ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Summary

ספקטרוסקופיית ראמאן היא טכניקה מתאימה ללא מגע, תווית ללא ניתוח של תאים חיים, רקמות מהונדסות בונה רקמות מקומיות. מקור ספציפיים טביעות אצבעות ספקטרלית ניתן להפיק נותחו באמצעות ניתוח רב משתני.

Abstract

טכנולוגיות שאינו הרסני, ללא מגע ו תווית ללא לפקח על תאים בתרביות רקמה יש צורך בתחום של מחקר ביו. ^1-5 שיטות שגרתיות עם זאת, זמין כרגע לדרוש צעדים עיבוד ולשנות שלמות המדגם. ספקטרוסקופיית ראמאן היא שיטה מהירה, המאפשרת מדידה של דגימות ביולוגיות ללא צורך צעדים עיבוד נוסף. . זו טכנולוגיה מבוססת לייזר מזהה פיזור קשיח של אור מונוכרומטי ⁶ כמו בכל רעידות כימי מוקצה הלהקה ראמאן ספציפי (wavenumber ב ^-1 ס"מ), כל דגימה ביולוגית כולל דפוס ספקטרלי טיפוסי בשל הרכב ביוכימי הטבוע בהם ^{7. - 9} בתוך ספקטרום ראמאן, את עוצמות השיא לתאם עם כמות את הקשרים המולקולאריים הנוכחי. ¹ נקודות דמיון ושוני של ערכות נתונים ספקטרליים ניתן לאתר על ידי שימוש בניתוח רב משתני (קרן למשל רכיב ניתוח (PCA)). ¹⁰ כאן, אנו מבצעים ספקטרוסקופיית ראמאן של תאים חיים ורקמות מקומיים. תאים זרע או על מנות התחתונה זכוכית או שמרו על ההשעיה בתנאים נורמליים התרבות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂₎ לפני המדידה. רקמות הילידים הם גזור ומאוחסנים פוספט בופר סליין (PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס מדידות קודמות. בהתאם קבוצת הניסוי שלנו, אנחנו מכן התמקדה גם על גרעין התא או תאית (ECM) מטריקס חלבונים כגון קולגן ואלסטין ו. עבור כל המחקרים, מינימום של 30 תאים או 30 נקודות אקראיות של עניין בתוך ECM נמדדים. מדרגות עיבוד נתונים כלל רקע חיסור ונורמליזציה.

Protocol

1. הכנת דוגמאות ביולוגיות

1. הכנת תאים חיים
   1. הכנת תאים חסיד
      1. זרע בתאים במבחנה תרבותי או מבודד טרי על צלחת הזכוכית התחתונה (גריינר BioOne / גרמניה) דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עד מצורף התא הושלמה.
      2. הסר בינוני תרבות לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS מדידה מוקדמת. לשמור על התאים מכוסים או PBS או תרבות המדיום הסלולרי בכל הליך המדידה כולו.
   2. הכנת תרחיף תאים
      1. ניתוק במבחנה, בתרבית תאים על פי פרוטוקולים משותפים (למשל טריפסין-EDTA, גירוד תאים), התאים בצנטריפוגה מחדש להשעות את התא לקבל גלולה ב PBS או תרבות המדיום הסלולרי.
      2. העברת 100 μl של השעיה תאים (ריכוז. מקסימום 100,000 תאים למ"ל) לצלחת תחתית הכוס.
2. הכנת נתive רקמות
   1. לאחר קצירת הרקמות, ולהעבירם סטרילי, קר כקרח PBS ולשמור אותם לא יותר מ 12 שעות 4 ° C או על מדידת קרח מראש. ניסויים קודמים הראו כי זמן אחסון ממושך (זמן איסכמיה קר> 12 שעות 4 ° C) הביא שינויים רפאים בשל תהליכי פירוק טבעיים.
   2. מדידות יש לבצע עם רקמת מכוסה PBS או בינוני כדי למנוע נזק של חלבונים ותאים ECM בזכות הייבוש רקמות.

