בעכברי Pcp2-EGFP לא כל תאי פורקינג' המפורש EGFP. לכן, עצים הדנדריטים של תאים מסוימים פורקינג' ניתן לראות בנפרד כאשר הם מביעים EGFP (EGFP ערוץ ב) ותאי פורקינג' השכנים עם חפיפת עצים הדנדריטים לא (שלילי בערוץ EGFP מוצג ב, חיובי בצביעה אנטי Calbindin הראתה במסלול האדום בבוקר). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.

איור 2. מדידת פרמטרים של תאים דנדריטים פורקינג'. (). גודלו של העץ הדנדריטי קלות ניתן למדוד משרטט את קווי המתאר של תא פורקינג' בלחיצת עכבר אחת בPro תמונת תוכנת ניתוח התמונה בתוספת שימוש בכלי מטה הקסם. כלי שרביט הקסם משמש כזה שהעץ הדנדריטי כולו, כולל סומה התא וכל הענפים הדנדריטים הם כתרו לחלוטין על ידי הקו. (ב). מספר נקודתי הסתעפות הוא counted ידני בתמונות של תאי פורקינג'. כל נקודת סניף מסומנת בנקודה צהובה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.

איור 3. ניטור הפיתוח של העץ הדנדריטי תא פורקינג'. תאי פורקינג' מזוהים צולמו שוב ושוב כדי לפקח על הצמיחה של העץ הדנדריטי. (AC): עץ דנדריטים של תא פורקינג' גדל ומתפתח מיום במבחנה (DIV) 2 עד DIV7. יש צמיחה מתמדת והסתעפות של הדנדריטים בתקופת התרבות זו. (DF): עץ דנדריטים של תא פורקינג' גדל ומתפתח מDIV4 עד DIV11. העץ הדנדריטי מרחיב באופן משמעותי בתקופה זו התרבות. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.

איור 4. פיתוח של העץ הדנדריטי תא פורקינג' הוא מעוכב על ידי PKC או mGluR1 stimulatiב (א), (ד '):. תאי קבוצת ביקורת עם עץ הדנדריטי מפותח היטב. (ב), (ה): אחרי 9 ימים של הדנדריטים טיפול PMA מופיע מעובה והעץ הדנדריטי הוא מאוד מצטמצם בגודל. תאים לעתים קרובות מאבדים את הקיטוב שלהם ולהיות דו קוטבי (E). (ג), (F): אחרי 9 ימים של טיפול DHPG העץ הדנדריטי מצטמצם מאוד בגודלו. שלא כמו בטיפול PMA, סניפים רבים לוואי מאוד עדינים וקצרים נמצאים על הדנדריטים הראשוניים ומשניים. תאים לעתים קרובות מאבדים את הקיטוב שלהם ולהיות דו קוטבי (F). תאי פורקינג' היו דמיינו ידי immunostaining אנטי Calbindin ב( - C) ועל ידי EGFP-ביטוי בתרבויות הנגזרות מעכברי Pcp2-EGFP ב( ד - ו). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.

איור 5. הערכה כמותית של גודל פורקינג' תאים דנדריטים עץ ומסתעף. מדידות כמותיות להראות שגם גודל הדנדריטים עץ (גרף עמודות העליון) וnumber של נקודתי הסתעפות (גרף עמודות נמוך) מופחת מאוד לאחר טיפול PMA או DHPG. הבדלים בין עצים הדנדריטים בקרה ועצים הדנדריטים של תאי פורקינג' מתרבויות שטופלו היו משמעותיים עם p <0.001.

Discussion

השיטות שהוצגו כאן מאפשרים ללמוד פיתוח הדנדריטים תא פורקינג' בתרבויות פרוסות cerebellar organotypic וכדי להעריך כמותית הרחבת הדנדריטים תא פורקינג' על ידי מדידת גודל עץ הדנדריטי ומספר נקודתי הסתעפות הדנדריטים. כמובן, ניתוח כמוני מקיף ומתוחכם יותר של דנדריטים הסלולריים פור?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
הוספת תרביות רקמה	Millipore	PICM 03050 PICM ORG50	את PICMORG50 מוסיף לי שפה נמוכה ומאפשר צפייה של תרבויות חיות במיקרוסקופ
ממ	Gibco, Invitrogen	11012044
1 Glutamax	Gibco, Invitrogen	35050038
אסאל Medum נשר	Gibco, Invitrogen	41010026
סוס סרום	Gibco, Invitrogen	26050070
Phorbol 12-myristaטה 13-תצטט (PMA)	Tocris	1201
(RS) -3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG)	Tocris	0342
הארנב נגד calbindin D-28k	Swant	CB38
אנטי NeuN, השיבוט A60	Chemicon, Millipore	MAB377
ארנב אנטי GFP	Abcam	Ab290