נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

Summary

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור microarray תפוקה גבוהה מרובב נוגדנים עם שיטת הזיהוי lectin כי ניתן להשתמש פרופיל glycosylation של חלבונים מסוימים. פרוטוקול זה כולל ריאגנטים אמינים חדשים מפחית באופן משמעותי את הזמן, עלויות, ציוד מעבדה דרישות לעומת בהליך הקודם.

Abstract

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.

Introduction

Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes^1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases ^7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of α-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma ^13-15, and CA199 for pancreatic cancer ^{16, 17} are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample ¹⁸. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO₄ in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample ^18-20. This method has been used successfully in multiple different labs ^{1, 7, 13, 19-31}. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

Protocol

1. הדפס microarray נוגדן עבור assay

1. לדלל את כל הנוגדנים ל 0.5 מ"ג / מ"ל ​​של תמיסת מלח פוספט חיץ, pH 7.2 (PBS).
2. Aliquot 40 μl של נוגדן זה לתוך צלחת 384, גם המקור.
3. טען את צלחת 384 גם מקור על microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
4. טען 20 microarray שקופיות נתיב אל microarrayer כמטרה.
5. הגדר את microarrayer להדפיס 48 subarrays זהים, בהם 27 נוגדנים וחלבונים שליטה הם הבחינו בשלושה עותקים בדפוס 9x9 (איור 1E, 1F).
6. התחל microarrayer להדפיס את microarray שקופיות נוגדנים.
7. לאסוף את microarray שקופיות נוגדנים, ולאחסן אותם קלטת שקופיות עם יבוש. אבק לאטום את הקלטת בתוך שקית ניילון באמצעות ואקום אוטם (Foodsaver).
8. אחסן את השקופיות microarray חתום על 4 מעלות במקרר.

2. מבחינה כימית חסום microarray נוגדן למניעת GBPקשירה של נוגדנים ללכוד

Assay microarray מתחיל פעם אחת את השקופיות microarray חסומים כימית נמשך כ -8 שעות. פעם אחת התחיל assay microarray יש להסתיים (שלבים 2 עד 8).

1. קח microarray מחליק מהמקרר, ואת לאזן אותם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
2. להסיר את השקופית מתיבת אחסון בקצרה לשטוף אותם פוספט pH 7.2 חיץ מלוחים עם 0.1% Tween 20 (PBST0.1) פעם שקופית כביסה אגן ולאחר מכן, 15 mM pH נתרן אצטט חיץ 5.0 עם 0.1% Tween (CBT0 0.1) באופן רציף. דגירה את השקופיות ב CBT0.1 במשך 10 דקות באגן שקופיות כביסה.
3. הכן mM טרי 150 NaIO ₄ ב 15 נתרן אצטט mM מאגר ה-pH 5.0 (CB), ולשמור אותו לתוך השקופית כביסה אגן במקרר תוך הימנעות אור לפני השימוש.
4. להסיר את השקופית מ CB, והכניס אותו לתוך הכיור ובו NaIO טרי ₄ עם הצד נוגדןפונה כלפי מעלה. מכסים את הקערה בנייר כסף, כדי למנוע אור, דגירה אגן שקופיות למשך 2 שעות עם עדין רועדת על 4 מעלות במקרר.
5. הכינו 300 מ"ל של 10 חומצה גלוטמית hydrazide mM (חוסם) ב CB.
6. להסיר את השקופית מן האגן, בקצרה לשטוף אותו CB 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם באגן שקופיות כביסה.
7. דגירה של שקופיות חוסם באגן כביסה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
8. הסר את השקופיות מן האגן, ולשטוף אותם עם PBST0.1 במשך 3 דקות.

3. חסום שאינם ספציפיים Bindings ל microarray עם אלבומין בסרום שור (BSA)

1. הכינו 300 מ"ל של BSA 1% פוספט pH 7.2 חיץ מלוחים עם Tween 0.5% (PBST0.5) באגן שקופית כביסה, ו דגירה שקופיות microarray באגן שעה 1 בטמפרטורת החדר עם בעדינות רועד.
2. יש לשטוף את השקופיות ב PBST0.1 שלוש פעמים במשך 3 דקות בכל פעם.
3. לשים את השקופיתעל מדף השקופית ולאחר ספין XG ב 1200 על צנטריפוגה 2 דקות כדי לייבש את השקופית microarray.