2. ראמאן ספקטרומטר

ספקטרומטר ראמאן אישית שלנו משלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי (אולימפוס ט '71) עם ספקטרומטר ראמאן, המאפשר השוואה ישירה של תמונות בהיר שדה הקרינה עם ספקטרום ראמאן. סט בסיסי כולל את 784 ננומטר דיודת לייזר (Toptica Photonics AG / גרמניה), מסנן חריץ הפרדה של אור ראמאן מפוזרים מהאור עירור, מיקרוסקופND הספקטרוגרף (קייזר אופטי מערכות בע"מ, אן ארבור / ארה"ב) עם מכשיר מטען יחד (מצלמת CCD) מותאם לצורך זיהוי של מידע ספקטרלי (F-להציג מ רכים מערכות הדמיה / גרמניה).

3. בקרה של תפקוד לייזר

1. הפעל את התוכנה אנדור סוליס (אנדור / בריטניה) וקבע את הטמפרטורה של מצלמת CCD ל -60 ° C כדי למזער את הרעש הנגרם על ידי זרמים תרמית של המצלמה.
2. מניחים פרוסות סיליקון על הבמה מיקרוסקופ על הליך הכיול.
3. הפעל את הלייזר על ולהגדיר את הכוח mW 85.
4. השתמש Cell תוכנה ב '(Olympus / גרמניה) למקד את הלייזר על גבי פרוסות סיליקון עד XY מופיע.
5. למדוד את פרוסות סיליקון עם הזמן אינטגרציה אחת של 1 שניות באמצעות המטרה אוויר 60x.
6. שינוי יחידת ציר ה-x ממספר פיקסל לשינוי ראמאן (cm ^-1) בתוכנה אנדור סוליס.
7. לשנות את המיקוד של הלייזר השיא סיליקון על 520 ס"מ ב ^-1אסף הספקטרום כדי למצוא את העוצמה המרבית האפשרית עבור הלהקה ראמאן. הסכום המינימלי של עבירות חייב להיות גבוה מ 11,000 יש כיול מוצלח.

4. מדידות ספקטרוסקופיות ראמאן

כל המדידות מבוצעות בטמפרטורת החדר.

