דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

Summary

שיטה זו מתארת ​​כיצד לבודד ולהנציח תאי אנדותל כלי דם ממוח עכבר. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד החל מהומוגניזציה של רקמת מוח, שלבי עיכול, זריעה והנצחה של התאים. בדרך כלל, זה לוקח בערך חמישה שבועות כדי להשיג קו אחיד, שהונצח כלי דם האנדותל תא.

Abstract

תאי אפיתל ואנדותל (EC) בונים מחסומי paracellular אשר להגן על הרקמות מהסביבה החיצונית והפנימית. מחסום דם המוח (BBB) ​​בהיקף של EC, בסוף הרגליים, pericytes astrocyte וקרום הבסיס הוא אחראי להגנה והאיזון של parenchyma המוח. במודלים חוץ גופיית BBB הם כלים משותפים ללימוד המבנה והתפקוד של BBB ברמה התאית. מספר לא מבוטל של דגמים שונים במבחנת BBB הוקם במשך מחקר במעבדות שונות עד היום. בדרך כלל, את התאים מתקבלים ממקור הבקר, חזיר, עכברוש רקמת מוח או עכבר (נדון בהרחבה בביקורת על ידי וילהלם et al. ^1). דגימות רקמה אנושיות הן זמינות רק במספר מצומצם של מעבדות או חברות ^2,3. בעוד הכנות ראשוניות של תא הן זמן רבים ותרבויות EC יכולות להיות שונות מיצווה כדי תצווה, ההקמה הונצחה EC ליןes הוא מוקד העניין מדעי.

כאן, אנו מציגים שיטה לקביעת קו הונצח מוח כלי דם EC ממוח עכבר ילוד. אנו מתארים את רישום צעד אחר צעד הליך ריאגנטים ופתרונות בשימוש. השיטה שהוקמה על ידי המעבדה שלנו מאפשרת בידוד של קו הומוגני הונצח אנדותל תא בתוך ארבעה עד חמישה שבועות. שורות תאי אנדותל כלי הדם במוח המכונות cEND ⁴ (מקליפת מוח) וcerebEND ⁵ (מקליפת המוח הקטנה), היינו מבודדים על פי נוהל זה במעבדת פורסטר ויש יעילות בשימוש להסבר של תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים בב"ב. שימוש cEND וcerebEND אנו מראים כי תאים אלה מגיבים ^{לglucocorticoid-4,6-9} ואסטרוגן טיפול ^10, כמו גם למתווכים פרו infammatory, כגון TNFalpha ^5,8. יתר על כן, יש לנו למדנו את הפתולוגיה של מרובה sc¹¹ lerosis והיפוקסיה ^12,13 ב EC ברמה. CEND וקווי cerebEND יכולים להיחשב ככלי טוב ללימוד המבנה והתפקוד של BBB תגובות, הסלולריות של ECs לגירויים או באינטראקציה שונים של EC עם ימפוציטים או תאים סרטניים.

Protocol

1. בידוד של המוח Microvessels

1. לכל אחד להשתמש בהכנה 09:55 עכברי ילוד מהמין (3-5 ימים ישנים).
2. להרדים את עכבר על פי המלצות מקומיות IACUC / וטרינר, להסיר את המוח באופן מיידי, והעברה לצלחת הפטר שמכילה את הפתרון הבא: 15 מ"מ (Hepes pH 7.4), 153 המ"מ NaCl, KCl 5.6 מ"מ, 2.3 המ"מ CaCl ₂ x 2H ₂ הו, 2.6 המ"מ MgCl ₂ x 6H ₂ O,% 1 (w / v) BSA (להלן כלמאגר).
3. אלא אם צוין אחרת, כל נהלי הבידוד צריכים להתבצע בטמפרטורת חדר (RT) (22-24 ° C) מתחת למכסת מנוע הזרימה למינרית. חותך את המוח (מוח בלי מוח קטן וגזע מוח), לאחר הסרת קרומי המוח ושברי נימים, במאגר באמצעות אזמל סטרילי. פיפטה הרקמה שברים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מ"ל עד שלא יופיעו גושים. להעביר את ההשעיה לתוך צינור פלקון 50 מ"ל וצנטריפוגה XG ב 250 למשך 5 דקות בRT.

הערה: קרום מוח יכול להיות מזוהה כקרומים דקים ושקופים על פני השטח של רקמת המוח. ניתן להסיר אותם בזהירות עם מלקחיים סטרילית.

