בידוד והתרבות של האדם בחוש הטעם תאים Fungiform גבשושיות

Summary

המטרה היא לפתח פרוטוקול לשחזור לבידוד ושמירה לטווח ארוך של תרבויות אנושיות הטעם תאים fungiform גבשושיות. תאים מאדם fungiform גבשושיות מתקבל על ידי ביופסיה נשמרו בהצלחה במשך יותר משמונה קטעים (12 חודשים) בתרבות ללא אובדן הכדאיות.

Abstract

תאים הטעם הם מאוד מיוחדים, עם מאפיינים ייחודיים, היסטולוגית מולקולריות ופיזיולוגיות המאפשרים זיהוי של מגוון רחב של גירויים פשוטים ומולקולות כימיות מורכבות הכלולים מזונות. ב האדם גבשושיות, fungiform הפרט להכיל מאפס עד כמה שרק 20 בלוטות הטעם. אין פרוטוקול מבוסס תאים אנושיים culturing הטעם, אם כי היכולת לשמור על גבשושיות הטעם התאים בתרבית תאים במשך מחזורים רבים תהיה התועלת רבה לאפיון תכונות מולקולריות, רגנרטיבית, ופונקציונלי של תאים אלה ייחודיים חושיות. מחקרים קודמים של תאים הטעם היה לעשות שימוש טרי תאים מבודדים בתרבות העיקרי, תרבויות explant של מכרסמים, או חצי שלמות בלוטות הטעם של פרוסות רקמה ^1,2,3,4. למרות כל ההכנות הללו יש יתרונות, פיתוח לטווח ארוך תרבויות היתה יכולה לספק יתרונות משמעותיים, במיוחד מחקרים של התא טעם שגשוג differentiation. מספר קבוצות, כולל שלנו, היה מעוניין בפיתוח והקמת תא מודלים טעם ותרבות. רוב הניסיונות תאים הטעם תרבות דיווחו על יכולת הקיום מוגבל, עם תאים בדרך כלל לא מעבר שנמשך 3-5 ד ^5,6,7,8. אנחנו לאחרונה דווח על שיטה מוצלחת לתרבות המורחבת של טעם תאים מכרסמים ^9. אנחנו כאן לדווח לראשונה על הקמת במערכת התרבות חוץ גופית עבור מבודדים תאים אנושיים הטעם fungiform גבשושיות. תאים מאדם fungiform גבשושיות מתקבל על ידי ביופסיה נשמרו בהצלחה במשך יותר משמונה קטעים (12 חודשים) בתרבות ללא אובדן הכדאיות. תאים מוצגים תכונות מולקולריות ופיזיולוגיים רבים האופייניים לתאי הטעם בוגרים. Gustducin ו phospholipase C β2, (PLC-β2) mRNA התגלו תאים רבים מהתגובה transcriptase-פולימראז הפוך שרשרת ואושרו על ידי סידור. ניתוח Immunocytochemistry הפגינו נוכחות של משבducin ו PLC-β2 ביטוי בתאים בתרבית הטעם. בתרבית תאים fungiform אדם גם הציגו עליות סידן תוך תאי בתגובה ריכוזים מתאימים של גירויים הטעם מספר המצביעים על כך קולטני הטעם, לפחות בחלק מן המסלולים איתות נכחו. תוצאות אלו מצביעות על כך מספיק תאים הטעם של בני אדם בוגרים יכול להיות שנוצר ומתוחזק על לפחות שמונה קטעים. רבים מן התאים לשמור על מאפיינים פיזיולוגיים ביוכימיים של תאים מבודדים בחריפות מן האפיתל טעם מבוגר כדי לתמוך השימוש בהם כמערכת מודל טעם. מערכת זו תאפשר מחקרים נוספים של התהליכים המעורבים בידול התפשטות, והתפקוד של תאים קולטני הטעם של יונקים לקראת במבחנה.

האדם גבשושיות fungiform טעם בשימוש להקמת התרבות האנושית תא fungiform נתרמו לחקר בעקבות הסכמה מדעת נכונה תחת פרוטוקולים מחקר נבדקוואושרה על ידי ועדת IRB. פרוטוקול (# 0934) אושרה על ידי שולמן Associates מוסדי סקירה עמוד Inc, סינסינטי, אוהיו. בפרוטוקול נכתב מתחת מבוסס על פרמטרים שפורסמו שדווחו על ידי Ozdener et al. 2011 ^10.