1. הגדרות בסיסיות
   1. השתמש במים 60x טבילה אובייקטיבי (Olympus / גרמניה) עם צמצם המספרי של 1.2 לאסוף את הספקטרום של הדגימות.
   2. שנה את הגדרות הרכישה ל -10 אינטגרציה / 10 שניות עבור סכום כולל של 100 שניות לכל המידות.
2. מדידה של תאים חסיד
   1. קחו צלחת תחתית זכוכית עם התאים ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ.
   2. על מנת לקבל אות טובה יותר ולהבטיח שחזור, למקד את הלייזר על גרעין התא, הופכים את אור המיקרוסקופ את ולהתחיל לאסוף את הספקטרום.
   3. מדוד ספקטרום ההתייחסות של דואר ברקעמאוד 10 ספקטרה ידי העברת המוקד לייזר ליד התא. חשוב לקחת בחשבון כי כאשר משנים את המיקוד רקע חדש יש לאסוף את כל עומק המיקוד.
3. מדידה של תאים ההשעיה
   1. העברת 100 μl של השעיה התא לתוך צלחת תחתית כוס ומניחים אותו על הבמה מיקרוסקופ.
   2. פוקוס לייזר על במרכז התא, להדליק את האור במיקרוסקופ את ולהתחיל לאסוף את הספקטרום.
   3. מדוד ספקטרום התייחסות לרקע כל ספקטרום 10 על ידי העברת המוקד לייזר ליד התא. כאשר משנים את הפוקוס, רקע חדש יש לאסוף את עומק המוקד החדש.
4. מדידה של רקמות מקומיות
   1. קח לדוגמה ולמקם אותו לתוך צלחת תחתית הכוס. האזור של עניין (ROI) צריכה להיות מכוונת כלפי החלק התחתון של המנה.
   2. מלאו את הצלחת עם PBS מספיק כדי לכסות את המדגם.
   3. מניחים כוס כיסוי על המדגם, כדי למנוע כל movement המדגם במהלך המדידות.
   4. הגדר את המיקוד לייזר לתוך מבנה של עניין (רזולוציה ועומק הוא לייזר ורקמות תלוי) ולהתחיל לאסוף את הספקטרום.
   5. איסוף ספקטרום התייחסות לרקע כל ספקטרום 10 על ידי העברת לייזר להתמקד מחוץ לאזור הרקמה כולה. כאשר משנים את הפוקוס, רקע חדש יש לאסוף את עומק המוקד החדש.
5. מדידת immunofluorescence (IF), שכותרתו cryosections
   1. סעיף טריים, קפואים Snap-דגימות רקמות באמצעות cryotom רגיל לעלות אותם על סיליקה מצופים משקפיים כיסוי.
   2. להכתים את cryosections בעקבות פרוטוקול שגרתית כי אם, תוך שימוש רק צעד קיבוע קצר (עד 10 דקות עם paraformaldehyde 4%) באמצעות נוגדנים מתאימים לצורך זיהוי של חלבון של עניין.
   3. לבצע מדידות ראמאן התמקדות באזור שבו הקרינה מתרחשת.
6. האלסטין ניסויים השפלה
   1. PLACE ventricularis של אבי העורקים גזור את החזיריות עלונים שסתום (ואלסטין עשיר, יבוא בצד הדם שכבת עלון שסתום הלב) מול לתחתית צלחת בתחתית הכוס.
   2. למדוד את רקמת יליד כ 'השליטה הלא מודגרות "ב 30 נקודות אקראיות על פני השטח את הרקמה כולה התמקדות במבנים סיבי.
   3. מחלקים את המדגם ל 3 חלקים ומניחים אותם צינורות נפרדים 2.5 מ"ל Eppendorf מלאים 2 מ"ל של תמיסת elastase (5 יח' / מ"ל, וורטינגטון / גרמניה).
   4. דגירה רקמת גם עבור 15 או 30 דקות ב 37 ° C.
   5. לאחר דגירה של בין אם 15 או 30 דקות, להסיר את הרקמות מהצינור Eppendorf ולשטוף היטב עם PBS כדי להפסיק לגמרי את התגובה האנזימטית.
   6. למדוד כל דגימה בקצב של 30 נקודות אקראיות, תוך התמקדות במבנים סיבי.

5. עיבוד נתונים וניתוח

1. ספקטרום ראמאן עיבוד
   לפני הטיפולהספקטרום שנוצר בוצעה באמצעות תוכנת אופוס (Bruker Optik GmbH / גרמניה).
   1. על מנת להקטין הפרעה של אותות מן הכוס ובינוניים, כמו גם כדי למנוע שינויים הנגרמים על ידי שינויים במוקד במהלך המדידות, לחסר ספקטרום הרקע המתאים מן הספקטרום שנאסף.
   2. להפחית את ספקטרום לאזור wavenumber בין 400-1800 ^-1 ס"מ, אשר מציעה את הסכום הגבוה ביותר של מידע.
   3. במידת הצורך, לנרמל את הספקטרום לשיא מקסימלית. נורמליזציה גורמים מתוך תנודות בעוצמה וכשלים מערכתיים, לפשט את זיהוי של שינויים מבניים ספקטרה מדגם.
   4. לבצע תיקון כדי להגדיל את הבסיס להשוואה בין ניסויים שונים.
2. ספקטרום ראמאן ניתוח
   ספקטרום ראמאן נותחו באמצעות PCA עם תוכנת Unscrambler (CAMO / נורבגיה). זה ניתוח רב משתני מזהה הדומה והשונה בתוך הנתונים רפאיםקבוצות. כל הספקטרום הוא להתוות כמו נקודה אחת במרחב רב ממדי המבוסס על ספירת שנאספו עבור כל משמרת ראמאן. כל מרכיב עקרוני (PC) מתאר את כמות מסוימת של מידע הכולל הכלול את הנתונים המקוריים. המחשב הראשון הוא זה המכיל את המקור הגבוה ביותר של שונות. כל המחשב הבא מכיל, לפי הסדר, פחות מידע מאשר הקודם. משתנה לכל ציון טוען בכל מחשב. עד זומם מחשבים (= ציונים), מתאמים מדגם חשובים יכולים להיחשף. מקדמי מתארים את התרומה של כל משתנה ניתח את PCA.
   1. לתייג כל קבוצה של מדידות טווחי ידי יצירת שורה עבור כל קבוצת המדגם.
   2. השתמש את ההגדרות הבסיסיות הבאות: PCA צלב אימות, האלגוריתם NIPALS, לא סיבוב ולהתחיל ניתוח. הגדרות אלה ספקטרום תלויים.
   3. לבצע את PCA.

