Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

Resumen

La espectroscopia Raman es una técnica adecuada para el contacto no, libre de marca análisis de las células vivas, las construcciones de ingeniería de tejidos y tejidos nativos. Fuente específicos de huellas espectrales pueden ser generados y analizados utilizando el análisis multivariado.

Resumen

Las tecnologías no destructivas, sin contacto y libre de etiquetas para monitorear cultivos de células y tejidos se necesitan en el campo de la investigación biomédica. ^1-5 métodos de rutina, sin embargo, disponibles en la actualidad requieren de pasos de procesamiento y alterar la integridad de la muestra. La espectroscopía Raman es un método rápido que permite la medición de muestras biológicas sin la necesidad de etapas de procesamiento adicionales. . Esta tecnología basada en láser detecta la dispersión inelástica de luz monocromática ⁶ Como cada vibración química se asigna a una banda específica de Raman (número de onda en cm ^-1), cada muestra biológica presenta un patrón típico espectral debido a su composición bioquímica inherente ^{7. - 9} Dentro de los espectros Raman, las intensidades de los picos se correlacionan con la cantidad de los enlaces moleculares presentes. ¹ Similitudes y diferencias de los conjuntos de datos espectrales pueden ser detectados mediante el empleo de un análisis multivariado (análisis de componentes principales (PCA)) ^10. En este sentido, realizar la espectroscopia Raman de células vivas y tejidos nativos. Las células se sembraron en placas o bien con fondo de cristal, o mantenidas en suspensión en condiciones normales de cultivo celular (37 ° C, 5% de CO ₂₎ antes de la medición. Tejidos nativos se disecaron y se almacena en tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C mediciones anteriores. En función de nuestro dispositivo experimental, entonces o bien se centró en el núcleo de la célula o de la matriz extracelular (ECM) de proteínas como elastina y colágeno. En todos los estudios, un mínimo de 30 células o 30 puntos al azar de interés dentro de la ECM se miden. Datos de los pasos de procesamiento incluye la sustracción de fondo y la normalización.

Protocolo

1. Preparación de la muestra biológica

1. Preparación de las células vivas
   1. Preparación de células adherentes
      1. De semillas en las células cultivadas in vitro, o aisladas recientemente en un plato con fondo de cristal (Greiner BioOne / Alemania) y los incuban a 37 ° C y 5% de CO ₂ hasta que la adhesión celular se ha completado.
      2. Retire el medio de cultivo y lavar suavemente tres veces con PBS antes de la medición. Mantener las células cubiertas con PBS o medio de cultivo celular durante todo el procedimiento de medición.
   2. Preparación de las células en suspensión
      1. Separar in vitro células cultivadas de acuerdo con los protocolos comunes (por ejemplo, tripsina-EDTA, raspado de células), centrifugar las células y volver a suspender el sedimento celular obtenido en PBS o medio de cultivo celular.
      2. Transferir 100 l de la suspensión de células (concentración: máximo de 100.000 células / ml) a una placa inferior de vidrio.
2. Preparación de NATive tejidos
   1. Después de la cosecha de los tejidos, la transferencia a estéril, helado de PBS y mantenerlas no más de 12 horas a 4 ° C o sobre hielo antes de la medición. Experimentos previos han demostrado que un tiempo de almacenamiento prolongado (tiempo de isquemia fría> 12 horas a 4 ° C) dio lugar a cambios espectrales debido a procesos de degradación naturales.
   2. Las mediciones se realizaron con el tejido cubierto en PBS o medio para evitar el daño de las proteínas ECM y las células debido al secado del tejido.