Protocol

1. קבלת גבשושיות האדם טעם Fungiform

1. הסר 07:56 fungiform האדם גבשושיות הטעם מפני השטח הגבי של החלק הקדמי של הלשון באמצעות microscissors האביב מעוגלים.
2. המקום מיד פתרון הבידוד (26 mM NaHCO _3, 2.5 מ"מ לאא ₂ PO _4, גלוקוז 20 מ"מ, 65 מ"מ NaCl, KCl 20 מ"מ, ו 1 mM EDTA מומס במים nuclease ללא ולסנן עיקור).

2. האדם גבשושיות Fungiform טעם עיכול

האדם התא fungiform גבשושיות הטעם יכול להיות מנותק באמצעות שני פרוטוקולים שונים עיכול אנזימטי עם הבדלים קלים.

1. דגירה fungiform גבשושיות בפתרון בידוד עם pronase (1 מ"ג / מ"ל, סיגמא אולדריץ') ו elastase (1 מ"ג / מ"ל ​​סיגמא אולדריץ') בטמפרטורת החדר למשך 30-45 דקות (פרוטוקול 1).
2. דגירה fungiform גבשושיות עם collagenase סוג אני (550 U / mL, החל וורטינגטון) + elastase (10 יח' / מ"ל, החל ווארטhington) + מעכבי טריפסין (0.9 מ"ג / מ"ל, החל וורטינגטון) ב 2 סידן פתרון מ"ל רינגר חינם ב 35 ° C שיטה חלופית אמבט מים עם מחזור הדם במשך 30 דקות החמצון עדין עם 95% מ _2/5% CO _2. (עבור עיכול, פרוטוקול 2)
3. לאחר הדגירה, לשטוף עם גבשושיות הצלצול ו triturate את גבשושיות עם זכוכית מלוטשת אש פיפטה פסטר במשך 10 פעמים.
4. סרכזת אותו במשך 3 דקות על סל"ד 2500 ב RT ולהסיר פתרון בידוד ולהוסיף 1 מ"ל של המדיום הסלולרי טעם ותרבות.
5. העברת מתעכל fungiform גבשושיות לתוך צלחת זכוכית.
6. לנתח fungiform גבשושיות בעדינות עם סכין כירורגית.
7. הוסף 250 μl של גבשושיות גזור לגליל שיבוט על coverslip זנב עכברוש קולגן מסוג 1 מצופה.
8. הוסף 1 מ"ל של המדיום הסלולרי טעם תרבות לבאר כל אחד.

3. Culturing של האדם בחוש הטעם תאים Fungiform גבשושיות

1. דגירה צלחת על 36 מעלות צלזיוס humidifiedבחממה המכילה 5% CO _2.
2. מניחים באינקובטור ללא הפרעה במשך 2 ימים לפני השינוי הראשון של בינוני מלא. תאים הטעם בסופו של דבר להיקשר coverslip מצופה, אם כי זה לא יכול להיות נראית בבירור 1 עד 3 ימים.
3. הסר גליל שיבוט מהצלחת ובינוניים לחלוטין ולהוסיף 1 מ"ל של המדיום הסלולרי טעם גם לתוך כל אחד.
4. להחליף 1/3 של 6-7 ימים בינוניים לכל דבר. אל תשנה בינוני לעיתים קרובות יותר ו / או לחלוטין.
5. יש לבדוק את גדילת התאים תחת מיקרוסקופ כל יום אחר. רוב התאים החדשים גדלים מתחת אשכולות סלולריים. צבירי תאים בדרך כלל לנתק לאחר 2-3 שבועות בתרבות עוזב את התאים החדש.
6. לאחר 40-50% של הגליל שיבוט מכוסה בהרחבת התאים הטעם, trypsinize תאים באמצעות 0.25% w / v טריפסין / EDTA במשך 2-3 דקות על 36 ° C.
7. להעביר את התאים מן הבארות ל -15 מ"ל צינורות, להוסיף 3 כרכים של המדיום הסלולרי טעם תרבות ואחריו צנטריפוגה בסל"ד 3000 למשך 5 דקות בכל מזג החדרature.
8. הסרה של תאים supernatant ו resuspend עם 1 מ"ל של המדיום הסלולרי הטעם.