4. חותם השעווה רשת לשקופית microarray להפריד כל Subarray

1. טרום חימום imprinter שעווה על 70 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
2. טען את השקופית microarray חסמו את imprinter שעווה עם הצד הפונה אל הנוגדן שעווה. משוך בעדינות את הידית חותם שעווה לשקופית באופן שווה.

5. החל דגימות סרום לשקופית microarray

1. במהלך שלב 2.4, להכין דגימות סרום assay או פרופיל glyco במדגם 1 (5.1.1), או מדידה אחת glyco epiptope בין דוגמאות רבות (5.1.2).
   1. בניסוי על profilings glycan של גליקופרוטאינים בסרום מספר במדגם 1 בסרום באמצעות מספר רב של Gbps (ראה הניסוי מדגם 1), אחד דגימות סרום יחולו על כל subarrays. במקרה זה, 40 מספיק סרום μl הוא מדולל לתוך μl 360 של PBS המכיל 0.1%Tween-20, 0.1% Brij 35, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של העכבר IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של עכברוש IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ארנב IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של עז IgG ו - 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של החמור IgG. נפח זה מספיק ליישום 6 μl של פתרון בסרום בדילול מלא על כל subarray.
   2. בניסוי למדידת glycan 1 על חלבונים בסרום מרובים בין דגימות סרום מרובים באמצעות אחת לתגליות GBP (ראה הניסוי מדגם 2). במקרה זה, 1 מספיק סרום μl הוא מדולל לתוך μl 9 של PBS המכיל 0.1% Tween-20, 0.1% Brij 35, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של העכבר IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של עכברוש IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ארנב IgG , 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של עז IgG ו - 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של החמור IgG. נפח זה מספיק ליישום 6 μL של פתרון בסרום בדילול מלא על כל subarray.
2. לאחר חותם שעווה בשלב 4, בזהירות להחיל 6 μL מדגם בדילול מלא או דגימות בקרה (PBST0.1) כדי subarray כל השקופית. דגירה שקופית קלטת humidified במגבות נייר רטובות בטמפרטורת החדרשעה 1.
3. יש לשטוף את השקופית עם PBST0.1 שלוש פעמים במשך 3 דקות בכל פעם.
4. לייבש את השקופית על ידי ספינינג אותו XG 1200 דקה 2.

6. החל GBP Biotinylated (נוגדן Lectin או נגד glycan) לשקופית

1. במהלך שלב 2.4, להכין 10μg/ml של לקטינים biotinylated / Gbps ב PBST0.1.
   1. בניסוי פרופיל glycan כי בדיקה דגימה אחת עם לקטינים רבים (דוגמת ניסוי 1), להכין 350 μL של lectin biotinylated כי היא מספקת את כל subarrays.
   2. ההקרנה אחת epitope / סמן glycan בדגימות מרובים באמצעות לקטינים רבים, להכין 10 μl של lectin כל biotinylated זה מספיק subarray 1.
2. החל 6 μL של lectin biotinylated בדילול מלא (ים) subarray כל שקופית, ולאחר דגירה בתיבה שקופיות humidified במגבות נייר רטובות בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
3. יש לשטוף את השקופיות עם PBST0.1 שלוש פעמים במשך 3 דקות כל טילי.
4. לייבש את השקופית על ידי ספינינג אותו XG 1200 בצנטריפוגה במשך דקה 2.

7. החל NeutrAvidin תווית דיי גילוי Fluorescence

1. הכן 350 μL של NeutrAvidin 549 Dylight שכותרתו כי היא מספקת את כל subarrays.
2. החל 6 μL של NeutrAvidin 549 Dylight שכותרתו subarray על כל אחד, דגירה שקופית קלטת שקופיות humidified בטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
3. יש לשטוף את השקופית עם PBST0.1 שלוש פעמים במשך 3 דקות בכל פעם.
4. לייבש את השקופית על ידי ספינינג אותו XG 1200 בצנטריפוגה במשך דקה 2.

8. להשיג תמונה microarray שקופיות על ידי סריקת שקופיות

1. לסרוק את השקופית באמצעות סורק microarray הקרינה ברזולוציה של 10 מיקרומטר. הגדרות לייזר ו PMT צריך להיות חזק ככל האפשר, אך לא במקום הרוויה הוא ציין.