2. Espectrómetro Raman

Nuestro espectrómetro Raman personalizado combina un microscopio de fluorescencia estándar (Olympus IX 71) con un espectrómetro Raman, que permite la comparación directa de las imágenes de campo claro y fluorescencia con el espectro Raman. La configuración básica consiste en un diodo láser 784 nm (Toptica fotónica AG / Alemania), un filtro de muesca para la separación de la luz Raman de dispersión de la luz de excitación, un microscopio unaª a. espectrógrafo (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / EE.UU.) con un dispositivo de carga acoplada (CCD) optimizado para la detección de la información espectral (F-vista desde Soft Imaging Systems / Alemania)

3. Función de Control de láser

1. Inicie el software de Andor Solís (Andor / Reino Unido) y ajustar la temperatura de la cámara CCD a -60 ° C para minimizar el ruido causado por las corrientes inducidas térmicamente en la cámara.
2. Colocar una oblea de silicio sobre la platina del microscopio para el procedimiento de calibración.
3. Encienda el láser y ajustar la potencia a 85 mW.
4. Utilice el software de la célula B (Olympus / Alemania) para enfocar el láser sobre la oblea hasta que aparece XY.
5. Medir la oblea de silicio con un tiempo de integración única de 1 seg usando un objetivo 60x aire.
6. Cambio de la unidad del eje X, del número de píxeles para cambio de Raman (cm ^-1) en el software de Andor Solís.
7. Variar el enfoque láser de silicio, el pico a 520 ^cm-1 enel espectro recogió el fin de encontrar la máxima intensidad posible para esta banda Raman. La cantidad mínima de recuento deberá ser superior a 11.000 para tener una calibración satisfactoria.

4. Las medidas espectroscópicas Raman

Todas las mediciones se realizan a temperatura ambiente.

1. Los ajustes básicos
   1. Utilizar un objetivo de inmersión en agua 60x (Olympus / Alemania) con una apertura numérica de 1,2 para recoger el espectro de las muestras.
   2. Cambiar la configuración de adquisición a 10 integraciones / 10 segundos para un total de 100 segundos por mediciones.
2. La medición de las células adherentes
   1. Toma el plato con fondo de cristal con las células y lo coloca en la platina del microscopio.
   2. Con el fin de obtener una mejor señal y asegurar la reproducibilidad, enfocar el láser en el núcleo de la célula, apagar la luz del microscopio de fuera y empezar a cobrar el espectro.
   3. Medir un espectro de referencia del fondo emuy 10 espectros moviendo el enfoque del láser al lado de la celda. Es importante tener en cuenta que al cambiar el foco de un nuevo fondo deben ser recogidos para cada profundidad de foco.
3. Medición de las células en suspensión
   1. Transferir 100 l de la suspensión de células en el plato con fondo de cristal y colocarlo en la platina del microscopio.
   2. Enfoque el láser en el centro de la célula, gire la luz del microscopio fuera y empezar a cobrar el espectro.
   3. Medir un espectro de referencia del fondo cada espectros 10 moviendo el enfoque del láser al lado de la celda. Al cambiar el enfoque, un nuevo fondo deben ser recogidos por la profundidad nuevo enfoque.
4. Medición de los tejidos nativos
   1. Tomar la muestra y colóquela en un plato con fondo de cristal. La región de interés (ROI) debe estar orientada hacia la parte inferior del plato.
   2. Llenar el recipiente con suficiente PBS para cubrir la muestra.
   3. Colocar una cubierta de vidrio sobre la muestra para evitar cualquier MOVement de la muestra durante las mediciones.
   4. Establecer el enfoque del láser en la estructura de interés (resolución de profundidad es láser y el tejido-dependiente) y comenzar a recoger los espectros.
   5. Recoger un espectro de referencia del fondo cada espectros 10 moviendo el láser se centran fuera del área de todo el tejido. Al cambiar el enfoque, un nuevo fondo deben ser recogidos por la profundidad nuevo enfoque.
5. Medición de inmunofluorescencia (IF)-etiquetados cryosections
   1. Sección frescas, congeladas instantáneamente muestras de tejido usando un estándar de cryotom y montarlos en cubreobjetos recubiertos de sílice.
   2. Mancha de los cryosections siguiendo un protocolo de rutina para SI, empleando solamente una etapa de fijación corto (máx. 10 minutos con paraformaldehído al 4%) y el uso de anticuerpos adecuados para la detección de la proteína de interés.
   3. Realizar mediciones Raman centradas en el área donde se produce la fluorescencia.
6. Elastina experimentos de degradación
   1. Place la ventricularis de los velos porcina disecados válvula aórtica (elastina-rica, la sangre entrada del lado de la capa de la valva de la válvula cardíaca) se enfrenta a la parte inferior de la placa inferior de vidrio.
   2. Medir el tejido nativo como un "no incubada control" a los 30 puntos al azar a través de toda la superficie del tejido centrándose en las estructuras fibrilares.
   3. Dividir la muestra en 3 secciones y las coloque en distintos tubos Eppendorf de 2,5 ml conteniendo 2 ml de una solución elastasa (5 U / ml, Worthington / Alemania).
   4. Incubar el tejido, ya sea para 15 o 30 minutos a 37 ° C.
   5. Después de incubar durante 15 o 30 minutos, retirar los tejidos del tubo Eppendorf y lavar cuidadosamente con PBS con el fin de detener por completo la reacción enzimática.
   6. Medir cada muestra en 30 puntos al azar, centrándose en las estructuras fibrilares.

