Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Özet

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Özet

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.

Introduction

Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes^1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases ^7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of α-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma ^13-15, and CA199 for pancreatic cancer ^{16, 17} are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample ¹⁸. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO₄ in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample ^18-20. This method has been used successfully in multiple different labs ^{1, 7, 13, 19-31}. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

Protokol

1. Test için bir antikor Mikroarray yazdırmak

1. 0.5 mg / fosfat tampon salin, ph 7.2 (PBS) içinde ml tüm antikorları ile seyreltilir.
2. 384 kuyucuklu kaynak plakasına alikotu her antikor 40 ul.
3. Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer üzerine 384-iyi kaynak plaka yükleyin.
4. Hedef olarak microarrayer üzerine 20 PATH mikroarray slaytlar yükleyin.
5. 27 antikorları ve kontrol proteinler 9x9 modeli (Şekil 1E, 1F) olarak üç nüsha olarak tespit edildiği 48 özdeş Altdizilim, yazdırmak için microarrayer ayarlayın.
6. Antikor mikroarray slaytları yazdırmak için microarrayer başlayın.
7. Antikor mikroarray slaytlar toplayın ve kurutucu ile slaytlar kaset saklayın. Vakum kesme (Foodsaver) kullanarak plastik bir torbaya kaset mühür temizleyin.
8. 4 ° C'de buzdolabında kapalı mikroarray slaytlar saklayın.

2. Kimyasal GBP Önlemek için Antikor Mikroarray engelleYakalama Antikorlar bağlanarak

Mikroarray testi mikroarray slaytlar kimyasal engellenen bir kez başlar ve yaklaşık 8 saat sürer. Bir kez mikroarray assay tamamlanması için olan açtığı (Basamak 2-8).

1. Mikroarray buzdolabı kayarak atın ve 30 dakika oda sıcaklığında onları dengeye.
2. % 0.1 Tween (CBT0 ile 15 mM sodyum asetat tamponu pH 5.0, sonra saklama kutusundan slayt çıkarın ve kısaca havzası yıkama slayt kez% 0.1 Tween 20 (PBST0.1) ile fosfat buffer salin pH 7.2 bunları temizleyin, durulayın ve .1) sıralı bir şekilde. Slayt yıkama havzasında 10 dakika CBT0.1 slaytları inkübe edin.
3. 15 mM sodyum asetat tamponu pH 5.0 (CB) taze 150 mM NaIO ₄ hazırlayın ve kullanılmadan önce hafif kaçınarak buzdolabında lavabo çamaşır slayt halinde saklayın.
4. CB slayt çıkarın ve antikor yan taze NaIO ₄ içeren havza içine koyduyukarı bakacak. Işık önlemek ve nazik bir buzdolabında 4 ° C'de çalkalanarak 2 saat slayt havza inkübe için alüminyum folyo ile havza örtün.
5. CB'de 10 mM hidrazit glutamik asit (engelleyici), 300 mL hazırlayın.
6. Havzasından slayt çıkarın ve kısaca 3 kez 5 dakika slayt yıkama havzasında her zaman için CB durulayınız.
7. Nazik bir çalkalama ile oda sıcaklığında 2 saat için bir çamaşır havzasında bloker slaytları inkübe.
8. Havzasından slaytlar çıkarın ve 3 dakika PBST0.1 ile yıkayın.

3. Bovine Serum Albumin ile Mikroarray özgü olmayan Bağlar engelleme (BSA)

1. Slayt çamaşır havzasında% 0.5 Tween (PBST0.5) ile fosfat tampon tuzlu pH 7,2% 1 BSA 300 ml hazırlayın ve hafifçe sallayarak oda sıcaklığında 1 saat havzasında mikroarray slayt inkübe.
2. 3 dakika için her seferinde üç kez PBST0.1 slaytları çalkalayın.
3. Slayt koyunmikroarray slayt kuruması için 2 dakika santrifüj üzerine 1200 xg'de bir slayt raf ve dönüşlerde.