9. נתונים כריה ניתוח

1. פתח את התמונה ArrayPro 3.2.
2. הגדרת תבנית המערך על פי המפה מציגה את מערך כתמים במקומות נוגדנים. בזהירות ליישר כל עיגול בתבנית על המקום המתאים בתמונה.
3. חלץ את העוצמה של כל מקום לקובץ Excel לניתוח נוסף.

10. נציג תוצאות

לדוגמא ניסוי 1

Glycosylation פרופיל של גליקופרוטאינים בסרום מספר במדגם קרצינומה של המטופל hepatocellular בסרום באמצעות microarray הנוגדן חסם כימית עם זיהוי לקטינים נפוצה.

מטרת הניסוי היא לחקור את הפרופיל glycosylation הפרט של 20 גליקופרוטאינים של קרצינומה hepatocellular (HCC) מדגם בסרום החולה באמצעות microarray הנוגדן חסם כימית עם זיהוי lectin. Microarray נוגדנים, המכיל 48 subarrays זהים הכוללים 26 נוגדנים ביוטין-BSA, תוכנן ומיוצר כמתואר STEP 1. אלה היו 26 נוגדנים נגד 20 גליקופרוטאינים בסרום כי המזוהים מבטיחים ערך אבחון מוקדם של חולים HCC באמצעות immunoprecipitation מבוסס lectin בשילוב עם זיהוי המוני חלבון spectrometric ^{12, 32,} כפי שמוצג בטבלה 1. דפוס סידור המקומות נוגדנים מודפסים בשלושה עותקים ב subarray נציג אחד מוצגות באיור 1E ו 1F, בהתאמה. שתי שקופיות microarray זהים, לא היה חסום מבחינה כימית (איור 1 א), ואילו השני היה (איור 1 ב), שימשו לבצע את אותו ניסוי פרופיל glycosylation על מנת להמחיש את חשיבות הליך כימי חסימת לניתוח. עבור השקופית חסם כימית (איור 1 ב), הניסוי התחיל שלב 2: כי לא חסם את השקופית כימית (איור 1 א), הניסוי החל משלב 3. הניסוי בוצע על ידי followinגרם כל השלבים המתוארים בפרוטוקול, למעט שלב 5.1.2 ו 6.1.2. בשלב 5.2, מדגם PBST0.1 השליטה יושם על subarrays בעמודה 1, 3, ו מדגם נקווה סרום HCC היה מוחל על subarrays בעמודה 2 ו -4, בהתאמה (כפי שמוצג באיור 1G). השוואה זו היא להראות את האפקטיביות, היעילות של ההליך, כמו גם את הזיקה אנטיגן המחייב של הנוגדנים לאחר כימית חוסם. 22 biotinylated לקטינים (כפי שניתן לראות בלוח 1) ספציפי כדי glycans שונים ^{18, 20} שהוחלו על כל subarray כפי שמוצג באיור 1G על פרופיל glycosylation. תמונות של (איור 1 א) microarrays חסומים כימית (איור 1 ב) וחסמו הלא כימי לאחר assay glycosylation פרופיל ידי ביצוע הפרוטוקול. כפי שניתן לראות את subarrays בעמודה 1 ו -3 הלא כימית microarrays חסומים (איור 1 א ', איור 1 ג), שבורק PBST0.1 יושמה, רוב לקטינים חייב לתפוס הנוגדנים, והראה רקע גבוהה מאוד דומים לאלה subarrays בעמודה 2 ו - 4, שבו המדגם סרום יושמה. אי אפשר להשיג מידע בפרופיל glycan משקופית זו microarray. נהפוך הוא, כאשר את אותו הניסוי נעשה על שקופית חסם כימית microarray נוגדנים, את subarrays בעמודה 1 ו 3, שבו רק PBST0.1 יושמה, רוב לקטינים הראה איגודי אין או נמוכה מאוד לתפוס נוגדנים, ואילו גבוהה אנטיגן איגודי נצפו עדיין בעמודה 2 ו - 4 ב subarrays, שבו מדגם בסרום יושמה (איור 1 ב 'ו 1D). התוצאה הראתה אלה הליך כימי חסימת היה שלב קריטי לפני מדידת glycans על נוגדנים שנתפסו גליקופרוטאינים. על ידי ביצוע הפרוטוקול, פרופילים glycosylation של 22 גליקופרוטאינים ב HCC בסרום ניתן להשיג.