5. Procesamiento de Datos y Análisis

1. Procesamiento de espectros Raman
   El pre-tratamiento delespectros generados se realizó utilizando el software OPUS (Bruker Optik GmbH / Alemania).
   1. Con el fin de reducir las señales de interferencia desde el cristal y medios, así como para evitar variaciones causadas por cambios en el foco durante las mediciones, restar el espectro de fondo correspondiente a partir de los espectros de recogida.
   2. Reducir los espectros de la región entre el número de onda 400-1800 ^cm-1, que ofrece la mayor cantidad de información.
   3. Si es necesario, para normalizar el espectro desde el pico máximo. La normalización de los factores de las fluctuaciones de intensidad y los fracasos sistemáticos, lo que simplifica la detección de cambios estructurales en los espectros de la muestra.
   4. Lleve a cabo una corrección de línea de base para aumentar la comparabilidad entre los diferentes experimentos.
2. Análisis de los espectros Raman
   Los espectros Raman fueron analizados mediante el PCA con el posicionador (CAMO / Noruega) de software. Este análisis multivariado detecta diferencias y similitudes dentro de los datos espectralesconjuntos. Cada espectro se representa en un solo punto en un espacio multidimensional basado en los recuentos obtenidos para cada turno de Raman. Cada componente principio (PC) describe una cierta cantidad de la información total contenida en los datos originales. El primer PC es la que contiene la mayor fuente de variación. Cada PC contiene las siguientes, en orden, menos información que la anterior. Cada variable tiene una puntuación y la carga de una en cada PC. Al graficar PC (= resultados), las correlaciones importantes de la muestra pueden estar expuestos. Las cargas de describir la contribución de cada variable analizada a la PCA.
   1. Escriba en cada grupo de medidas mediante la creación de rangos de filas para cada grupo de la muestra.
   2. Use los siguientes ajustes básicos para la PCA: validación cruzada, el algoritmo NIPALS, sin rotación y comenzar el análisis. Estos ajustes son espectros dependiente.
   3. Lleve a cabo el PCA.

6. Los resultados representativos

Raman spECTRA generado a partir de células adherentes a menudo revelan una baja relación señal-ruido y una baja intensidad de la señal global (Fig. 1). Debido al hecho de que el enfoque del láser tiene que ser situado cerca del fondo de cristal, la influencia de la interferencia ¹¹ señal de vidrio es más bien alta, provocando enmascaramiento de la señal real de la muestra. En consecuencia, la señal de muestra puede ser minimizado o eliminado incluso durante un fondo posterior sustracción. Por lo tanto, preferimos utilizar células en suspensión para el análisis espectroscópico de Raman, ya que permiten la detección de más información espectral detallada. Sin embargo, los espectros de las células adherentes y la suspensión exhiben los mismos picos principales que sólo difieren en sus intensidades.