4. Her altdizilim ayırın için Mikroarray Slayt üzerine Künye Wax Izgara

1. 70 de balmumu imprinter ön-ısıtma 5 dakika boyunca ° C.
2. Balmumu bakan antikor yüzü balmumu imprinter içine bloke mikroarray slayt yükleyin. Yavaşça eşit slayt üzerine künye balmumu kolu çekin.

5.. Mikroarray Slayt üzerine Serum Örnekleri Uygula

1. Adım 2.4 sırasında birden fazla numune (5.1.2) arasında bir örnekte gliko profilleme assay (5.1.1), veya tek gliko epiptope ölçümü ya da serum numuneleri hazırlamak.
   1. Birden fazla Gbps (Örnek Deney 1 bakınız) kullanılarak bir serum numunesi içinde birden çok serum glikoproteinleri glukanıdır profilings için bir deneyde, bir serum numuneleri, tüm Altdizilim üzerine tatbik edilir. Bu durumda, 40 ul serumu içeren geniş bir 0.1% 360 ul PBS içinde seyreltilirTween-20,% 0.1 Brij 35, 100 ug / fare IgG, 100 ug / sıçan IgG mL, 100 ug / tavşan IgG, 100 ug / mL keçi IgG ve 100 ug / ml eşek IgG mL mL. Bu birim her altdizilim üzerine sulandırılmış serum solüsyonu 6 ul uygulanması için yeterlidir.
   2. Bir GBP tespitlerde (örnek deney 2) kullanarak birden serum örnekleri arasında birden fazla serum protein bir glukanıdır ölçümü için bir deneyde. Bu durumda, 1 ul PBS serum yeterli içeren% 0.1 arasında 9 ul içinde seyreltilir Tween-20,% 0.1 Brij 35, fare IgG, 100 ug / sıçan IgG mL, 100 ug / tavşan IgG mL 100 ug / ml , 100 ug / keçi IgG ve 100 ug / eşek IgG mL mL. Bu birim her altdizilim üzerine sulandırılmış serum solüsyonu 6 uL uygulanması için yeterlidir.
2. Adım 4 balmumu atama, dikkatli bir slayt her altdizilim seyreltilmiş numuneye veya kontrol örneklerinin 6 uL (PBST0.1) uyguladıktan sonra. Oda sıcaklığında ıslak kağıt havlu ile nemlendirilmiş bir kaset slayt inkübe1 saat karıştırıldı.
3. 3 dakika için her seferinde üç kez PBST0.1 ile kayar çalkalayın.
4. 2 dakika için 1200 xg'de dönerken tarafından slayt kurulayın.

6. Slayt üzerine tinile YTL (lektin veya Anti-glikan Antikor) uygulayın

1. Adım 2.4 sırasında, PBST0.1 yılında biyotinile lektinler / Gbps 10μg/ml hazırlamak.
   1. Glukanıdır profilleme deneyde birden lektinler ile prob bir örnek (numune deney 1), tüm Altdizilim için yeterlidir biyotinile lektin 350 uL hazırlamak olduğunu.
   2. Birden lektinler kullanarak birden çok örneklerinde tek glukanıdır epitop / biyomarker tarama, bir altdizilim için yeterli olduğunu, her biyotinile lektin 10 ul hazırlamak.
2. Sürgünün her altdizilim ile seyreltilmiş biyotinile lektin (ler) in 6 uL uygulamak ve 1 saat için oda sıcaklığında ıslak kağıt havlu ile nemlendirilmiş kayar kutusuna inkübe edilir.
3. 3 dakika her ti için PBST0.1 üç kez slaytlar durulayınbana.
4. 2 dakika santrifüj 1200 xg'de dönerken tarafından slayt kurulayın.