4. התפשטות האדם בחוש הטעם תאים Fungiform גבשושיות

1. להעביר את התאים לתוך צלחת T25 ולהוסיף 4 מ"ל של מדיום טעם תא (מעבר 0). לשמור על התאים על 36 מעלות צלזיוס חממה humidified המכיל 5% CO _2.
2. להחליף 1/3 של 6-7 ימים עד בינוני בכל התאים בתרבית הטעם הגיעו למפגש 100%. בשלב זה, כדי לאפשר לתאי הטעם כדי הקציר, לשטוף את התאים פעם עם סטרילית PBS אז trypsinize תאים באמצעות 0.25% w / v טריפסין / EDTA במשך 2-3 דקות על 36 מעלות ג
3. לאחר צנטריפוגה כמתואר לעיל, resuspend במדיום הסלולרי מלא טעם תאים העברה ל-T-75 צלוחיות טריים (קטע 1).
4. להחליף 1/3 של 6-7 ימים בינוניים לכל דבר. אל תשנה בינוני לעיתים קרובות יותר ו / או לחלוטין.
5. חזור על שלב 4.3 ו - 4.4 כאשר תאים הגיעו קרוב ל 100% המפגש. פיצול תאים לא יותר דילול 01:04 בבקבוק T75לשמירה על צמיחה נאותה של התאים לאורך זמן.

5. הקפאה מפשירים אדם בתרבית תאים בחוש הטעם Fungiform גבשושיות

1. להקפיא את מלאי התאים הטעם העיקרי, אחרי trypsinization (שלב 4.2), להוסיף 3 מ"ל הטעם המלא תא בינוני תאים העברת עד 15 צינורות סטריליים מ"ל צנטריפוגות קוניים. סרכזת בסל"ד 2500 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. מוציאים בזהירות את התאים supernatant ו resuspend בעדינות עם נפח מתאים של המדיום מקפיא המכיל 95% בסרום שור עוברית (FBS) ו DMSO 5%.
3. העברת התאים שכותרתו, כובע, cryovials סטרילית היטב, ומכניסים לכלי הקפאה המכיל isopropanol. המקום לתוך המקפיא -80 ° C למשך יום אחד לפחות לפני העברת לנצח כדי חנקן נוזלי.
4. להפשיר בקבוקון של קפואים העיקריים אדם הטעם fungiform התאים גבשושיות, במקום על 37 מעלות צלזיוס המים באמבטיה עד מופשר רק כ (1 דקה), תוך כדי עבודה בתרבות למינרית זרימת התאמכסה המנוע.
5. העברת תאים בינוניים מקפיא כדי צינור סטרילי מ"ל 15 צנטריפוגות חרוטי ולהוסיף 5 מ"ל של מדיום התא טעם ותרבות.
6. סרכזת תאים בסל"ד 2500 5 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות לבטל supernatant, תאים resuspend בעדינות עם תא שלם בינוני התרבות טעם, והעברה בקבוק תרבות סטרילית T-25 רקמות.
7. ממשיכים התאים תרבות פי שלב 3 עד 4.

6. נציג תוצאות

ניסיונות לגדל ביופסיות הטעם בתרבות הצליחו 90% מהזמן. כמה ימים לאחר הביופסיה ודיסוציאציה, התאים בדרך כלל החל לגדול ולהעביר החוצה מן פיסות הרקמה fungiform גזור שנותרו אחרי הליך ניתוק. למרות תאים בודדים נראו 24-48 שעות לאחר ציפוי (איור 1 א), התאים גדלו עד 2-3 שבועות תחת אשכולות תאים מחוברים, לפעמים יצירת לתאי הבת (1B איור). מן הביופסיהing 4-8 האנושי fungiform גבשושיות, מבודד הראשונים של ראשוניים בתאים אנושיים הטעם fungiform גבשושיות להגיע לכ 2000 - 8000 תאים 4 שבועות בתרבות. התרחבות T25 תרבות צלוחיות סלולריים (מעבר 0) של 3-4 שבועות נוספים יביא אדם בעל טעם fungiform התאים גבשושיות בתרבות מותאמת (איור 1 ג). ראשיים אדם הטעם fungiform התאים גבשושיות ניתן להרחיב עוד יותר בתרבות להניב כלפי מעלה של לפחות מיליון תאים על ידי מעבר-1 ב 3-4 שבועות (1D איור). תאים הטעם ראשיים ימשיך לגדול במשך יותר מ 8 קטעים.