Para la caracterización de diferentes tipos de células dentro de una suspensión, sin pre-tratamiento se requiere. Los espectros Raman media y las desviaciones estándar de los fibroblastos humanos, células madre mesenquimales (CMM), condrocitos y queratinocitos medido en suspensión sonrepresentada en la figura 2. Todos los espectros Raman tienen una estructura similar, con picos procedente de biomoléculas típicos tales como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos (ver Tabla 1). ¹² Para estos tipos de células, la región espectral entre 600 y 1800 ^cm-1 contiene la información espectral más relevante, por claras diferencias que son detectables entre los diferentes tipos de células (Fig. 2A). Ejemplar, que puso de relieve una región espectral (1280-1350 ^cm-1) que muestra claras diferencias estructurales, que es asignable a las vibraciones moleculares de colágeno y los lípidos. En contraste, los análisis morfológicos no son adecuados para la identificación y distinción de la mayoría de las células (Fig. 2B-I). Mientras que la diferencia entre los condrocitos y células de la piel es observable (Fig. 2D, H versus B, F y E, I), fibroblastos y MSCs son difíciles de separar utilizando únicamente de campo claro micrsocopiar (Fig. 2B, C versus C, G) ^13.

El análisis espectroscópico Raman de tejido nativo, particularmente de las proteínas ECM, requiere que un ROI puede ser visualizada por brillante campo de la imagen con el fin de ser capaz de concentrarse en la estructura respectiva. Para la asignación de una proteína a un espectro de huellas dactilares específica, se generaron espectros Raman de proteínas puras comercialmente disponibles y cryosections inmunohistológicamente manchados. En este caso, hemos identificado los espectros de huellas dactilares de las fibras elásticas dentro de los tejidos nativos comparan elastina liofilizado e inmunofluorescencia manchadas de cryosections empleando un anticuerpo contra la elastina. Sin embargo, dado que la elastina presenta una autofluorescencia alta, lo cual se refleja en el espectro Raman, el análisis de datos es difícil (fig. 3A). Para reducir el fracaso sistemático debido a específicos en muestras propiedades tales como la autofluorescencia, un tratamiento apropiado de los conjuntos de datos es crucial. En nuestros datos unaalyses, hemos utilizado normalización para eliminar la intensidad de la señal significativamente mayor de la proteína pura elastina, y por lo tanto, hemos sido capaces de generar espectros Raman comparables (Fig. 3B). La elastina es una de las proteínas ECM más estables en el cuerpo y por lo tanto muy difíciles de degradar. ¹⁴ En nuestro trabajo experimental, que induce la degradación de la elastina en los folletos de salud porcina de la válvula aórtica mediante la realización de una digestión enzimática. Aplicando el análisis multivariado PCA, se identificaron diferencias significativas entre los espectros Raman de las muestras tratadas enzimáticamente y los controles nativos (Fig. 3C). Estas diferencias espectrales fueron observados en el espectro de carga a 861, 1003 y 1664 ^cm-1. Esperados cambios estructurales en las fibras que contienen elastina debido a los tiempos de exposición prolongados a la elastasa se ​​demuestra la tinción de HART (Fig. 4), que también se reflejaron en más grupos distintos puntuación separables (Fig. 3C).

Figura 1. La media de los espectros Raman de los fibroblastos independientes y adherentes.

Figura 2. (A) La media de los espectros Raman y las desviaciones estándar de cuatro diferentes tipos de células primarias aisladas (fibroblastos, MSC, los condrocitos y queratinocitos). El marco se destaca la región espectral de 1280 - 1350 ^cm-1 con las diferencias estructurales. (BE) de campo claro de imágenes separadas (B) fibroblastos, (C) MSCS, (D) los condrocitos y los queratinocitos (E). Barra de escala es igual a 20 micras. (FI) brillante campo de las imágenes de adherentes (F), los fibroblastos (G) MSC, (H) condrocitos (I) y queratinocitos. Barra de escala es igual a 200 micras.

