Выделение и культуры клеток человека Вкус Fungiform Сосочки

Резюме

Мы, направленных на развитие воспроизводимый протокол выделения и поддержания долгосрочных культурах клеток человека вкус fungiform сосочков. Клетки человека fungiform сосочков, полученных при биопсии были успешно эксплуатируется в культуре в течение более чем восьми проходов (12 месяцев) без потери жизнеспособности.

Аннотация

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple stimuli and complex chemical molecules contained in foods. In human, individual fungiform papillae contain from zero to as many as 20 taste buds. There is no established protocol for culturing human taste cells, although the ability to maintain taste papillae cells in culture for multiple cell cycles would be of considerable utility for characterizing the molecular, regenerative, and functional properties of these unique sensory cells. Earlier studies of taste cells have been done using freshly isolated cells in primary culture, explant cultures from rodents, or semi-intact taste buds in tissue slices^1,2,3,4. Although each of these preparations has advantages, the development of long-term cultures would have provided significant benefits, particularly for studies of taste cell proliferation and differentiation. Several groups, including ours, have been interested in the development and establishment of taste cell culture models. Most attempts to culture taste cells have reported limited viability, with cells typically not lasting beyond 3-5 d^5,6,7,8. We recently reported on a successful method for the extended culture of rodent taste cells⁹. We here report for the first time the establishment of an in vitro culture system for isolated human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability. Cells displayed many molecular and physiological features characteristic of mature taste cells. Gustducin and phospholipase C β2, (PLC-β2) mRNA were detected in many cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and confirmed by sequencing. Immunocytochemistry analysis demonstrated the presence of gustducin and PLC-β2 expression in cultured taste cells. Cultured human fungiform cells also exhibited increases in intracellular calcium in response to appropriate concentrations of several taste stimuli indicating that taste receptors and at least some of the signalling pathways were present. These results sufficient indicate that taste cells from adult humans can be generated and maintained for at least eight passages. Many of the cells retain physiological and biochemical characteristics of acutely isolated cells from the adult taste epithelium to support their use as a model taste system. This system will enable further studies of the processes involved in proliferation, differentiation and function of mammalian taste receptor cells in an in vitro preparation.

Human fungiform taste papillae used for establishing human fungiform cell culture were donated for research following proper informed consent under research protocols that were reviewed and approved by the IRB committee. The protocol (#0934) was approved by Schulman Associates Institutional Review Board Inc., Cincinnati, OH. Written protocol below is based on published parameters reported by Ozdener et al. 2011¹⁰.

протокол

1. Получение прав Сосочки Вкус Fungiform

1. Удалить 7:56 человека сосочков вкус fungiform от дорсальной поверхности передней части языка использованием изогнутого microscissors весной.
2. Место сразу в изоляцию решение (26 мМ NaHCO _3, 2,5 мМ NaH ₂ PO _4, 20 мМ глюкозы, 65 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА растворяются в нуклеазы без воды и фильтрации стерилизовать).

2. Вкус человека Fungiform Сосочки пищеварения

Вкус человека fungiform клетки сосочков могут быть отделены с помощью двух различных ферментативных протоколов пищеварения с небольшими различиями.

1. Инкубируйте fungiform сосочков в изоляции решение проназой (1 мг / мл, Sigma Aldrich) и эластазы (1 мг / мл, Sigma Aldrich) при комнатной температуре в течение 30-45 мин (протокол 1).
2. Инкубируйте fungiform сосочков с коллагеназы типа I (550 Ед / мл, от Уортингтон) + эластаза (10 Ед / мл, от суслаhington) + ингибитор трипсина (0,9 мг / мл, от Уортингтон) в 2 мл кальция бесплатно раствор Рингера в 35 ° C водяную баню с циркуляцией в течение 30 минут и нежный кислорода с 95% O _2/5% CO _2. (Альтернативный метод пищеварения, протокол 2)
3. После инкубации промыть с сосочками звонка и растереть сосочков с огнем полированное стекло пипетки Пастера в 10 раз.
4. Центрифуга в течение 3 минут при 2500 оборотов в минуту при комнатной температуре и удаления изоляции решение и добавьте 1 мл вкус питательную среду клетки.
5. Передача переваривается fungiform сосочков в стеклянную посуду.
6. Проанализируйте fungiform сосочки нежно с хирургической бритвой.
7. Добавить 250 мкл расчлененный сосочков на клонирование цилиндр на хвост крысы коллагена типа 1 покрытые покровным.
8. Добавить 1 мл вкус среднего культуре клеток в каждую лунку.