ניסוי 2

מסך fucos שינוylation על גליקופרוטאינים בסרום ספציפיים כמו סמנים ביולוגיים שחמת הכבד מופלים ו קרצינומה חולים hepatocellular.

מטרת הניסוי הזה היא המסך fucosylation שונה על גליקופרוטאינים בדם סמנים ביולוגיים ספציפיים כמו המפלים שחמת הכבד קרצינומה hepatocellular (HCC) חולים. שונה ניסוי 1, שבו רק דגימה אחת סרום יושם על subarrays כל נחקר עם לקטינים שונים, assay זה, בסך הכל 40 דגימות נסיוב שונים HCC ו שחמת חולים יושמו על subarray כל אחד, נחקר עם lectin 1 (אאל ). ניתוחים סטטיסטיים, כגון T הבדיקה, מקלט פעולה (ROC) עקומת אופייני, נעשה כדי להעריך את הפצות או ביצוע אבחון של epiptope סמן glycan / חלבון על כל אדם בכל דגימות סרום. השתמשנו microarray נוגדנים מיוצרים באותו ניסוי 1 חוץ נגד CA19-9 ואנטי לואיס נוגדנים צילומי במחקר זה. Experiment בוצע מתוך 2 ספטמבר לשלב 9 למעט שלב 5.1.1 ו 6.1.1. סה"כ 40 דגימות נסיוב של שחמת הכבד 20 ו -20 חולים HCC יושמו ב subarray אקראית של 48 subarrays יחד עם דגימות PBS בקרה כביקורת שלילית. Fucosylation של כל החלבונים שנתפסו זוהה לאחר מכן באמצעות lectin biotinylated Fucose ספציפי. התמונה microarray שמוצג באיור 1 הפגינו אאל lectin מחויב רק חלבונים בדם שנתפסו על microarray (איור 2 ד) במקום נוגדנים שנתפסו (2E איור). עוצמות את הקישור אאל של כל הנקודות הוצאו אז, ניתח באמצעות T הבדיקה עקומות ROC כדי להעריך את הביצועים של fucosylation (עוצמת מחייב אאל) של כל חלבון בסרום על אפליה בין HCC וקבוצות שחמת. התוצאות הראו כי fucosylation של חלבון GP73 נתן את האפליה הטובה ביותר בין שתי הקבוצות עם p = 0.03 ו-האזור מתחתהעקומה של עקומת ROC שווה ל 0.72. ניסוי זה הוכיח בהליך זה היא שיטה מהירה, יעילה לסינון glycan epitope / סמן על דוגמאות רבות בתוך חלבונים רבים.