Figura 3. (A) los espectros Raman, sin normalización de lyophiliZed elastina (línea azul), inmunofluorescencia (IF)-etiquetados cryosections (línea naranja) y fibras elásticas (línea roja) medidos en la válvula aórtica nativa folletos. La alta intensidad de señal de liofilizado elastina es causada por autofluorescencia. (B) espectro Raman después de la normalización con el fin de eliminar los fallos sistémicos. (C) Las puntuaciones y las cargas de la comparación entre el control no tratado (rojo) y enzimáticamente degradada (azul y verde) fibras elásticas en el tejido nativo.

Figura 4. HART's manchados de porcinos valvas de la válvula aórtica. Las fibras elásticas se visualizan en negro. (A) y (B) muestran el control no tratado y (C) y (D) representan las muestras de tejido que fueron expuestos a la elastasa enzima que degrada la elastina de 30 minutos.

Número de onda en cm -1	Asignación de 12
717-719	NC	Los fosfolípidos
785-788	ADN / ARN bases, OPO espina dorsal	ADN / ARN
1003 - 1005	La fenilalanina	Proteína
1220-1280	Amida III	Proteína
1445-1447	CH $ 2	Proteína / lípido
1655-1680	Amida IC = C	Lípidos y proteínas

Tabla 1. Bandas Raman que se detectan en los espectros de todos los tipos de células (fibroblastos, MSC, los condrocitos y queratinocitos).

Discusión

La espectroscopía Raman es una herramienta adecuada para analizar muestras biológicas, tales como in vitro en cultivo células y proteínas ECM así como las células dentro de los tejidos nativos. ^11,15,16 Aquí, hemos demostrado que este contacto no, etiqueta libre de la técnica permite discriminación de diferentes tipos de células y la detección de la degradación de proteínas ECM basada únicamente en la composición biomolecular intrínseca de estas muestras biológicas.

La principal ventaja de la espectroscopía Raman es la capacidad de forma no invasiva cuantificar la huella bioquímica de una muestra por su espectro Raman resultante. En contraste con la espectroscopia infrarroja, que produce información similar, los espectros Raman puede ser recogida de muestras acuosas, como la dispersión Raman de agua es débil. Además, la espectroscopia Raman se basa únicamente en la detección de la retrodispersión de la luz monocromática, por lo tanto, no hay procesamiento de la muestra se requiere la medición anterior. Estos atributos hacen que Raespectroscopia de hombre una alternativa prometedora para el potencial en aplicaciones de imágenes in vivo. En este respecto, coherente anti-Stokes Raman (CARS) es una técnica muy interesante ya que permite la adquisición rápida y más sensible de los datos basados ​​en las mismas señales de vibración utilizados en nuestros experimentos. ^15,16 Otros métodos alternativos como multifotónica inducida por autofluorescencia y formación de imágenes de segunda generación armónica han sido previamente demostrado ser adecuado para el seguimiento de muestras biológicas no invasiva o mínima. ¹⁷ Sin embargo, estas modalidades de imagen están asociados con costos muy altos y se limitan a autofluorescencia generadoras de moléculas. Además, el espectrómetro Raman es fácil de combinar con los microscopios ópticos convencionales. Estas características hacen de la espectroscopia Raman una herramienta valiosa para estudiar muestras biológicas en ambientes fisiológicos.