7. Floresan Algılama için Boya Etiketli NeutrAvidin Uygula

1. Tüm Altdizilim için yeterlidir Dylight 549 etiketli NeutrAvidin 350 uL hazırlayın.
2. Her altdizilim üzerine Dylight 549 etiketli NeutrAvidin 6 uL uygulamak ve 1 saat için oda sıcaklığında nemlendirilmiş kayar kaset kayar inkübe edilir.
3. 3 dakika için her seferinde üç kez PBST0.1 ile kayar çalkalayın.
4. 2 dakika santrifüj 1200 xg'de dönerken tarafından slayt kurulayın.

8. Slayt Tarama tarafından Mikroarray Slayt Resim edinin

1. 10 mikron çözünürlükte bir floresan mikroarray tarayıcı kullanarak slayt tarayın. Lazer ve PMT ayarları mümkün olduğu kadar kuvvetli olması gerekir, ancak hiçbir yerinde doygunluk görülmektedir.

9. Veri çıkarımı ve Analiz

1. ArrayPro 3.2 resim açın.
2. Antikor noktalar konumları gösteriyor dizi haritaya göre dizi şablon ayarlama. Dikkatlice görüntüsünde karşılık gelen nokta üzerine her şablon daire hizalayın.
3. Daha fazla analiz için bir Excel dosyası içine her yerinde şiddeti ayıklayın.

10. Temsilcisi Sonuçlar

Örnek Deney 1

Birden fazla lektinler algılama ile kimyasal bloke antikor mikroarray kullanarak hepatosellüler karsinom hasta serum örneğinde birden fazla serum glikoproteinleri glikozilasyonu profilleme.

Bu denemenin amacı, lektin algılama ile kimyasal olarak bloke antikor mikroarray ile hepatoselüler karsinom (HCC) hasta serum örneğinde 20 glikoproteinler bireysel glikozilasyon profilini ortaya koymaktır. S açıklandığı gibi 26 antikor ve biyotin-BSA dahil 48 özdeş Altdizilim içeren bir antikor mikroarray, tasarlanmış ve imal edildi1 Tep. Bunlar, 26 antikorları Tablo 1 'de gösterildiği gibi kütle spektrometrik proteini tanımlama ^{12, 32} ile birleştirilmiş lektin bazlı immünopresipitasyon kullanılarak HCC hastalar için erken teşhis değeri sözü olarak tanımlanan 20 serum glikoproteinleri karşı edildi. Bir temsilci alt dizisinde üç nüsha basılmış antikor lekelerin desen ve düzenleme sırasıyla Şekil 1E ve 1F gösterilmiştir. Diğer bir (Şekil 1B), analiz için kimyasal olarak bloke prosedürü önemini göstermek için aynı glikozilasyon profil deneyi yürütmek için kullanılan iken iki özdeş mikroarray kaydırak, bir kimyasal olarak, (Şekil 1A) bloke değildi. Kimyasal olarak bloke slayt (Şekil 1B) için, deneme Adım 2 başlayan; hiçbiri kimyasal bloke slayt (Şekil 1A) için, deney Adım 3 başladı. Deney followin tarafından gerçekleştirilmiştirg Adım 5.1.2 ve 6.1.2 dışında protokolü açıklanan tüm adımları. Basamak 5.2 'de, bir PBST0.1 kontrol örneği kolon 1 ve 3'te Altdizilim üzerine tatbik edildi ve bir havuza HCC serum numunesi (Şekil 1 G gösterildiği) sütunu 2 ve 4, sırasıyla, in Altdizilim üzerine uygulandı. Bu karşılaştırma kimyasal olarak engelleme etkinliği sonra, işlem verimi yanı sıra antikor antijen bağlanma afiniteleri göstermektir. Glikozilasyon profil için Şekil 1 G 'de gösterildiği gibi, farklı glukanlardır ^{18, 20} özgü her altdizilim üzerine tatbik edildi olduğu 22 biyotinile lektinler (Tablo 1 içinde gösterildiği gibi). Protokolü izleyerek glikozilasyon profil testi sonra kimyasal olarak bloke (Şekil 1B) ve non-kimyasal olarak bloke (Şekil 1A) microarrays Görüntüler. Gibi non-kimyasal olarak bloke mikroarray'ler (Şekil 1A ve Şekil 1C), sütun 1 ve 3'te gösterilen Altdizilim hangiSadece PBST0.1 en lektinler antikorlar yakalamak için bağlı, uygulanır ve serum numunesi başvurusu yapılan sütun 2 ve 4, olanlar Altdizilim bu karşılaştırılabilir çok yüksek arka gösterdi. Bu mikroarray slayttan glukanıdır profil bilgileri elde etmek mümkün değildir. Tam tersine, aynı deney, bir kimyasal olarak bloke antikoru mikroarray kayar üzerinde yapıldı olduğunda, kolon 1 ve sadece PBST0.1 uygulanmıştır hangi 3, in Altdizilim, en lektinler antikorlar yakalamak için hiç ya da çok düşük bağları gösterdi; süre yüksek antijen bağları hala serum örneği (Şekil 1B ve 1D) uygulanan yapıldığı, sütun 2 ve 4 Altdizilim gözlendi. Bu sonuç, kimyasal olarak bloke prosedürü antikoru-tutsak glikoproteinleri üzerine glukanlardır ölçümü öne kritik bir adım olduğunu gösterdi. Protokolü takip edilerek, HCC serum 22 glikoproteinlerinin glikozilasyon profilleri elde edilebilir.