המורפולוגיה של אדם בתרבית תאים גבשושיות הטעם fungiform בתרבות דומה תאים בתרבית chemosensory שתואר קודם לכן ^11,12 .. בתרבית רוב האדם הטעם fungiform התאים גבשושיות שמרו מראה קומפקטי המקורית של גופי התא עם או בלי אחד או יותר תהליכים עד 15-30 ימים. לאחר שהגיעו מפגש רוב לספירה תרבותיתlls היה מראה מקוטב, מוארך. תאים בוגרים הטעם מורכב מכמה תת היסטולוגית שונים טעם התערוכה סלולריים תכונות ספציפיות. כאן אנו מראים כי תאים אלה בתוך התרבויות להציג תכונות מולקולריות ופיזיולוגיים רבים האופייניים לתאי הטעם בוגרים. Gustducin ו phospholipase C - β2, (PLC-β2) mRNA התגלו על ידי תגובה transcriptase-פולימראז הפוך שרשרת מוצרי אישרו על ידי רצף (איור 2). ביטוי gustducin ו PLC-β2 התגלה immunocytochemically המעידים על נוכחות של סוג II דמויי תאים (איור 3 B ו-D בהתאמה). השכיחות היחסית של דפוסי הביטוי gustducin ו PLC-β2 המשקף המסלולים התא איתות סוגי תאים לא בדיוק משקפים כי ראיתי in vivo. הגורמים הקובעים את החלוקה היחסית של סוגי תאים שונים בתוך ניצן הטעם אינם ידועים, ולא יכול להיות משוכפל התנאים תרבות. לכן, ב oth את הדומה והשונה בין תאים בתרבית ו שלהם עמיתיהם ב vivo לספק הזדמנות לבחון את הרגולציה של מאפיינים אלה ברמה המולקולרית, בתנאים שבהם ניתן להשפיע פיקוח.

קריטריון חשוב עבור מערכת מודל היא הנוכחות של תכונות פעילות הרלוונטיים. תאים בתרבית גם הציגו עליות חזקות של סידן תוך תאי בתגובה ריכוזים מתאימים של גירויים הטעם כמה (איור 4). במחקרים אלה, גירויים מתוק ומר לעורר עלייה סידן תוך תאי שעשויים מתאימות שלילת קוטביות. אלו תאים כמו הטעם המאפיינים של תאים בתרבית לתת תמיכה לטענה כי מערכת מודל המתואר כאן יהיה נכס בעל ערך למחקרים נוספים של המסלולים התמרה ואת יכולת ההתחדשות של תאים הטעם האנושי.

fig1.jpg "/>
באיור 1. קובץ מצורף ומורפולוגיה של אדם בתרבית תאים הטעם fungiform גבשושיות. ראשיים אדם הטעם fungiform גבשושיות תאים תרבויות גדל על צלחות קולגן מסוג 1 היו מצופים צילמו אחרי 2 ימים (א '). אדם גבשושיות fungiform תאים הטעם גדל עד 4 שבועות תחת אשכולות תאים מחוברים, שכמו להצמיח לתאי הבת. התאים בדרך כלל גדל המפגש בתוך ארבעה שבועות (ב '), ו (C ו-D) מייצג יום 2 ו 4 שבועות לאחר הקטיף ואת הזריעה המחודשת בהתאמה. תאים בתרבית המשיך לגדול לפחות 8 חודשים. ברים בקנה מידה = 50 ננומטר. חלק איור 1 הוצגה גם Ozdener et. אל. ^10.

איור 2. RT-PCR התוצאות הראו נוכחות של תאים ספציפיים הטעם mRNAs סמן ביולוגי (gustducin ו PLC-β2,). RNA הכולל בתרבית תאים fungiform אדם היה transc הפוךribed באמצעות סינתזה כתב עילי ראשית מערכת סטרנד עבור RT-PCR (Invitrogen) ונעשה בו שימוש על ידי הגברה PCR עם פריימרים ספציפיים המיועדים זיהוי של gustducin ו PLC-β2. Primers (טבלה 1) נבחרו ההיקף אחד או יותר אינטרונים. MRNA כל זוהה בתרבית תאים אנושיים הטעם fungiform גבשושיות של מעבר 4 או 5 עם מוצרים הגברה של גודל כצפוי, אושר על ידי סידור. MRNA ספציפי לא התגלה בניסויים שליטה ללא transcriptase הפוכה המציין זיהום לא הדנ"א הגנומי. מוצרי ה-PCR הופרדו על 2% agarose ג'ל והמוצרים מוגבר על ג'ל היו נכרת בסכין גילוח. ה-DNA היה שחולצו מן ג'ל באמצעות QIAquick ג'ל הפקת Kit (Qiagen). מוצרי ה-PCR היו רצף של אוניברסיטת פנסילבניה מתקני רצף. C-PCR ו-C-RT הם ניסויים בקרה PCR ו transcriptase הפוכה, בהתאמה. חלק איור 2 הוצג גם Ozdener et. אל. ^10.