Una de las limitaciones actuales de nuestra espectroscopia Raman es configurarel láser relativamente pequeño foco (250 nm completo máxima anchura media (FWHM) lateral y 700 nm FWHM axial) que es creado por un objetivo gran apertura numérica (NA = 1,2). Aunque una abertura numérica alta permite cubrir una buena cantidad de la luz emitida Raman produciendo en una alta relación señal-ruido, la alta NA produce sólo una pequeña colección de enfoque dentro de la muestra que es típicamente mucho más pequeña que una célula. Con el fin de comparar los espectros Raman de células diferentes, la colección de un espectro representativo es esencial, que es difícil de obtener con una pequeña zona de enfoque. Para solucionar este problema, estamos trabajando en un proceso para automatizar la recogida de la señal en diferentes puntos dentro de la célula (= espectroscopia Raman cartografía), lo que resulta en un promedio del espectro y la obtención de un espectro representativo. Además, esta técnica proporciona una visión general de la distribución de bandas específicas Raman, por ejemplo de la distribución de las proteínas dentro de una célula.

Biol.muestras epidemiológicos completos son muy complejas y consisten en una mezcla heterogénea de biomoléculas que contribuyen a los espectros de recogida de Raman. Por lo tanto, el patrón espectral es muy complejo y el seguimiento de un solo tipo de una molécula dentro de un espectro Raman es difícil de lograr con la superposición de señales de moléculas diferentes. Adicionalmente, la fluorescencia intrínseca de la muestra puede enmascarar información valiosa de las señales más débiles Raman. Curiosamente, en algunos de nuestros estudios anteriores, hemos identificado autofluorescencia en los espectros Raman como el principal factor diferenciador entre los tipos de células (fibroblastos y MSC), utilizando una herramienta de análisis adecuado. ¹³ También se identificó que los cambios en la intensidad de la señal Raman en general puede servir como un indicador para el estado de colágeno y las fibras de colágeno dentro de la ECM de valvas de la válvula aórtica. ^{9 Sin} embargo, al analizar el estado de la elastina en estos tejidos, que no fueron capaces de detectar resultados similares. Como se mencionó en el resultadola sección s, que sólo fueron capaces de detectar las alteraciones específicas de las bandas Raman en las muestras tratadas con elastasa en comparación con los controles nativos. No hemos visto una disminución de la señal Raman en general en las muestras tratadas enzimáticamente como se esperaba. Estas observaciones resultó en una parcela puntuación que no reveló una formación de agrupaciones clara como se ve en el estudio anterior. ⁹ En contraste, la influencia del tratamiento enzimático fue detectable dentro de los resultados de PCA. Suponemos que estas discrepancias entre las dos proteínas de matriz extracelular, la elastina y el colágeno, se basan en las diferencias morfológicas y diferentes procesos de degradación enzimática: dentro de la valva de la válvula aórtica, la zona rica en colágeno (fibrosa) es una capa continua que se afloja debido a la tratamiento enzimático, el cual contiene la elastina zona (ventricularis) tiene una configuración de red que aparece fragmentado después de la exposición a la elastasa (fig. 4). Las mediciones individuales al contado no eran por lo tanto, aprocomió para detectar tales rupturas pequeñas dentro de la red de elastina. Aquí, un mapeo de Raman del tejido podría ayudar a identificar las averías de la red.

Otro desafío en la espectroscopia Raman de muestras biológicas es reducir los tiempos de medición. Una solución es aumentar la potencia del láser, que es adecuado siempre que las muestras biológicas no son afectadas por foto-daño. Todos nuestros experimentos actuales son la prueba de principio de los estudios centrados en la investigación básica, sin embargo, nuestro objetivo general es poner en práctica la espectroscopia Raman para aplicaciones clínicas, incluida la medicina regenerativa (por ejemplo, control de calidad de los productos de ingeniería tisular), pre-trasplante del injerto y la vigilancia el diagnóstico del cáncer.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
elastasa	Worthington	LS006363
anti-elastina anticuerpo	Sigma	HPA018111	1:75; tampón citrato
PBS	Lonza	17-512F
platos de fondo de cristal	Greiner BioOne	627860
El Posicionador	CAMO
Opus	Bruker