תעודת זהות	שם מגיב	קיצור	חברה	קטלוג #
L1	Concanavalin Biotinylated	ConA	וקטור מעבדות	BK-1000
L2	Lectin Biotinylated Sambucus nigra	SNA	וקטור מעבדות	B-1305
L3	Biotinylated עדשה Culinaris Agglutinin	רע"א	וקטור מעבדות	BK-2000
L4	Biotinylated Ricinus communis Agglutinin אני	RCA	וקטור מעבדות	BK-1000
L5	Lectin Biotinylated Aleuria Aurantia	אאל	וקטור מעבדות	B-1395
L6	Lectin Biotinylated Erythrina Cristagalli	ECL	וקטור מעבדות	BK-3000
L7	Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II	GSL ב '	וקטור מעבדות	BK-3000
L8	Biotinylated נבט חיטה Agglutinin	WGA	וקטור מעבדות	BK-1000
L9	Biotinylated vulgaris Phaseolus Erythroagglutinin	PHA-E	וקטור מעבדות	BK-2000
L10	Biotinylated vulgaris Phaseolus Leucoagglutinin	PHA-L	וקטור מעבדות	BK-2000
L11	ביובוטנים tinylated Agglutinin	הרשות הפלסטינית	וקטור מעבדות	BK-1000
L12	Biotinylated Pisum sativum Agglutinin	PSA	וקטור מעבדות	BK-2000
L13	Biotinylated לבלב Biflorus Agglutinin	DBA	וקטור מעבדות	BK-1000
L14	ב"דאטורה Biotinylated וסטרמוניום Lectin	DSL	וקטור מעבדות	BK-3000
L15	Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin	SJA	וקטור מעבדות	BK-2000
L16	סויה Biotinylated Agglutinin	SBA	וקטור מעבדות	BK-1000
L17	Biotinylated Solanum Tuberosum (תפוחי אדמה) Lectin	STL	וקטור מעבדות	BK-3000
L18	Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin אני	אני GSL	וקטור מעבדות	BK-2000
L19	Lectin Biotinylated בקיה Villosa	VVL	וקטור מעבדות	BK-2000
L20	Biotinylated Lycopersicon Esculentum (עגבניות) Lectin	לל	וקטור מעבדות	BK-3000
L21	Ulex Biotinylated Europaeus Agglutinin אני	אני UEA	וקטור מעבדות	BK-1000
L22	Biotinylated Jacalin	JACALIN	וקטור מעבדות	BK-3000
A1	F עיזים ("א.ב.) 2 נגד אדם IgM שבר, נוגדנים Fc5μ	IgM	ג'קסון חיסונית מחקר	109-006-129
A2	החמור F ('א.ב.) 2Frag נגד אדם IgG (H + L) נוגדן	Ab1	ג'קסון חיסונית מחקר	709-006-149
A3	עכבר נגד אדם IgG ו '("א.ב.) 2 נוגדנים חד שבטיים	AB3	ג'קסון חיסונית מחקר	209-005-097
A4	אנטי אנושי עז אלפא 2 macroglobulin polyclonal נוגדנים	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	הארנב נגד אדם אלפא-1-antitrypsin polyclonal נוגדנים	A1AT	לי Biosiences	CA1T-80A
A6	נגד אדם מאוס Alpha-1-antitrypsin נוגדנים חד שבטיים	A1AT	סיגמא אולדריץ'	SAB4200198
A7	הארנב נגד אדם אלפא-1-antitrypsin polyclonal נוגדנים	מערכה	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	הארנב נגד אדם אלפא-1-מגוחכיםhymotrypsin polyclonal נוגדנים	מערכה	פישר סיינטיפיק	RB9213R7
A9	נגד אדם מאוס transferrin חד שבטי נוגדן	Transferrin	GeneTex	GTX101035
A10	הארנב נגד אדם transferrin polyclonal נוגדנים	Transferrin	GeneTex	GTX77130
A11	אנטי אנושי עז אפוליפופרוטאין J polyclonal נוגדנים	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	נגד אדם מאוס GP73 חד שבטי נוגדן	GP73	אבוט	14H4-23
ת 13	נגד אדם מאוס GP73 חד שבטי נוגדן	GP73	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה INC	SC-101275
A14	הארנב נגד אדם אלפא 1 fetoprotein polyclonal נוגדנים	AFP	GenWay	GWB-41C966
ת 15	נגד אדם מאוס Alpha-1 fetoprotein חד שבטי נוגדן	AFP	פיצג'רלד	10-A05A
A16	נגד אדם מאוס hemopexin חד שבטי נוגדן	Hemopexin	Assaypro	60190-05011
A17	עכבר נגד אדם glypican-3 (1G12) נוגדנים חד שבטיים	GPL3	סנטה קרוז ביו	SC-65443
A18	נגד אדם מאוס Kininogen (LMW) נוגדנים חד שבטיים	Kininogen	Assaypro	20333-05011
A19	הארנב נגד אדם MMP-21 חד שבטי נוגדן	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	נגד אדם מאוס CEACAM-1 נוגדנים חד שבטיים	CEACAM	מחקר ופיתוח מערכות	MAB1180
21	עכברוש נגד האדם נוגדנים חד שבטיים DPPIV/CD26	DPPIV	מחקר ופיתוח מערכות	MAB22441
A22	נגד אדם מאוס PIVKA II נוגדנים חד שבטיים	PIVICA	קריסטל כימית	8040
A23	נגד carcinoembryonic עכבר אנטיגן	CEA	ארה"ב הביולוגי	C1300
A24	עכבר נגד CA125 סרטן Antigen	CA125	ארה"ב הביולוגי	C0050-01D
A25	נגד CA19-9 סרטן עכבר אנטיגן	CA19-9	ארה"ב הביולוגי	C0075-18
A26	נגד לואיס עכבר x חד שבטי נוגדן	לואיס X	Calbiochem	434631
ביו	Biotinylated BSA (בקרה חיובית)	ביו	תוצרת בית	N / A

1. השולחן רשימת לקטינים ונוגדנים שימוש בפרוטוקול זה.