Deney 2

Değişmiş fucos için ekranayrımcılık siroz ve karaciğer kanseri hastalara biyolojik olarak spesifik serum glikoproteinler üzerine ylation.

Bu denemenin amacı, karaciğer sirozu ve hepatoselüler karsinom (HCC) hasta ayrımcılık biyolojik olarak spesifik serum glikoproteinler üzerine değişmiş fucosylation için ekran etmektir. Bu testte sadece bir serum örneği her Altdizilim üzerine uygulanır ve çeşitli lektinler ile probed edildiği Deney 1,,, HCC ve siroz hastalarının toplam 40 farklı serum örneklerinde farklı her altdizilim üzerine uygulanır ve bir lektin (AAL ile probed edildi ). Böyle T testi, alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrisi gibi istatistiksel analiz, dağılımları veya tüm serum örneklerinde her protein glukanıdır epiptope / biyomarker tanısal performansını değerlendirmek amacıyla yapıldı. Bu çalışmada, anti-CA19-9 ve anti-Lewis X antikorları dışında Deney 1 imal aynı antikoru mikroarray kullanılır. Experiment Adım 5.1.1 ve 6.1.1 dışında Adım 9 Eylül 2 den gerçekleştirildi. Toplam 20 siroz 40 serum numuneleri ve 20 HCC hastaları negatif kontrol olarak kontrol PBS örnekleri ile birlikte 48 Altdizilim rastgele altdizilim de uygulanmıştır. Her yakalanan proteinlerin Fucosylation sonra biyotinile fucose spesifik lektin kullanılarak tespit edildi. Şekil 1 de gösterildiği mikroarray görüntü yerine yalnızca yakalanan antikorların mikroarray (Şekil 2B) (Şekil 2E) üzerinde yakalandı serum proteinlerine lektin AAL göstermiştir. Tüm lekelerin AAL bağlayıcı şiddetleri sonra ayıklanır ve HCC ve siroz gruplar arasında ayrımcılık her serum protein fucosylation (AAL bağlayıcı yoğunluğu) performansını değerlendirmek için T testi ve ROC eğrileri kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar GP73 protein fucosylation bir p = 0.03 iki grup ayrımını en iyi veren ve alan-under-gösterdiROC eğrisi eğrisi 0.72 eşittir. Bu deney, bu prosedür çoklu proteinlerden içinde birden çok örnekleri üzerinde glukanıdır epitop / biyomarker tarama için hızlı, etkili bir yöntemdir gösterdi.