3. Культивирование клеток человека Вкус Fungiform Сосочки

1. Инкубируйте пластины на 36 ° C в увлажненнойинкубатор, содержащий 5% CO _2.
2. Поместите в инкубаторе в покое на 2 дня до первого изменения полной среды. Вкус клетки в конечном итоге связываться с покрытием покровное, хотя оно не может быть хорошо видны от 1 до 3 дней.
3. Удалить клонирование цилиндр из пластин и среднего полностью и добавьте 1 мл вкус среднего клетки в каждую лунку.
4. Заменить 1/3 от средней каждый 6-7 дней. Не изменяйте среднего чаще и / или полностью.
5. Проверьте рост клеток под микроскопом каждый день. Большинство новых клетки растут под клетки кластеров. Сотовые кластеров обычно отделить через 2-3 недели в культуре оставив вновь созданные клетки.
6. Как только 40-50% от клонирования цилиндр покрыт расширения вкусовых клеток, trypsinize клеток с использованием 0,25% вес / объем трипсин / ЭДТА в течение 2-3 минут при 36 ° C.
7. Передача клеток из скважин в 15 мл труб, добавьте 3-х томах вкуса среднего культуре клеток с последующим центрифугированием при 3000 оборотов в минуту в течение 5 минут при комнатной температурепературы.
8. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл вкус средней клетке.

4. Распространение клеток человека Вкус Fungiform Сосочки

1. Передача клеток в T25 плиты и добавить 4 мл вкусовая клетка среды (переход 0). Поддерживать клетки при 36 ° C в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% CO _2.
2. Заменить 1/3 от средней каждый 6-7 дней до культивируемых клеток вкус достигли 100% слияния. В это время, чтобы вкусовые клетки для уборки, мытья клетки раз стерильной PBS то trypsinize клеток с использованием 0,25% вес / объем трипсин / ЭДТА в течение 2-3 минут при 36 ° C.
3. После центрифугирования, как описано выше, ресуспендируют в полной среде клетки вкус и передачи клеткам свежий Т-75 колб (проход 1).
4. Заменить 1/3 от средней каждый 6-7 дней. Не изменяйте среднего чаще и / или полностью.
5. Повторите шаги 4.3 и 4.4, когда клетки достигли почти 100% слияния. Сплит клеток не более чем на разведении 1:4 в колбе T75для поддержания нормального роста клеток с течением времени.

5. Замораживание и размораживание культивируемых клетках человека Вкус Fungiform Сосочки

1. Чтобы заморозить запасы первичных клеток вкус, после трипсинизации (шаг 4.2), добавить 3 мл полной среды клетки вкус и передачи клеток стерильной 15 мл конические пробирки. Центрифуга на 2500 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Осторожно удалите супернатант и осторожно ресуспендируют клеток с соответствующим объемом замораживание среде, содержащей 95% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 5% ДМСО.
3. Передача меченых клеток, стерильная криопробирки, крышка плотно, и место в замораживания контейнер, содержащий изопропиловый спирт. Место в -80 ° C морозильник по крайней мере за день до передачи на неопределенное время в жидком азоте.
4. Чтобы таять флакон замороженных первичных человеческих fungiform вкус сосочков клетки, место при 37 ° С водяной бане, пока только талые (примерно 1 минуту), во время работы в ламинарный поток клеточных культуркапот.
5. Передача и замораживании клетки средних стерильный 15 мл конические трубки центрифуги и добавляют 5 мл вкус питательную среду клетки.
6. Центрифуга клеток при 2500 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре. Тщательно отказаться супернатант, мягко ресуспендирования клеток с полным вкусом культуре клеток средних и передачи стерильных Т-25 колбу культуре ткани.
7. Продолжайте культуре клеток в соответствии с шагом от 3 до 4.

6. Представитель Результаты

Попытки выращивать вкус биопсии в области культуры были успешными 90% времени. Через несколько дней после биопсии и диссоциации, клетки обычно начал расти и мигрировать наружу из частей расчлененного fungiform ткани, которая осталась после процедуры диссоциации. Несмотря на отдельные клетки были видны через 24-48 ч после покрытия (рис. 1а), клетки росли в течение 2-3 недель по прилагаемой кластеров клетки, иногда создание дочерних клеток (рис. 1б). С биопсииING 4-8 человека fungiform сосочков, начальная изолятов первичных клеток человека вкус fungiform сосочков достигает примерно 2000 - 8000 клеток в течение 4 недель в культуре. Расширение в культуре клеток T25 колбы (переход 0) дополнительные 3-4 недели приведет с человеческими клетками вкус fungiform сосочков в области культуры адаптированные (рис. 1в). Первичные человеческие клетки вкус fungiform сосочки могут быть расширены в области культуры, чтобы дать вверх, по крайней мере миллион клеток проход-1 в течение 3-4 недель (рис. 1D). Первичные элементы вкус будет продолжать расти в течение более 8 проходов.

