Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Özet

Bu yöntem, fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek ve ölümsüzleştirmek açıklamaktadır. Biz beyin dokusu, sindirim adımları, tohumlama ve hücre ölümsüzlük ve homojenizasyon başlayarak adım adım protokol açıklar. Genellikle, homojen, ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hattı elde etmek için yaklaşık beş hafta sürer.

Özet

Epitel ve endotel hücreleri (EC) dış ve iç ortamdan dokusunun korunmasına paracellular bariyerler inşa ediyoruz. AK oluşan kan-beyin bariyeri (KBB), astrosit sonu ayaklar, perisitten ve bazal membran beyin parankimi korunması ve homeostazı sorumludur. Vitro BBB modellerinde BBB yapısı ve fonksiyonunu araştırmaya ortak araçlardır Hücresel düzeyde. Vitro BBB modelleri farklı önemli bir kısmı bugüne kadar farklı laboratuarlarda araştırma için kurulmuştur. Genellikle, hücrelerin, inek, domuz, sıçan veya fare beyin dokusu (Wilhelm ve diğerleri tarafından gözden ayrıntılı olarak tartışılmıştır. ¹⁾ 'den elde edilmiştir. İnsan doku örnekleri laboratuarlarda veya şirketler ^2,3 kısıtlı sayıda kullanılabilir. Primer hücre hazırlıklar zaman alıcıdır ve AK kültürlerin partiden partiye farklılık da, kurulması AK lin ölümsüzleştirdies bilimsel ilgi odağıdır.

Burada, yenidoğan fare beyin bir ölümsüzleştirdi beyin mikrovasküler AK hattı kurulması için bir yöntem mevcut. Biz reaktifler ve çözümler kullanılan prosedürü adım adım listesi açıklanmaktadır. Bizim laboratuvar tarafından kurulan yöntemi dört ila beş hafta içinde homojen ölümsüzleştirdi endotelyal hücre hattının izolasyonu sağlar. Beyin mikrovasküler endotel hücre hatları cEND ⁴ olarak adlandırılan (serebral korteks) ve ⁵ (serebellar korteks) cerebEND, Förster laboratuvarda bu prosedüre göre izole edildi ve etkili BBB farklı fizyolojik ve patolojik süreçlerin açıklanması için kullanılmıştır. CEND ve cerebEND kullanarak biz bu hücrelerin glukokortikoid ^4,6-9 yanıt ve gibi TNF ^5,8 gibi pro-infammatory mediatörlerin yanı östrojen tedavisi ¹⁰ olduğunu göstermiştir. Ayrıca, biz birden sc patoloji inceledikyi amaçladık ¹¹ ve AT-düzeyde hipoksi ^12,13. CEND ve cerebEND hatları lenfositler veya kanser hücreleri ile AK farklı uyaranlara veya etkileşim EC ve BBB, hücresel cevaplarının yapısı ve işlevi incelemek için iyi bir araç olarak kabul edilebilir.

Protokol

1. Beyin mikrodamar İzolasyonu

1. Her hazırlanması için iki cinsiyetten beş-on yenidoğan farelerin (3-5 günlük) kullanın.
2. Lokal IACUC / veteriner önerilerine uygun olarak, bir fare Euthanize, hemen beyin kaldırmak ve aşağıdaki çözeltisi içeren bir Petri kabı içine devri: 15 mM Hepes (pH 7.4), 153 mM NaCI, 5.6 mM KCI, 2.3 mM _CaCI2 x ₂ 2H O, 2,6 _mM MgCl2 x 6H ₂ O,% 1 (w / v) BSA (bundan sonra tampon A olarak anılacaktır).
3. Aksi belirtilmedikçe, tüm izolasyon prosedürler laminer akış başlık altında oda sıcaklığında (RT), (22-24 ° C) sıcaklıkta yapılmalıdır. Tampon içinde, beyincik ve kılcal fragmanlarının giderme sonra, beyin (beyincik ve beyin sapı olmadan beyin) kesin bir steril bir bisturi ile. Doku kadar parçaladı pipet ve aşağı hiçbir kümeleri görünür kadar bir 10 ml pipet kullanarak. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 xg'de 50 ml Falcon tüp ve santrifüj içine süspansiyon aktarın.