4. השלך את supernatant.
5. ממס את הגלולה במאגר המ"ל 4.5 עם 1.5 מ"ל של 0.75% (w / v) collagenase / dispase (רוש) ודגירה במשך 45 דקות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים (לעתים רועד).
6. בינתיים, להכין את לוחות 12-גם על ידי ציפוי ארבע בארות בקולגן IV (0.1 מ"ג / מ"ל ​​הומס בחומצה אצטית 50 מ"מימ). אפשר לדבוק לשעה 1.
7. עצור את מערכת העיכול על ידי תוספת של 15 מ"ל החיץ א resuspend קר כקרח הגלולה ביסודיות.
8. צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG עבור 10 דקות ב RT.
9. השלך את supernatant.
10. כדי להסיר המיאלין, יוסיף 10 25% מ"ל (w / v) BSA (Sigma, טוהר> 98%) וצנטריפוגה XG ב 1000 עבור 20 דקות ב 4 ° C. BSA 25% צריך להיות מומס ב1x PBS (Paa מעבדות) ומסונן דרך f 0.2 מיקרומטרilter).
11. להשליך בזהירות את supernatant, לפזר את הגלולה במאגר 10 מ"ל ולהעביר לצינור פלקון חדש.
12. צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG למשך 5 דקות בRT. גלולת כתוצאה מכילה את תאי האנדותל.
13. שטוף פעמי צלחת קולגן IV-12-המצופית היטב עם PBS.
14. Resuspend גלול ב 4 מ"ל של מדיום גידול (DMEM המכיל 10% FCS, 50U/ml פניצילין / סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין) וצלחת השעית התא לשתי בארות, 2 מ"ל לכל באר. הוסף puromycin לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם / מ"ל ​​ודגירה במשך 45 דקות על 37 מעלות צלזיוס בתא תרבות חממה. שלב זה מאפשר הסרת תאים במהירות דבקות הערה:. Puromycin מתווסף ל24 שעות. רק המוח ECs יכול לעכל אותו, לסוגי תאים אחרים puromycin הוא רעיל ^14.
15. העברה בינוני 2 מ"ל מכילים תאים שאינם דבקים-מצעד 1.14 לשתי בארות טריות (בארות אלה מכילות שבריר EC). מלא את הבארות עם תאים דבקו מבקעמ '1.14 במדיום טרי מ"ל 2 (בארות אלה מכילים סוגים אחרים של תאים פיברובלסטים, למשל, האסטרוציטים, וניתן לגדל במקביל ומשמשות להשוואות של המורפולוגיה).
16. שינוי הבינוני ביום המחרת.

2. מנציח את תאי אנדותל כלי הדם במוח

1. לטפח GP + E-86 (ניאו GPENeo) ¹⁵ פיברובלסטים, מפרישי וירוס שכפול לקוי עם אונקוגן polyoma אמצע T במדיום DMEM FCS המכיל 10% חום מומת, 50U/ml פניצילין / סטרפטומיצין, ו2 מ"ג / המ"ל G418 ( . Paa מעבדות) בצלוחיות מצופות ג'לטין הערה: transfection אונקוגן T אמצע Polyoma גורם יתרון צמיחה של מעל ECs הלא ECS-מובילה לmonolayer הומוגנית של תאי אנדותל עם מורפולוגיה 4 עד 6 שבועות של התרבות. GPENeo אינו זמין באופן מסחרי וניתן להשיג כחומר ציבורי משותף (עיין בפרסומים מקוריים ^4,16).
2. כדי להשתמש במדיום המכיל וירוס עבור הנצחה, לטפח את תאי GPENeo במדיום G418-חינם עבור 24 שעות.
3. הסרת 10 מ"ל של GPEneo supernatant ולהוסיף Polybrene (hexadimethrine רומיד) (Sigma) לריכוז סופי של מיקרוגרם 8 / מ"ל, לעקר דרך 0.45 מיקרומטר מסנן כדי להסיר את הברים הסלולריים.
4. הסר את מדיום גידול מתרבויות EC הוכנו בחלק 1 ולהוסיף 2 מ"ל של תערובת GPEneo supernatant / Polybrene לתוך הבארות. חזור על אותו למחרת באמצעות תערובת טריה GPEneo supernatant / Polybrene הערה:. Polybrene משמשת כדי להפוך את הנקבוביות בקיר התא כדי להקל את הזיהום בחלקיקים הנגיפיים).
5. הסר את GPEneo תערובת supernatant / Polybrene למחרת, לשטוף את תאי פעמים עם PBS ולשמור את התאים במדיום הגידול המשתנים כל 3 ימים. לאחר המפגש, לפצל את התאים 01:02 על צלחות קולגן IV מצופות.
6. בדרך כלל, (cEND) קווי אנדותל מוחיים יציבים סלולריים יש לקבל כעבור 4-5 שבועות.