Морфология культурного человека fungiform вкус сосочков клеток в культуре была похожа на культурные хемосенсорной клеток описано выше ^11,12 .. Большинство культивируемых клетках человека вкус fungiform сосочков сохранили свой первоначальный внешний вид компактного клеточных тел с или без одного или нескольких процессов до 15-30 дней. После того, как они достигли слияния большинство культурных сеООО было поляризованным вытянутый вид. Зрелые клетки вкус состоит из нескольких различных гистологических подтипов и выставки вкусовая клетка особенностей. Здесь мы показываем, что клетки в пределах этих культур отображать многие молекулярные и физиологические особенности, характерные для зрелых клеток вкус. Gustducin и фосфолипазы С - β2 (PLC-β2) мРНК были обнаружены обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции и продукции подтверждено последовательности (рис. 2). Выражение gustducin и PLC-β2 был обнаружен immunocytochemically указывающие на наличие типа II-подобных клеток (рис. 3 B и D соответственно). Распространенность и относительная модели выражение gustducin и PLC-β2 отражает клетки сигнальных путей и типы клеток, не точно отражают, что видел в естественных условиях. Факторов, определяющих относительное распределение различных типов клеток в почку вкус неизвестны и не могут быть воспроизведены в культуре условиях. Таким образом, б др. сходства и различия культур клеток и их коллеги в естественных условиях дают возможность изучить регулирование этих характеристик на молекулярном уровне, в условиях которой можно манипулировать и контролировать.

Важным критерием для модельной системы является наличие соответствующих функциональных свойств. Культивируемых клеток также демонстрируют надежную увеличение внутриклеточного кальция в ответ на соответствующие концентрации несколько стимулов вкус (рис. 4). В этих исследованиях, сладкие и горькие стимулы вызывают увеличение внутриклеточного кальция, что может соответствовать к деполяризации. Эти вкус клеточных свойства культивируемых клеток оказывать поддержку утверждения, что модель системы, которую мы описываем здесь станет ценным активом для дальнейшего исследования трансдукции и регенеративные способности клеток человека вкус.

fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Вложений и морфология культивируемых клетках человека вкус fungiform сосочков. Первичные человеческие fungiform вкус сосочков клеточных культурах, выращенных на коллаген 1-го типа покрытия пластин были обследованы через 2 дня (A). В клетках человека вкус fungiform сосочков вырос до 4 недель в прилагаемом кластеров клетки, которые, казалось, приводят к дочерним клеткам. Клетки обычно выросла до слияния в течение четырех недель (B) и (C и D) представляет собой 2-й день и через 4 недели после сбора урожая и пересев соответственно. Культивируемые клетки продолжали расти, по крайней мере 8 месяцев. Масштаб баров = 50 нм. Часть Рисунок 1 также был представлен в Ozdener и др.. ал. ^10.

Рисунок 2. RT-PCR результаты показали наличие специфических биомаркеров вкусовая клетка мРНК (gustducin и PLC-β2). Тотальная РНК из культивируемых клеток человека fungiform была обратной Закавкribed использованием Надстрочный Первая система синтеза Strand для RT-PCR (Invitrogen) и используется для ПЦР путем усиления конкретных праймеры для выявления gustducin и PLC-β2. Грунтовки (табл. 1) было выбрано, чтобы охватить одну или несколько интронов. Каждый мРНК был обнаружен в культуре человека fungiform вкус сосочков клетки от прохождения 4 или 5 продуктов амплификации ожидаемого размера, подтверждает последовательность. Конкретные мРНК не была обнаружена в контрольных опытах без обратной транскриптазы, указывающее на отсутствие геномной ДНК. ПЦР-продукты были разделены на 2% агарозном геле и усиленный продукции на геле вырезали бритвой. ДНК выделяли из геля использованием QIAquick гель Добыча Kit (Qiagen). Продукты ПЦР последовательно в университете Пенсильвании средств виртуализации. C-PCR и C-RT являются контрольные эксперименты для ПЦР и обратной транскриптазы, соответственно. Часть 2 также была представлена ​​в Ozdener и др.. др.. ^10.