Kimlik	Reaktif Adı	Kısaltma	Şirket	# Kataloğa
L1	Biyotinile Concanavalin A	ConA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L2	Tinile Sambucus Nigra Lektin	SNA	Vektör Laboratuvarları	B-1305
L3	Tinile Lens Culinaris Aglütinin	LCA	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L4	Ricinus Communis Aglütinin Ben biyotinile	RCA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L5	Tinile Aleuria Aurantia Lektin	AAL	Vektör Laboratuvarları	B-1395
L6	Tinile Erythrina Cristagalli Lektin	ECL	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L7	Tinile Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lektin II	GSL II	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L8	Tinile buğday tohumu Aglütinin	WGA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L9	Tinile Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin	PHA-E	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L10	Tinile Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin	PHA-L	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L11	Biotinylated Fıstık Aglütinin	PNA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L12	Pisum Sativum Aglütinin biyotinile	PSA	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L13	Tinile Dolichos tohumları biflorus Aglütinin	DBA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L14	Tinile Datura stramonium Lektin	DSL	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L15	Tinile Sophora Japonica Aglütinin	SJA	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L16	Tinile Soya Aglütinin	SBA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L17	Tinile Solanum Tuberosum (Patates) Lektin	STL	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L18	Tinile Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lektin I	GSL I	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L19	Tinile Vicia villosa Lektin	VVL	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L20	Tinile Lycopersicon esculentum (Domates) Lektin	LEL	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L21	Tinile Ulex europaeus Aglütinin I	UEA I	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L22	Biyotinile Jacalin	JACALIN	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
A1	Keçi F (ab ') 2 Fragment anti-insan IgG, Fc5μ antikoru	IgM	Jackson Immuno Araştırma	109-006-129
A2	Eşek F (ab ') 2Frag anti-insan IgG (H + L) antikoru	AB1	Jackson Immuno Araştırma	709-006-149
A3	Fare anti-insan IgG F (ab ') 2 monoklonal antikor	AB3	Jackson Immuno Araştırma	209-005-097
A4	Keçi anti-insan alfa 2 makroglobulin poliklonal antikor	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	Tavşan anti-insan alfa-1-antitripsin poliklonal antikor	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Fare anti-insan alfa-1-antitripsin monoklonal antikor	A1AT	Sigma Aldrich	SAB4200198
A7	Tavşan anti-insan alfa-1-antitripsin poliklonal antikor	ACT	Boyandı	RB-367-A1
A8	Tavşan anti-insan alfa-1-antikhymotrypsin poliklonal antikor	ACT	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Fare anti-insan transferin monoklonal antikor	Transferrin	GeneTex	GTX101035
A10	Tavşan anti-insan transferin poliklonal antikor	Transferrin	GeneTex	GTX77130
A11	Keçi anti-insan apolipoprotein J poliklonal antikor	APOJ	Abcam	ab7610
A12	Fare anti-insan GP73 monoklonal antikor	GP73	Abbott	14H4-23
A13	Fare anti-insan GP73 monoklonal antikor	GP73	SANTA CRUZ BİYOTEKNOLOJİ A.Ş.	sc-101.275
A14	Tavşan anti-insan alfa-1 fetoprotein poliklonal antikor	AFP	GenWay	GWB-41C966
A15	Fare anti-insan alfa-1 fetoprotein monoklonal antikor	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Fare anti-insan hemopexin monoklonal antikor	Hemopexin	Assaypro	60190-05011
A17	Fare anti-insan glypican-3 (1G12) monoklonal antikor	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65.443
A18	Fare anti-insan Kininogen (LMW) monoklonal antikor	Kininogen	Assaypro	20333-05011
A19	Tavşan anti-insan MMP-21 monoklonal antikor	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Fare anti-insan CEACAM-1 monoklonal antikor	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
A21	Sıçan anti-insan DPPIV/CD26 monoklonal antikor	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Fare anti-insan PIVKA II monoklonal antikor	PIVICA	Kristal chem	8040
A23	Fare anti-karsinoembriyonik antijen	CEA	ABD biyolojik	C1300
A24	Fare anti-CA125 Kanser Antijen	CA125	ABD biyolojik	C0050-01D
A25	Fare anti-CA19-9 Cancer antijeni	CA19-9	ABD biyolojik	C0075-18
A26	Fare anti-Lewis x monoklonal antikor	Lewis X	Calbiochem	434631
bio	Tinile BSA (pozitif kontrol)	Bio	Ev yapımı	N / A

Bu protokolde kullanılan lektinler ve antikorların Tablo 1. Listesi.