"> 3. טיפוח דואר תאי האנדותל כלי הדם במוח

1. הפשר את התאים מcryoaliquot באמבט מים והעברה ב15 מ"ל-פלקון עם 10 בינוניים מראש התחמם מ"ל.
2. צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG למשך 5 דקות בRT.
3. הסר בינוני, להעביר את הכדור בבקבוק קולגן IV המצופה T _{25 סנטימטרי} ² תא התרבות עם מדיום גידול מחומם מראש (צפיפות תאים לציפוי צריכה להיות לפחות 1x 10 ⁴ תאים / מ"ל).
4. שינוי בינוני למחרת ולאחר שהתאים הגיעו למפגש (בדרך כלל לאחר 5 ימים) לפצל את התאים.

4. פיצול תאי cEND (הערה: פיצול צריך להיעשות רק פעם בשבוע, יש להימנע מפיצול גבוה יותר מאשר 1:4).

1. הסר בינוני, לשטוף את התאים עם PBS.
2. הוסף 3 מ"ל של טריפסין-EDTA פתרון החם (Paa מעבדות) _{(75 סנטימטר} ² בקבוק T), דגירה על 37 מעלות צלזיוס ולחכות עד ששכבת תאים מפוזרת (בדרך כלל בתוך 5 עד 15 דקות).
3. הוסף 5 המ"ל oמדיום גידול f, פיפטה מעלה ומטה, ומעביר לבקבוק קולגן IV מצופה חדש.

5. הקפאת cEND התאים

1. השג את השעית התא כמתואר בשלב 4
2. צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG למשך 5 דקות בRT.
3. Resuspend תא הגלול (המתקבל מ ² _{סנטימטר} בקבוק 1 T ₇₅₎ במדיום הקפאת מ"ל 6 (95% צמיחה בינונית, 5% DMSO).
4. מחלק את השעית התא לארבע 1.5 המ"ל cryo-aliquots הערה:. Cryo-aliquot אחד יכול להיות seeded על ² _{סנטימטר} בקבוק T _25.
5. אחסן את-aliquots cryo תחת טמפרטורת אדי חנקן נוזלית.

cEND מדיום גידול: 450 המ"ל DMEM, 10% FCS, 10 מיליליטר L-גלוטמין, 2% MEM-קיט, 2% NEAA, פירובט 10 מיליליטר נתרן, 50 U / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין

6. נציג תוצאות

תאי cEND וcerebEND התאפיינו immunostainings של אנדותלnd BBB סמנים כמו גם על ידי מדידות של התנגדות transendothelial החשמלית (TEER) וחדירות. CEND וcerebEND היה מורפולוגיה דומה לתרבויות העיקריות של המוח ECs, עם monolayers של תאים מוארכים צפופים שהוצגו עיכוב גדילה במפגש. התאים בטאו רמות גם לגילוי של claudin-5, occludin וחלבוני VE-cadherin שהיו נקודות בצומת תאי תאים, כפי שמוצגות על ידי immunofluorescence (3 איור) ^4,5. תאי cEND culturing במדיום סרום מופחת הובילו לעלייה בTEER (מ 150 Ωcm ² בנוכחות של 10% בסרום עד 500 Ωcm ² בנוכחות של 2% סרום), שpotentiated על ידי התוספת של הידרוקורטיזון (800 Ωcm ²⁾ או אינסולין (1000 Ωcm ^{2) 4.} Monolayers של cEND תרבית במדיום סרום מופחת במשך 21 ימים היה TEER של 900 Ωcm ² (איור 4). TEER נמדד באמצעות הרכבההמכילים אלקטרודות נוכחי גניבה ומתח מדידה (מכשירי Precision עולם). לשם השוואה, כלי דם המוח העיקרי ECs דווח לי ערכי TEER של 200-600 Ωcm ² ושורת תאי עכבר זמינה מסחרי bEnd.3 היו ערכי TEER של 100-140 Ωcm ² (לסקירה האחרונה לראות אבוט 2005 וטות et אל., 2011 ^17,18). בנוסף, המעבר של מקרומולקולות, כגון שאינם טעון FITC-dextrans של המונים מולקולריים 4, 10, 70 ו 500 KDA, או fluorescein (300 דא) על פני monolayer של cEND ב2% בינוניים בידול FCS מעל 4 שעות היה ירידה לעומת תאי ביקורת מנוהלים במדיום גידול המכיל 10% FCS: שטף paracellular הופחת ל 30% מתאי בקרה לfluorescein, עד 26% לFITC-dextrans 10 ו 70 kDa, ושטף הופחת ל -4.5% מתאי בקרה לFITC Dextrtan-500 kDa. בדומה לTEER ערכים, החדירות היו ברמה הנמוכה ביותר בתאים בתרבית בנוכחות gluc⁴ ocorticoids (GC). במחקרים נוספים, זיהו את גני מטרת glucocorticoid, occludin, claudin-5 וVE-cadherin בהאנדותל כלי דם במוח ^4,7,9. טיפול GC הוביל לעלייה בביטוי של חלבונים אלו, והארגון מחדש של VE-cadherin לcytoskeleton. הרגולציה הישירה GC בתיווך של חלבונים ההדוקים הצומת occludin וclaudin-5 מופיעה דרך אלמנטי תגובה GC באזורי אמרגן ^4,7,19. בנוסף, claudin-5 זוהו כמטרת אסטרוגן רומן ^ב10 האנדותל בכלי דם.