שם / s מגיב ציוד	חברה	מספר קטלוגי
ללא מגע microarrayer	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 microplate	דיג	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray שקופיות	Gentel	PATH
Slide Imprinter (לא חובה)	החברה ג'ל	WSP60-1
מטרף	דיג	15-453-211
סרכזת	Eppendorf	5804 000.013
החלק כביסה אגן / שקופיות תבשיל מכתים Wiה נשלף ארון תקשורת	דיג	08-812
הדגירה שקופיות תא / מיקרוסקופ שקופיות תיבת	דיג	03-448-5
Brij 35, 30 W / V הפתרון% במים	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	דיג	P337-100
נתרן Periodate (NaIO 4)	סיגמא	311448
L-גלוטמית חומצה γ-hydrazide	סיגמא	G-7257
אצטט וסודיום (CH 3 COONa)	סיגמא	S2889
שור סרום אלבומין (BSA)	Lampire ביולוגית Labs	7500804
מאגר מלוחים פוספט (PBS) (10X)	Denville מדעי	CP4390-48
Dylight 549 מצומדות NeutrAvidin	Thermo	22837
מעכבי פרוטאז קוקטייל טבליות	רוש	4693159001
ChromPure האדם IgG, קטע Fc	ג'קסון Immunoresearch	009-000-008
ChromPure לנוגדנים אנושיים, כל מולקולה	ג'קסון Immunoresearch	009-000-003
ChromPure עכבר IgG, כל מולקולה	ג'קסון Immunoresearch	015-000-003
ChromPure עכבר IgG, קטע Fc	ג'קסון Immunoresearch	015-000-008
ChromPure הארנב IgG, כל מולקולה	ג'קסון Immunoresearch	011-000-003
ChromPure חמור IgG, כל מולקולה	ג'קסון Immunoresearch	017-000-003
Microarray סורק	טקאן	LS מחדש

טבלה 2. רשימהשל ציוד ריאגנטים שימוש בפרוטוקול זה.

תוכנית 1 תוכנית המציגה את microarray נוגדנים lectin מבוסס גילוי סמן ביולוגי glycan תהליך 1 (שלב 2 עד 4): בלוק חוסם עם microarray נוגדנים (Glu-hydrazide) ו - BSA, 2 (שלב 5).. להחיל דגימות סרום וללכוד גליקופרוטאינים ספציפיים עם נוגדנים ספציפיים: 3 (שלב 6): להחיל lectin biotinylated (ים): 4 (שלב 7): בדיקה אאל biotinylated עם NeutrAvidin 549 Dylight מיועד לשימוש microarray הדמיה.

באיור 1. Microarray תמונות של פרופיל ניסוי לדוגמא glycosylation 1 של גליקופרוטאינים בסרום מספר במדגם החולה HCC בסרום באמצעות chemicברית חסם microarray נוגדנים עם זיהוי lectin נפוצה. שתי שקופיות microarray זהים, (א) לא חסום מבחינה כימית, או (ב) חסם כימית כמתואר בשלב 2, הן עברו את כל השלבים 2 עד 9 עבור פרופיל glycosylation, כמו גם למטרות השוואה. (א) ו - (ב) הם תמונות microarray סרק א 8 ב רזולוציה של 10 מיקרון. (ג) זום בתמונה של שתי השורות הראשונות של אף חסמו כימית שקופיות microarray (א) (ד) זום בתמונה של שתי השורות הראשונות של השקופית לא microarray חסם כימית (ב)); (ה) תרשים של ההסדר נוגדנים בתוך subarray כל אחד; (F) מפות מערך: מיקומו של נוגדנים בתוך כל subarray, כל שם מייצג נוגדנים 3 נקודות: (ז) מדגם סרום ומיקום lectin: כך עולה דיאגרמות אשר subarray כל מדגם בסרום lectin יושם על.

2. איור microarray תמונותהניסוי מדגם 2 מסך fucosylation שונה על גליקופרוטאינים בדם סמנים ביולוגיים ספציפיים כמו המפלים שחמת הכבד בחולים HCC. Assay microarray בוצע כמתואר בסעיף ניסוי 2 לדוגמא. (א) תמונה שלמה של שקופיות שקופיות microarray משלב 8 (ב) בתרשים ההסדר נוגדנים בתוך subarray זה: (ג) מערך: מפות מיקום של נוגדנים בתוך כל subarray, כל שם מייצג נוגדנים 3 נקודות; (ד) זום בתמונה של subarray שהיו מודגרות עם מדגם בסרום: (ה) זום בתמונה של subarray שהיו מודגרות עם PBS שליטה.