איור 3. Immunostaining של טעם תרבותי אנושי מעבר fungiform התאים גבשושיות 4 או 5 הראו נוכחות של סמנים ביולוגיים סלולריים הטעם. אדם בתרבית הטעם fungiform גבשושיות תאים (5 ימים) תוקנו עם paraformaldehyde 4% ו מודגרות עם נוגדנים ראשוניים (טבלה 2) לילה ב 4 ° C. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ TCS-SP2 Leica confocal סריקת לייזר. כ, 60% של תאים בתרבית הטעם fungiform גבשושיות תויגו עם gustducin (ב ') 20-30% עם PLC-β2 (ד'). תמונות שידור של תאים המתאימים מוצגים (A ו-C). עבור פקדים, immunostaining עם אימונוגלובולינים נוגדנים ספציפיים הפגינו היעדר תגובתיות חיסוני ספציפי (מידע לא מוצג). ברים בקנה מידה = 50 ננומטר. חלקאיור 3 הוצג גם Ozdener et. אל. ^10.

באיור 4. אדם בתרבית הטעם fungiform גבשושיות תאים מעבר 4 או 5 להגיב לגירויים שונים. אדם בתרבית הטעם fungiform גבשושיות תאים (4-5 ימים) עמוסות 1mm פורעה, 02:00 (בדיקות מולקולריות) ו - 10 מ"ג / מ"ל ​​Pluronic F127 (בדיקות מולקולריות). שינויים ברמות סידן תוך תאי ([Ca ^{2 +]} i) בתרבית תאים אנושיים הטעם fungiform גבשושיות נמדדו באמצעות תקן הדמיה טכניקות ידניות. התאים היו דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באורכי גל עירור של 340 ננומטר ו -380 ננומטר אורך גל הפליטה נקבע על ידי מסנן הלהקה לעבור מרוכז ב 510 ננומטר. גירויים היו מומסים בתמיסה אמבטיה ואז ה-pH ו osmolarity וסידרה במידת הצורך. בתרבית תאים אנושיים הטעם fungiform גבשושיות הגיב לגירויים מתוק ומר. Graphs להמחיש התגובות נציג של [Ca 2] אני רמות תאים בודדים במהלך החשיפה () Denatonium (2 מ"מ), (ב) סוכרלוז (1 מ"מ). זכר מייצגת תאים בודדים בודדים.

גן	רצף	PCR מצב		צפוי גודל (נ"ב)	הפניה
β-אקטין	GGACTTCGAGCAAGAGATGG AGCACTGTGTTGGCGTACAG	7 דקות 45 שניות 45 שניות 45 שניות 7 דקות	95 94 53 72 72	234	NM_001101.3
Gustducin	TCTGGGTATGTGCCAAATGA GGCCCAGTGTATTCTGGAAA	7 דקות 45 שניות 45 שניות 45 שניות 7 דקות	95 94 53 72 72	386	NM_001102386
PLC-β2	GTCACCTGAAGGCATGGTCT TTAAAGGCGCTTTCTGCAAT	3 דקות 30 שניות 30 שניות 60 שניות 7 דקות	95 94 53 72 72	333	NM_004573

טבלה 1. Primers ותנאים המשמשים לאיתור מולקולות טעם ספציפיות.

ראשי נוגדן	מקור	מארח	דילול	משני נוגדן	מקור	מארח	דילול
Gustducin	SantaCruz	ארנב	1:500	נגד ארנב IgG Alexa 633	בדיקות מולקולריות	עז	1:500
PLC-β 2	SantaCruz	ארנב	1:500	נגד ארנב IgG Alexa 633	בדיקות מולקולריות	עז	1:500

נוגדנים לוח 2. משמש לאיתור ביטוי של מולקולות ספציפיות.

Discussion

אנו שומרים על התאים המתקבלים גבשושיות fungiform האדם טעם כבר למעלה מ 8 קטעים, פורש תקופה של 12 חודשים. תרבויות אלה לייצר תאים חדשים, שרבים מהם לפירעון במבחנה לשלב שבו הם מביעים סמנים שונים של בוגרים ניצן סוגים הטעם סלולריים, בנוסף תכונות מולקולריות ופיזיולוגיות המפתח ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה
MCDB 123	Sigma-Aldrich
Iscove של DMEM בינוני	MediaTech
Elastase	Sigma-Aldrich
Pronase E	Sigma-Aldrich
Elastase	וורטינגטון
סויה מעכב טריפסין	וורטינגטון
Collagenase סוג 1	וורטינגטון
זנב עכברוש קולגן סוג 1	BD למדעים
פורעה-2 בבוקר	בדיקות מולקולריות
עילי סטרנד ראשון סינתזה מערכת RT-PCR	Invitrogen
הלייקה TCS SP2 מיקרוסקופ Confocal Spectral	Leica Microsystems בע"מ
גילוי-1 הדמיה התחנה Metamorph תוכנה	התקנים מולקולריים
קטנים עדין עצה ו מלקחיים נוספות מספריים נאים של אביב	מדע כלים עדינים