בבסיס תפקוד האנדותל מחלות רבות ושונות. אנו תרבית cEND תחת חמצן / חסך (OGD) תנאי גלוקוז. OGD הוביל לשיבוש תפקוד BBB, שניתן לשחזר לאחר טיפול משולב עם GC והמעכב ¹² לקייד הפרוטאזום. תנאי OGD הביאו לעלייה חזקה בספיגת הגלוקוז ובביטוי של transpor גלוקוזters בcerebEND, אשר יכול להיות מוחלש על ידי התוספת של MK801, מעכב הלא תחרותי של NMDA קולטן ^13.

איור 1. מורפולוגיה של תאי מוח כלי דם (אנדותל cEND) בשבוע אחד אחרי בידוד. תמונות מיקרוסקופ אור נלקחה תחת (ב) הגדלת 6x () ו15x. מושבות האי נוצרו-של תאי האנדותל גלויות.

איור 2. מורפולוגיה של תאי אנדותל כלי דם במוח (cEND) חודש לאחר בידוד והנצחה. תמונות מיקרוסקופ אור נלקח תחת גדלת 15x. Monolayer מחובר, הומוגנית אנדותל תא ניתן לצפות.

איור 3. microvascul המוח הונצחתאי האנדותל ar מפורש claudin-5, occludin וVE-cadherin. תאי CEND גדלו על coverslips קולגן IV המצופה ומוכתמים בנוגדנים נגד claudin-5 (א), occludin (B) וVE-cadherin (C). התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ Axioscop2 Zeiss מתחת לעדשות 40X.

איור 4. מדידת ההתנגדות חשמלית transendothelial (TEER) של monolayer cEND. CEND גדלה על מסנני transwell IV מצופים קולגן (0.4 מיקרומטר גודל נקבובי). לאחר שהגיע למפגש, התאים נשמרו במדיום המכיל 2% FCS. TEER נמדד לאחר 7, 14 ו 21 ימים באמצעות הרכבה המכילה אלקטרודות נוכחי גניבה ומתח המדידה.

Discussion

ההליך המתואר יכול לשמש לבידוד של כלי הדם ECS מזנים שונים של עכברים, כמו גם מזנים שונים עקום החוצה עכברים כדי ללמוד את השינויים הספציפיים בתפקוד האנדותל בכלי דם. כדרך להנצחה הייתי שינוי עם oncoprotein של polyomavirus העכברי, אנטיגן T Polyoma האמצע. זה הופך את תאי האנדותל בשלה במהירות in vivo ו במבחנה ^20,21,22. שיטות אחרות להנצחה של ECs תוארו בספרות כוללות למשל הנצחה עם האנטיגן SV40 גדול T של וירוס Vacuolating קופי 40 ^23, גן ​​מוצר אדנווירוס ²⁴ E1A או ביטוי יתר של המקטע הקטליטית של telomerase האנושי ^3. ההנצחה עם PymT היא ספציפית לECs הבוסר העכברי, המאפשר קבלת תרבות EC הומוגנית מעכברים ילודים בזמן קצר. הנצחה משנה את התכונות של התאים והתוצאות שהושגו עם דואר שורות תאים הנציחו יש להשוות גם עם תאים ראשוניים או בניסויי in vivo בעכברים. PymT EC הונצח תואר להביע רמות גבוהות של פעילות fibrinolytic הנובעות מייצור מוגבר של urokinase סוג plasminogen activator וירידה בייצור של plasminogen activator ²⁵ מעכבים. השוואה ישירה של PymT הונצחה קו bEND5 תא עם ECS הראשונית עלה, כי הן במודלים חוץ גופיית BBB מתאימים גם ללימודי הידבקות תא T ^26.