איור 3. תוצאות Glycan אפיון של הניסוי מדגם 1. כל גרף עמודות מייצגים פרופיל מחייב lectin (או פרופילים glycan) של אחד חלבון 20 במבחן. סך הכל 22 לקטינים שונים שימשו לניתוח הדואר glycan פרופיל של כל חלבון.

Discussion

1. היעד חלבון נוגדן הבחירה ללכוד

לפני assay microarray נוגדנים, חומרים כימיים וחומרים מסוימים יש צורך לקחת בחשבון ומוכן. לעצב microarray נוגדנים עבור פרופיל glycan או סמן ביולוגי glycan ההקרנה, פאנל של נוגדנים ספציפיים למועמדים גליקופרוטאין צריך להי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
תעודת זהות	שם מגיב	קיצור	חברה	קטלוג #
L1	Concanavalin Biotinylated	ConA	וקטור מעבדות	BK-1000
L2	Lectin Biotinylated Sambucus nigra	SNA	וקטור מעבדות	B-1305
L3	Biotinylated עדשה Culinaris Agglutinin	רע"א	וקטור מעבדות	BK-2000
L4	Biotinylated Ricinus communis Agglutinin אני	RCA	וקטור מעבדות	BK-1000
L5	Lectin Biotinylated Aleuria Aurantia	אאל	וקטור מעבדות	B-1395
L6	Lectin Biotinylated Erythrina Cristagalli	ECL	וקטור מעבדות	BK-3000
L7	Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II	GSL ב '	וקטור מעבדות	BK-3000
L8	Biotinylated נבט חיטה Agglutinin	WGA	וקטור מעבדות	BK-1000
L9	Biotinylated vulgaris Phaseolus Erythroagglutinin	PHA-E	וקטור מעבדות	BK-2000
L10	Biotinylated vulgaris Phaseolus Leucoagglutinin	PHA-L	וקטור מעבדות	BK-2000
L11	בוטנים Biotinylated Agglutinin	הרשות הפלסטינית	וקטור מעבדות	BK-1000
L12	Biotinylated Pisum sativum Agglutinin	PSA	וקטור מעבדות	BK-2000
L13	Biotinylated לבלב Biflorus Agglutinin	DBA	וקטור מעבדות	BK-1000
L14	ב"דאטורה Biotinylated וסטרמוניום Lectin	DSL	וקטור מעבדות	BK-3000
L15	Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin	SJA	וקטור מעבדות	BK-2000
L16	סויה Biotinylated Agglutinin	SBA	וקטור מעבדות	BK-1000
L17	Biotinylated Solanum Tuberosum (תפוחי אדמה) Lectin	STL	וקטור מעבדות	BK-3000
L18	Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin אני	אני GSL	וקטור מעבדות	BK-2000
L19	Lectin Biotinylated בקיה Villosa	VVL	וקטור מעבדות	BK-2000
L20	Biotinylated Lycopersicon Esculentum (עגבניות) Lectin	לל	וקטור מעבדות	BK-3000
L21	Ulex Biotinylated Europaeus Agglutinin אני	אני UEA	וקטור מעבדות	BK-1000
L22	Biotinylated Jacalin	JACALIN	וקטור מעבדות	BK-3000
A1	F עיזים ("א.ב.) 2 נגד אדם IgM שבר, נוגדנים Fc5μ	IgM	ג'קסון חיסונית מחקר	109-006-129
A2	החמור F ('א.ב.) 2 Frag נגד אדם IgG (H + L)tibody	Ab1	ג'קסון חיסונית מחקר	709-006-149
A3	עכבר נגד אדם IgG ו '("א.ב.) 2 נוגדנים חד שבטיים	AB3	ג'קסון חיסונית מחקר	209-005-097
A4	אנטי אנושי עז אלפא 2 macroglobulin polyclonal נוגדנים	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	הארנב נגד אדם אלפא-1-antitrypsin polyclonal נוגדנים	A1AT	לי Biosiences	CA1T-80A
A6	נגד אדם מאוס Alpha-1-antitrypsin נוגדנים חד שבטיים	A1AT	סיגמא אולדריץ'	SAB4200198
A7	הארנב נגד אדם אלפא-1-antitrypsin polyclonal נוגדנים	מערכה	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	הארנב נגד אדםAlpha-1-antichymotrypsin polyclonal נוגדנים	מערכה	פישר סיינטיפיק	RB9213R7
A9	נגד אדם מאוס transferrin חד שבטי נוגדן	Transferrin	GeneTex	GTX101035
A10	הארנב נגד אדם transferrin polyclonal נוגדנים	Transferrin	GeneTex	GTX77130
A11	אנטי אנושי עז אפוליפופרוטאין J polyclonal נוגדנים	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	נגד אדם מאוס GP73 חד שבטי נוגדן	GP73	אבוט	14H4-23
ת 13	נגד אדם מאוס GP73 חד שבטי נוגדן	GP73	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה INC	SC-101275
A14	הארנב נגד אדם אלפא 1 fetoprotein polyclonal נוגדנים	AFP	GenWay	GWB-41C966
ת 15	נגד אדם מאוס Alpha-1 fetoprotein חד שבטי נוגדן	AFP	פיצג'רלד	10-A05A
A16	נגד אדם מאוס hemopexin חד שבטי נוגדן	Hemopexin	Assaypro	60190-05011
A17	עכבר נגד אדם glypican-3 (1G12) נוגדנים חד שבטיים	GPL3	סנטה קרוז ביו	SC-65443
A18	נגד אדם מאוס Kininogen (LMW) נוגדנים חד שבטיים	Kininogen	Assaypro	20333-05011
A19	הארנב נגד אדם MMP-21 חד שבטי נוגדן	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	נגד אדם מאוס CEACAM-1 חד שבטי antibody	CEACAM	מחקר ופיתוח מערכות	MAB1180
A21	עכברוש נגד האדם נוגדנים חד שבטיים DPPIV/CD26	DPPIV	מחקר ופיתוח מערכות	MAB22441
A22	נגד אדם מאוס PIVKA II נוגדנים חד שבטיים	PIVICA	קריסטל כימית	8040
A23	נגד carcinoembryonic עכבר אנטיגן	CEA	ארה"ב הביולוגי	C1300
A24	עכבר נגד CA125 סרטן Antigen	CA125	ארה"ב הביולוגי	C0050-01D
A25	נגד CA19-9 סרטן עכבר אנטיגן	CA19-9	ארה"ב הביולוגי	C0075-18
A26	נגד לואיס עכבר x חד שבטי נוגדן	לואיס X	Calbiochem	434631
ביו	Biotinylated BSA (בקרה חיובית)	ביו	תוצרת בית	N / A