6. נציג תוצאות

ראמאן spectra שנוצר מתאי חסיד לעיתים קרובות מגלים יחס נמוך אות רעש בעוצמה נמוכה האות הכולל (איור 1). ¹¹ בשל העובדה כי מוקד לייזר צריך להיות מוגדר קרוב לתחתית הכוס, את ההשפעה של הפרעה האות זכוכית היא גבוהה למדי, מה שגרם מיסוך של האות המדגם בפועל. כתוצאה מכך, האות מדגם יכול להיות ממוזער או בוטלו גם בזמן רקע חיסור שלאחר מכן. לכן, אנחנו מעדיפים להשתמש תאים ההשעיה לניתוח ספקטרוסקופיות ראמאן שלנו, מאחר שהם מאפשרים גילוי של מידע ספקטרלי מפורט. עם זאת, את הספקטרום של תאים חסיד ההשעיה התערוכה הפסגות העיקריות אותן שונות רק בעוצמות שלהם.

אפיון של סוגי תאים שונים בתוך ההשעיה, לא לפני טיפול נדרש. ספקטרום ראמאן ממוצע וסטיות תקן של fibroblasts אדם, בתאי גזע mesenchymal (MSCs), chondrocytes ו קרטינוציטים נמדד ההשעיה הםמתואר באיור 2. כל ספקטרום ראמאן בנויות באופן דומה, עם פסגות שמקורם ביומולקולות טיפוסיים כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים (ראה לוח 1). ¹² עבור אלו סוגי התאים, אזור רפאים בין 600 ו - 1800 ס"מ ^-1 מכיל מידע ספקטרלי הרלוונטי ביותר, על ידי מה ההבדלים ברורים לגלות אותו בין סוגי תאים שונים (איור 2 א). למופת, הגשנו אזור אחד ספקטרלי (1280-1350 ס"מ ^-1) הצגת הבדלים מבניים ברורים, אשר להמחאה לתנודות מולקולרית של קולגן ושומנים. לעומת זאת, ניתוחים מורפולוגיים אינם מתאימים זיהוי וההבחנה של רוב התאים (איור 2 ב-I). בעוד ההבדל בין chondrocytes ותאי עור ניתן לצפות (איור 2 ד, ח לעומת B, F ו-E, I), fibroblasts ו MSCs קשה להפריד שימוש אך ורק בהיר שדה micrsocעתק (איור 2 ב, לעומת F C, G). ¹³