Reaktif s / ekipmanları Adı	Şirket	Katalog numarası
Temassız microarrayer	BioDot A.Ş.	sciFLEXARRAYER
384 mikroplaka	Balıkçı	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrathin nitroselüloz coate mikroarray slaytlar	Gentel	PATH
Slayt Damgalayıcı (isteğe bağlı)	Jel Şirket	WSP60-1
Shaker	Balıkçı	15-453-211
Santrifüj	Eppendorf	5804 000.013
Havza / Slayt Boyama Bulaşık yıkama wi kaydırınth Çıkarılabilir Raf	Balıkçı	08-812
Slayt inkübasyon odası / mikroskop lamı kutusu	Balıkçı	03-448-5
Brij 35, su içinde 30 w / v% çözelti	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Balıkçı	P337-100
Sodyum periodat (NaIO 4)	Sigma	311448
L-glutamik asit γ-hidrazit	Sigma	G-7257
Sodyum Asetat Susuz (CH 3 COONa)	Sigma	S2889
Bovine Serum Albumin (BSA)	Lampire Biyolojik Labs	7500804
Fosfat Tampon Salin (PBS) (10X)	Denville Bilimsel	CP4390-48
Dylight 549 konjuge NeutrAvidin	Thermo	22837
Proteaz İnhibitör Kokteyl Tabletler	Roche	4693159001
ChromPure İnsan IgG, Fc parçası	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure İnsan IgG, tüm molekül	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure Fare IgG, tüm molekül	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure Fare IgG, Fc parçası	Jackson Immunoresearch	015-000-008
Tavşan ChromPure IgG, tüm molekül	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure Donkey IgG, tüm molekül	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Mikroarray Tarayıcı	Tecan	LS Reloaded

Tablo 2. ListesiBu protokolde kullanılan ekipman ve reaktiflerin.

Şema 1 glukanıdır biyomarker bulma işlemi 1 (Adım 2 ila 4) dayalı lektin antikor mikroarray gösteren bir şema: bloker (Glu-hidrazit) ve BSA ile antikor mikroarray engelleyin; 2 (Adım 5):.. Serum örnekleri uygulamak ve yakalamak spesifik antikorların spesifik glikoproteinler; 3 (Adım 6):;: Probe mikroarray görüntüleme için Dylight 549 etiketli NeutrAvidin ile biyotinile AAL. 4 (Adım 7) biyotinile lektin (ler) geçerli

Chemic kullanarak HCC hasta serum örneğinde birden fazla serum glikoproteinleri Örnek Deney 1 glikozilasyon profil Şekil 1. Mikroarray görüntülerimüttefiki birden lektin algılama ile antikor mikroarray engelledi. Iki özdeş mikroarray kaydırak, (A) hiçbir kimyasal olarak bloke veya (B), kimyasal olarak bloke Adım 2'de açıklandığı gibi, her ikisi de, tüm glikozilasyon profil için 2 ile 9 arası adımları, aynı zamanda karşılaştırma amaçlı geçti. (A) ve (B) mikroarray görüntüleri 10 mikron çözünürlükte Adım 8 de taranır. Olmayan kimyasal olarak bloke mikroarray slayt (B)) ilk iki satır görüntüde (D) zoom;; (C) hiçbiri ilk iki satır görüntü yakınlaştırma kimyasal mikroarray slayt (A) bloke (E) Her dizenin içinde antikor düzenlemenin şeması; (F) dizi haritaları: altdizilim içindeki her antikor konumu, her antikor adı 3 noktalar temsil eder; (G) serum örneği ve lektin yeri: Her serum örneği altdizilim bir diyagram gösterileri yapan ve lektin üzerine uygulandı.