שם / s מגיב ציוד	חברה	מספר קטלוגי
ללא מגע microarrayer	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 microplate	דיג	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray שקופיות	Gentel	PATH
Slide Imprinter (לא חובה)	החברה ג'ל	WSP60-1
מטרף	דיג	15-453-211
סרכזת	Eppendorf	5804 000.013
כביסה שקופיות אגן / שקופיות מכתים מהודרת עם מתלה נשלף	דיג	08-812
הדגירה שקופיות תא / מיקרוסקופ שקופיות תיבת	דיג	03-448-5
Brij 35, 30 W / V הפתרון% במים	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	דיג	P337-100
נתרן Periodate (NaIO 4)	סיגמא	311448
L-גלוטמית חומצה γ-hydrazide	סיגמא	G-7257
אצטט וסודיום (CH 3 COONa)	סיגמא	S2889
שור סרום אלבומין (BSA)	Lampire ביולוגית Labs	7500804
מאגר מלוחים פוספט (PBS) (10X)	Denville מדעי	CP4390-48
Dylight 549 מצומדות NeutrAvidin	Thermo	22837
מעכבי פרוטאז קוקטייל טבליות	רוש	4693159001
ChromPure האדם IgG, קטע Fc	ג'קסון Immunoresearch	009-000-008
ChromPure לנוגדנים אנושיים, כל מולקולה	ג'קסון Immunoresearch	009-000-003
ChromPure עכבר IgG, כל מולקולה	ג'קסון Immunoresearch	015-000-003
ChromPure עכבר IgG, קטע Fc	ג'קסון Immunoresearch	015-000-008
ChromPure הארנב IgG, כל מולקולה	ג'קסון Immunoresearch	011-000-003
ChromPure חמור IgG, כל מולקולה	ג'קסון Immunoresearch	017-000-003
Microarray סורק	טקאן	LS מחדש