שורות התאים הוקמו בהתאם לנוהל שתואר ניתן להשתמש במספר מעבר נמוך כדי לשמור על נכסי מכשול על ידי ביטוי גבוה של חלבוני junctional BBB ו-EC, כמו תאים מאבדים מאפיינים אלה במהלך ההזדקנות. לכן לאחר אובדן נכסי מכשול, ההכנה של שורת תאים חדשה צריכה להיחשב. צפיפות תאי ציפוי צריכה להיות גבוהה לECs, כמו זו היא קריטית לשגשוג תאים. זה יש לבחון במהלך הליך הבידוד, כמו גם תחזוקה של ECs הונצח. כל שורת תאים חדשה צריכה להיבדק על נכסי המכשול ולמזהמים אפשריים עם סוגי תאים אחרים. monolayers EC ניתן מוכתם בחומץ חלבון אנטי galactocerebroside, אנטי גליה fibrillary ואנטי חלק אנטיגן שרירים כמו נוגדנים ראשוניים שלא לכלול את הזיהום עם oligodendrocytes, האסטרוציטים וpericytes ^4,27. כדי לשלול זיהום על ידי מערכת כלי דם meningal, הביטוי של thrombomodulin ניתן לבדוק, שבא לידי ביטוי בכל ערוצי כלי הדם, למעט המוח ^28.

מעניין, את הקווים הנציחו כלי דם אנדותל התאים שאזורי מוח שונים נבדלים בתכונות וגם ברגישות שלהם לגירויי המכשול פרו דלקתיים. כדוגמה, שורות תאי המוח והמוח קטן cEND cerebEND ניתן לציין ^4,5. CerebEND הראה, בהשוואהלcEND, רמות ביטוי נמוכות יותר של רכיבי צומת ההדוקים העיקריים claudin-1 וoccludin. עם זאת, ברמות של claudin-3 ו -12 היו גבוהות יותר בcerebEND. תפקוד המחסום של תאי cerebEND סבל הרבה יותר תחת טיפול עם המתווך הדלקתי, TNFα ממאפייני המכשול של תאי cEND עשו ^5. פגיעות מוח קטנות יותר לגירויים דלקתיים, ניתן להבחין בחי בחולי טרשת נפוצה ובניסיוני מודל החיה שלה אוטואימונית Encephalomyelitis ^29. ממצאים מעניינים אלה עולים הצורך ביצירה ואפיון פרטני במודלים חוץ גופייה לאזורים שונים של מוח, על מנת לשפר את תרופת עתיד מיקוד לתוך המוח.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
שור אלבומין (BSA)	סיגמה אולדריץ	A7906	טוהר> 98%
קולגן IV	סיגמה אולדריץ	C5533	50 מיקרוגרם / מ"ל ​​בחומצה אצטית 50 מ"מ
Collagenase / Dispase	רוש	10269638001
המדיום של Dulbecco העדכון של הנשר (DMEM)	סיגמה אולדריץ	D5796
sulfoxide דימתיל (DMSO)	סיגמה אולדריץ	D2650
עוברי עגל בסרום (FCS)	מעבדות Paa	A15110-1333	ריכוז סופי של 10%, חום מומת (30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס)
L-גלוטמין	Biochrom AG	K0282	אחסון: ≤ -15 ° C
MEM Vitamine	Biochrom AG	K0373	אחסון: ≤ -15 ° C
Na-פירובט	Biochrom AG	L0473
נאומיצין (G418)	מעבדות Paa	P11-012
חומצות האמין שאינם חיוניות (רח"ל)	Biochrom AG	K0293	אחסון ב 4 ° C
Penicilin / סטרפטומיצין	Biochrom AG	A2212	אחסון: ≤ -15 ° C
נאגר מלוח פוספט (PBS)	Biochrom AG	L1825
Polybrene (hexadimethrine רומיד)	סיגמה אולדריץ	107689	0.8 מ"ג / מ"ל ​​ב PBS, אחסון ב -20 ° C
Puromycin	סיגמה אולדריץ	P8833
טריפסין / EDTA	Biochrom AG	L1825	0.05%, 0.02% EDTA ב PBS