Рисунок 3. Иммуноокрашивание культурного человека fungiform вкус сосочков клеток проход 4 или 5 показали наличие биомаркеров вкусовая клетка. Искусственный человеческий fungiform вкус сосочков клетки (5 дней) были зафиксированы 4% параформальдегида, и инкубировали с первичными антителами (табл. 2) в течение ночи при 4 ° C. Изображения были получены с Leica TCS-SP2 конфокальной микроскопии лазерного сканирования. Около 60% культивируемых клеток вкус fungiform сосочки были помечены gustducin (B) и 20-30% с PLC-β2 (D). Передача изображений в соответствующих ячейках показаны (А и С). Для элементов управления, с антителами иммунной специфического иммуноглобулина показал отсутствие неспецифической реактивности иммунной (данные не представлены). Масштаб баров = 50 нм. Частьна рисунке 3 также был представлен в Ozdener и др.. ал. ^10.

Рисунок 4. Искусственного человека fungiform вкус сосочков клетки от прохождения 4 или 5 реагировать на различные раздражители. Искусственный человеческий fungiform вкус сосочков клеток (4-5 дней) были загружены 1mM Фура-2 AM (Molecular Probes) и 10 мг / мл Pluronic F127 (Molecular Probes). Изменения внутриклеточного уровня кальция ([Ca ^{2 +]} я) в культивируемых клетках человека вкус fungiform сосочки были измерены с помощью стандартных методов визуализации руководства. Клетки были визуализированы использованием перевернутой флуоресцентного микроскопа при возбуждении длиной волны 340 нм и 380 нм и длине волны излучения установленных фильтров полосы пропускания с центром в точке 510 нм. Стимулы растворяли в ванной раствором, а затем рН и осмолярность скорректировать при необходимости. Культивируемых клетках человека вкус fungiform сосочков ответ на сладкие и горькие стимулы. Graphs иллюстрации представитель ответы [Ca +2] я уровней в отдельных клетках при воздействии (А) Denatonium (2 мм), (B), сукралоза (1 мм). Каждая кривая представляет одну отдельных клеток.

Ген	Последовательность	ПЦР состояние		Ожидаемый размер (Б.п.)	Ссылка
β-актина	GGACTTCGAGCAAGAGATGG AGCACTGTGTTGGCGTACAG	7 мин 45 сек 45 сек 45 сек 7 мин	95 94 53 72 72	234	NM_001101.3
Gustducin	TCTGGGTATGTGCCAAATGA GGCCCAGTGTATTCTGGAAA	7 мин 45 сек 45 сек 45 сек 7 мин	95 94 53 72 72	386	NM_001102386
PLC-β2	GTCACCTGAAGGCATGGTCT TTAAAGGCGCTTTCTGCAAT	3 мин 30 сек 30 сек 60 сек 7 мин	95 94 53 72 72	333	NM_004573

Таблица 1. Праймеры и условия, используемые для определения вкуса конкретных молекул.

Первичное антитело	Источник	Хозяин	Разбавление	Вторичными антителами	Источник	Хозяин	Разбавление
Gustducin	Сантакрус	Кролик	1:500	Анти-IgG кролика Alexa 633	Молекулярные зонды	Козел	1:500
PLC-β 2	Сантакрус	Кролик	1:500	Анти-IgG кролика Alexa 633	Молекулярные зонды	Козел	1:500

Таблица 2. Антитела для выявления экспрессии специфических молекул.

Обсуждение

Мы поддерживаем клеток, полученных из человеческих сосочков вкус fungiform более 8 проходов, охватывающий период в 12 месяцев. Эти культуры генерировать новые клетки, многие из которых созревают в пробирке до стадии, когда они выражают несколько маркеров зрелых типов бутон вкус клетки, ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания
MCDB 123	Sigma-Aldrich
Искова DMEM среднего	Mediatech
Эластазы	Sigma-Aldrich
Проназой E	Sigma-Aldrich
Эластазы	Уортингтон
Соя ингибитор трипсина	Уортингтон
Коллагеназы типа 1	Уортингтон
Крыса хвостом коллагена типа 1	BD наук
Фура-2 AM	Молекулярные зонды
Надстрочный Первая система синтеза Strand для RT-PCR	Invitrogen
Leica TCS SP2 спектральной конфокальной микроскопии	Leica Microsystems, Inc
Discovery-1 изображений станции и программное обеспечение Метаморф	Molecular Devices
Малый штраф наконечником щипцы и ножницы дополнительный штраф весной	Изобразительных средств наук