Şekil 2. Mikroarray görüntülerisiroz ve HCC hastaları ayrımcılık olduğu biyolojik olarak spesifik serum glikoproteinler üzerine değişmiş fucosylation için numune deney 2 ekran. Örnek Deney 2 bölümünde tarif edildiği gibi mikroarray deneyi yapılmıştır. (A) Aşama 8 den mikroarray sürgünün bütün kayar görüntüsü; her altdizilim içinde antikoru düzenlemenin (B) diyagramıdır; (C) dizi haritalarına: altdizilim içindeki her bir antikor konumu, her bir antikor adı 3 lekeler temsil eder; (D) Bir zoom-serum örneği ile inkübe edildi, bir dizenin görüntü; (E) bir zoom-in PBS kontrolü ile inkübe edilmiş bir dizenin görüntü.

Şekil 3. Örnek deney 1 glukanıdır profil sonuçları. Her çubuk grafik 20 test edilen proteinin birinin lektin bağlanma profili (veya profilleri glukanıdır) temsil eder. Toplam 22 farklı lektinler inci analiz edildiHer protein e glukanıdır profili.

Tartışmalar

1. Hedef protein ve yakalama antikor seçimi

Antikor mikroarray assay önce belli bir reaktifler ve malzemeler sayılabilir için gerekli ve hazırlanır. Glukanıdır profilleme veya glukanıdır biyomarker tarama, glikoprotein adaylara spesifik antikorların bir panel için bir antikor mikroarray tasarlamak için literatüre veya önceki sonuçlarından göre tespit edilmelidir. Bu antikorlar, genellikle, R & D Systems, vb IgGs gibi farklı satıcılardan satın alınmıştır önceki tes...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kimlik	Reaktif Adı	Kısaltma	Şirket	# Kataloğa
L1	Biyotinile Concanavalin A	ConA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L2	Tinile Sambucus Nigra Lektin	SNA	Vektör Laboratuvarları	B-1305
L3	Tinile Lens Culinaris Aglütinin	LCA	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L4	Ricinus Communis Aglütinin Ben biyotinile	RCA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L5	Tinile Aleuria Aurantia Lektin	AAL	Vektör Laboratuvarları	B-1395
L6	Tinile Erythrina Cristagalli Lektin	ECL	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L7	Tinile Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lektin II	GSL II	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L8	Tinile buğday tohumu Aglütinin	WGA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L9	Tinile Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin	PHA-E	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L10	Tinile Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin	PHA-L	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L11	Tinile Fıstık Aglütinin	PNA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L12	Pisum Sativum Aglütinin biyotinile	PSA	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L13	Tinile Dolichos tohumları biflorus Aglütinin	DBA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L14	Tinile Datura stramonium Lektin	DSL	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L15	Tinile Sophora Japonica Aglütinin	SJA	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L16	Tinile Soya Aglütinin	SBA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L17	Tinile Solanum Tuberosum (Patates) Lektin	STL	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L18	Tinile Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lektin I	GSL I	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L19	Tinile Vicia villosa Lektin	VVL	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L20	Tinile Lycopersicon esculentum (Domates) Lektin	LEL	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L21	Tinile Ulex europaeus Aglütinin I	UEA I	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L22	Biyotinile Jacalin	JACALIN	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
A1	Keçi F (ab ') 2 Fragment anti-insan IgG, Fc5μ antikoru	IgM	Jackson Immuno Araştırma	109-006-129
A2	Eşek F (ab ') 2 Frag anti-insan IgG (H + L) birtibody	AB1	Jackson Immuno Araştırma	709-006-149
A3	Fare anti-insan IgG F (ab ') 2 monoklonal antikor	AB3	Jackson Immuno Araştırma	209-005-097
A4	Keçi anti-insan alfa 2 makroglobulin poliklonal antikor	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	Tavşan anti-insan alfa-1-antitripsin poliklonal antikor	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Fare anti-insan alfa-1-antitripsin monoklonal antikor	A1AT	Sigma Aldrich	SAB4200198
A7	Tavşan anti-insan alfa-1-antitripsin poliklonal antikor	ACT	Boyandı	RB-367-A1
A8	Tavşan anti-insanalfa-1-antichymotrypsin poliklonal antikor	ACT	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Fare anti-insan transferin monoklonal antikor	Transferrin	GeneTex	GTX101035
A10	Tavşan anti-insan transferin poliklonal antikor	Transferrin	GeneTex	GTX77130
A11	Keçi anti-insan apolipoprotein J poliklonal antikor	APOJ	Abcam	ab7610
A12	Fare anti-insan GP73 monoklonal antikor	GP73	Abbott	14H4-23
A13	Fare anti-insan GP73 monoklonal antikor	GP73	SANTA CRUZ BİYOTEKNOLOJİ A.Ş.	sc-101.275
A14	Tavşan anti-insan alfa-1 fetoprotein poliklonal antikor	AFP	GenWay	GWB-41C966
A15	Fare anti-insan alfa-1 fetoprotein monoklonal antikor	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Fare anti-insan hemopexin monoklonal antikor	Hemopexin	Assaypro	60190-05011
A17	Fare anti-insan glypican-3 (1G12) monoklonal antikor	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65.443
A18	Fare anti-insan Kininogen (LMW) monoklonal antikor	Kininogen	Assaypro	20333-05011
A19	Tavşan anti-insan MMP-21 monoklonal antikor	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Fare anti-insan CEACAM-1 monoklonal antikorlarınıny	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
A21	Sıçan anti-insan DPPIV/CD26 monoklonal antikor	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Fare anti-insan PIVKA II monoklonal antikor	PIVICA	Kristal chem	8040
A23	Fare anti-karsinoembriyonik antijen	CEA	ABD biyolojik	C1300
A24	Fare anti-CA125 Kanser Antijen	CA125	ABD biyolojik	C0050-01D
A25	Fare anti-CA19-9 Cancer antijeni	CA19-9	ABD biyolojik	C0075-18
A26	Fare anti-Lewis x monoklonal antikor	Lewis X	Calbiochem	434631
bio	Tinile BSA (pozitif kontrol)	Bio	Ev yapımı	N / A