ניתוח ספקטרוסקופיות ראמאן של רקמה מקורית, בעיקר של ECM חלבונים, דורש החזר ההשקעה ניתן דמיינו ידי הדמיה בהיר השדה כדי להיות מסוגל להתמקד במבנה בהתאמה. למשימה של חלבון למגוון טביעת אצבע מסוימת, אנחנו שנוצר ספקטרום ראמאן של חלבונים טהורים זמינים מסחרית ו cryosections מוכתמים immunohistologically. הנה, זיהינו את ספקטרום טביעת אצבע של סיבים אלסטיים בתוך רקמות מקומיות השוואת ואלסטין lyophilized ו immunofluorescence המוכתמים cryosections המעסיקים נוגדנים נגד ואלסטין. עם זאת, מאז ואלסטין תכונות autofluorescence גבוהה, אשר באה לידי ביטוי ספקטרום ראמאן, ניתוח הנתונים הוא מאתגר (איור 3 א). כדי להקטין את הכישלון השיטתי עקב מדגם ספציפיים מאפיינים כגון autofluorescence, עיבוד מתאים של קבוצות הנתונים הוא קריטי. בנתונים שלנוalyses, השתמשנו נורמליזציה לחסל את עוצמת האות גבוה משמעותית של החלבון אלסטין טהור, ועל כן, הצלחנו ליצור ספקטרום ראמאן דומה (איור 3 ב). אלסטין הוא אחד החלבונים ECM היציבים ביותר בגוף ולכן קשה מאוד לפגוע. ¹⁴ בסדרת הניסוי שלנו, אנחנו המושרה השפלה ואלסטין על בריאות העורקים עלונים החזיריות שסתום על ידי ביצוע עיכול אנזימטי. החלת ניתוח רב משתני PCA, זיהינו הבדלים משמעותיים בין ספקטרום ראמאן של enzymatically שטופלו דגימות בקרות מקומיים (איור 3 ג). הבדלים אלה רפאים נצפו בספקטרום הטעינה ב 861, 1003 ו - 1664 ס"מ ^-1. השינויים המבניים הצפויים ואלסטין המכילים סיבים בשל הזמנים חשיפה ארוכה כדי elastase הוצגו על ידי צביעה של הארט (איור 4), אשר השתקפו גם באשכולות נפרדים יותר הציון להפרדה (איור 3 ג).

באיור 1. ממוצע ספקטרום ראמאן של fibroblasts מנותקים חסיד.

איור 2 (א) ממוצע ספקטרום רמן סטיות תקן של ארבעה סוגים עיקריים שונים בתא מבודד (fibroblasts, MSCs, chondrocytes ו קרטינוציטים). מסגרת מדגיש את אזור הרפאים של 1280 - 1350 ^-1 ס"מ עם הבדלים מבניים. (להיות) מוארת שדה תמונות של (B) fibroblasts מנותקים, (ג) MSCs, (ד) chondrocytes ו (ה) קרטינוציטים. סרגל קנה מידה שווה 20 מיקרומטר. (FI) מוארת שדה תמונות של (ו) fibroblasts חסיד, (G), MSCs (ח) chondrocytes ו (א) קרטינוציטים. סרגל קנה מידה שווה 200 מיקרומטר.

איור 3 (א) ספקטרום ראמאן ללא נורמליזציה של lyophiliZed ואלסטין (הקו הכחול), immunofluorescence (IF), שכותרתו cryosections (קו כתום) וסיבים אלסטיים (הקו האדום) שנמדדו בתוך עלונים מקומיים שסתום אבי העורקים. עוצמת האות גבוה של אלסטין lyophilized נגרמת על ידי autofluorescence. (ב) ספקטרום ראמאן לאחר נורמליזציה כדי למנוע כשלי המערכת. (ג) התוצאות ואת מקדמי ההשוואה בין שליטה שאינם מטופלים (אדום) ו-enzymatically מושפל (כחול וירוק) סיבים אלסטיים בתוך הרקמה המקורית.

איור 4. HART's ומוכתמת אבי העורקים החזיריות עלונים שסתום. סיבים אלסטיים הם דמיינו בשחור. (א) ו - (ב) הצג שאינם מטופלים מלאה (ג) (ד) מתארים דגימות רקמה שנחשפו elastase ואלסטין, משפיל את האנזים דקה 30.