Reaktif s / ekipmanları Adı	Şirket	Katalog numarası
Temassız microarrayer	BioDot A.Ş.	sciFLEXARRAYER
384 mikroplaka	Balıkçı	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrathin nitroselüloz coate mikroarray slaytlar	Gentel	PATH
Slayt Damgalayıcı (isteğe bağlı)	Jel Şirket	WSP60-1
Shaker	Balıkçı	15-453-211
Santrifüj	Eppendorf	5804 000.013
Çıkarılabilir Rack ile Slayt yıkama lavabo / Slayt Boyama Bulaşık	Balıkçı	08-812
Slayt inkübasyon odası / mikroskop lamı kutusu	Balıkçı	03-448-5
Brij 35, su içinde 30 w / v% çözelti	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Balıkçı	P337-100
Sodyum periodat (NaIO 4)	Sigma	311448
L-glutamik asit γ-hidrazit	Sigma	G-7257
Sodyum Asetat Susuz (CH 3 COONa)	Sigma	S2889
Bovine Serum Albumin (BSA)	Lampire Biyolojik Labs	7500804
Fosfat Tampon Salin (PBS) (10X)	Denville Bilimsel	CP4390-48
Dylight 549 konjuge NeutrAvidin	Thermo	22837
Proteaz İnhibitör Kokteyl Tabletler	Roche	4693159001
ChromPure İnsan IgG, Fc parçası	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure İnsan IgG, tüm molekül	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure Fare IgG, tüm molekül	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure Fare IgG, Fc parçası	Jackson Immunoresearch	015-000-008
Tavşan ChromPure IgG, tüm molekül	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure Donkey IgG, tüm molekül	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Mikroarray Tarayıcı	Tecan	LS Reloaded