Wavenumber ב -1 ס"מ	הקצאת 12
717-719	CN	פוספוליפידים
785-788	ה-DNA / RNA הבסיסים, OPO עמוד השדרה	ה-DNA / RNA
1003 - 1005	פנילאלנין	חלבון
1220-1280	אמיד III	חלבון
1445-1447	CH 2	חלבונים / שומנים
1655-1680	אמיד IC = C	חלבון שומנים

טבלה 1. להקות ראמאן שאותר בתוך הספקטרום של כל סוגי תאים (פיברובלסטים, MSCs, chondrocytes ו קרטינוציטים).

Discussion

ספקטרוסקופיית ראמאן היא כלי מתאים לנתח דגימות ביולוגיות, כמו במבחנה, בתרבית תאים וחלבונים ECM, כמו גם תאים בתוך רקמות מקומיות. ^11,15,16 הנה, הראינו כי זה ללא מגע, ללא תווית הטכניקה מאפשרת אפליה של סוגי תאים שונים, זיהוי של פירוק חלבונים ECM מבוססת אך ורק על הרכב biomolecular הפנימי של אלה דגימות ביולוגיות.

היתרון הגדול של ספקטרוסקופיית ראמאן היא היכולת הלא פולשני לכמת את טביעת האצבע ביוכימי של מדגם של ספקטרום ראמאן שהתקבל שלה. בניגוד ספקטרוסקופית אינפרא אדום, אשר מניב מידע דומה, ספקטרום ראמאן ניתן לאסוף דגימות מימית, כמו פיזור ראמאן מן המים חלש. בנוסף, ספקטרוסקופיית ראמאן מבוססת על זיהוי של backscattering של אור מונוכרומטי, ולכן לא נדרש עיבוד מדגם המדידה הקודמת. תכונות אלו הופכות את ראספקטרוסקופיה אדם אלטרנטיבה מבטיח פוטנציאל יישומי הדמיה ב vivo. לגבי זה, ספקטרוסקופיה קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (מכוניות) היא טכניקה מאוד מעניינת מכיוון שהיא מאפשרת מהר רכישת רגיש יותר של נתונים המבוססים על אותם אותות הרטט מנוצל בניסויים שלנו. ^15,16 שיטות חלופיות אחרות, לרבות autofluorescence multiphoton הנגרמת ואת הדור השני הדמיה הרמונית הוכחו בעבר להיות מתאים ניטור פולשני דגימות ביולוגיות שאינן או מינימלית. ¹⁷ עם זאת, אלו שיטות הדמיה קשורים עלויות גבוהות מאוד מוגבלים autofluorescence להפקת מולקולות. בנוסף, ספקטרומטר ראמאן קל לשלב עם מיקרוסקופים אופטיים קונבנציונליים. תכונות אלו הופכות את ספקטרוסקופיית ראמאן כלי רב ערך כדי ללמוד דגימות ביולוגיות בסביבות פיזיולוגיים.

אחת המגבלות הנוכחיות של ספקטרוסקופיית ראמאן שלנו היא להקיםמוקד לייזר קטן יחסית (250 ננומטר רוחב 1/2 לכל היותר (FWHM) לרוחב ו 700 ננומטר FWHM צירית), אשר נוצר על ידי המטרה צמצם גבוהה המספרי (NA = 1.2). אמנם צמצם המספרי גבוה מאפשר לכסות כמות טובה של האור הנפלט ראמאן מניב יחס אות לרעש גבוה, NA גבוהה מייצרת רק המיקוד אוסף קטן בתוך מדגם זה הוא בדרך כלל הרבה יותר קטן מאשר בתא. על מנת להשוות ספקטרום ראמאן של תאים שונים, אוסף של הספקטרום נציג חיוני, וזה קשה להשיג עם אזור המיקוד קטן. כדי לטפל בבעיה זו, אנו עובדים על התהליך כדי להפוך את האוסף האות בנקודות שונות בתוך התא (= מיפוי ספקטרוסקופיות ראמאן), וכתוצאה מכך רפאים בממוצע וכנוע למגוון מייצג. בנוסף, טכניקה זו תספק סקירה של חלוקת להקות ראמאן ספציפיים, למשל חלוקת חלבונים בתוך התא.

Biolדגימות ogical הם מורכבים מאוד מורכב מתערובת הטרוגנית של ביומולקולות התורמים ספקטרום ראמאן אסף. לכן, דפוס ספקטרלי הוא מורכב מאוד את הפיקוח על סוג אחד של מולקולות בתוך ספקטרום ראמאן קשה להשיג עם חפיפה של אותות מולקולות שונות. בנוסף, הקרינה הפנימית של מדגם יכול להסתיר מידע בעל ערך של אותות ראמאן החלשות. מעניין לציין, כי בכמה מחקרים קודמים שלנו, זיהינו autofluorescence בספקטרום ראמאן כגורם מבדל העיקרי בין סוגי תאים (MSCs ו fibroblasts) באמצעות כלי הניתוח המתאים. ¹³ זיהינו גם שינויים בעוצמת האות הכולל ראמאן יכול לשמש אינדיקטור למצב של קולגן סיבי קולגן בתוך ECM של עלונים שסתום אבי העורקים. ⁹ עם זאת, כאשר מנתחים את מצב ואלסטין ברקמות אלה, לא הצליחו לזהות תוצאות דומות. כאמור בתוצאהבסעיף זה, היינו רק מסוגל לזהות שינויים של להקות ראמאן ספציפיים של elastase שטופלו דגימות בהשוואה לקבוצת הביקורת מקומיים. לא ראינו ירידה של האות ראמאן הכוללת את enzymatically שטופלו דגימות כצפוי. תצפיות אלו הביאו עלילה ציון כי לא חשף את היווצרות אשכול ברור כפי שניתן לראות במחקר הקודם. ⁹ לעומת זאת, ההשפעה של טיפול אנזימטי לא הורגש בתוך תוצאות PCA. אנו מניחים כי אלה פערים בין שני החלבונים ECM, וכן קולגן ואלסטין, מבוססים על הבדלים מורפולוגיים שונים ותהליכים השפלה אנזימטיות: בתוך העלון שסתום אבי העורקים, קולגן עשיר אזור (fibrosa) היא שכבה רציפה שהופך משוחרר עקב טיפול אנזימטי, לפיה ואלסטין המכיל אזור (ventricularis) יש תצורת הרשת המופיע מקוטעת לאחר חשיפה elastase (איור 4). מדידות ספוט יחיד ולכן לא היו המתאימהאכלו כדי לאתר קרעים קטנים כאלה בתוך הרשת ואלסטין. כאן, מיפוי ראמאן של רקמת יעזור לזהות תקלות ברשת.

אתגר נוסף ספקטרוסקופיית ראמאן של דגימות ביולוגיות היא להפחית את זמני המדידה. פתרון אחד הוא להגדיל את כוח לייזר, אשר מתאים כל עוד דגימות ביולוגיות אינם מושפעים נזק תמונה. כל הניסויים הנוכחיים שלנו הם הוכחה של עקרון מחקרים המתמקדים במחקר בסיסי, עם זאת, המטרה הכללית שלנו היא ליישם ספקטרוסקופיית ראמאן עבור יישומים קליניים, כולל רפואה רגנרטיבית (למשל בקרת איכות של רקמות מהונדסות מוצרים), לפני השתלת ניטור שוחד אבחון סרטן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
elastase	וורטינגטון	LS006363
נוגדנים נגד ואלסטין	סיגמא	HPA018111	1:75; ציטראט חיץ
PBS	Lonza	17-512F
בתחתית הזכוכית מנות	גריינר BioOne	627860
Unscrambler	CAMO
אופוס	Bruker