Not: zarları beyin dokusu yüzeyinde ince, şeffaf bir membran gibi tespit edilebilir. Bunlar dikkatle steril forseps ile temizlenebilir.

4. Süpernatantı atın.
5. 4.5 ml tampon içinde çözülür pelet A% 0.75 1,5 ml (w / v) ile kolajenaz / dispase (Roche) ve 37 dakika 45 ° C su banyosu içinde (bazen sallama) için inkübe edilir.
6. Bu arada, kolajen IV (0.1 mg / 50 mM asetik asit içerisinde çözülmüş mi) ile kaplama dört kuyu ile 12 oyuklu plakalar hazırlanır. 1 saat boyunca bağlı kalmanıza olanak sağlar.
7. 15 ml buz gibi soğuk tampon A süspanse iyice pelet ilavesi ile sindirim durdurun.
8. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g süspansiyon santrifüjleyin.
9. Süpernatantı atın.
10. Miyelin kaldırmak için, 4 ° C'de 20 dakika süre ile 1000 x g 10 ml% 25 (w / v) BSA (Sigma, saflık>% 98) ve santrifüj eklemek % 25 BSA, 1 x PBS (PAA Laboratories) içinde çözüldü ve 0.2 um f süzülmesi gerekmektedirilter).
11. Süpernatant dikkatlice atın, 10 ml Tampon A pelet çözülür ve yeni bir Falcon tüp transfer.
12. RT az 5 dakika boyunca 250 xg'de süspansiyon santrifüjleyin. Elde edilen pelet, endotel hücreleri içerir.
13. PBS ile iki kez IV kollajen kaplı 12-plaka yıkayın.
14. Iki kuyular, her bir kuyucuğa 2 ml içine 4 ml büyüme ortamı (DMEM% 10 FCS, 50U/ml penisilin / streptomisin,% 1 L-glutamin içeren) ve plaka, hücre süspansiyonu içinde pellet yeniden süspanse edin. 37. az 45 dakika için 4 ug / ml ile inkübe bir nihai konsantrasyon ° bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde C puromisin ekleyin. Bu adım, hızla yapışması hücrelerin çıkarılmasını sağlar Not:. Puromisin 24 saat boyunca ilave edilir. Sadece beyin EC diğer hücre türleri için puromisin ¹⁴ toksiktir, metabolize olabilir.
15. Iki taze kuyular (bu kuyulardan AK fraksiyonu içeren) içine adım 1.14 dışı yapıştırılmış hücreleri içeren 2 ml orta aktarın. Ste gelen yapıştırılır hücreleri ile kuyu doldurunp 2 ml taze orta (bu kuyulardan diğer hücre türleri, örneğin fibroblastlar, astrositler içerir ve paralel büyüdü ve morfolojisinin karşılaştırmalar için de kullanılabilir) ile 1.14.
16. Ertesi gün orta değiştirin.

2. Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde ölümsüzleştiren

1. GP + E-86 Neo (GPENeo) ^15, fibroblastlar, salgılayan,% 10 ısı ile aktifliği giderilmiş FCS, 50U/ml penisilin / streptomisin, ve 2 mg / ml G418 (ihtiva eden DMEM ortamı içinde Polyoma orta T onkogen ile bir replikasyon-eksikliği virüs yetiştirmek . jelatin kaplı şişeler içinde PAA Laboratories) Not: Polyoma orta T onkogen transfeksiyondan 4-6 hafta kültüre endotel hücrelerinin morfolojisi olan bir tek tabaka, homojen olmayan bir yol açan-ECS EC üzerinde bir büyüme avantajı neden olur. GPENeo piyasada mevcut değildir ve (özgün yayınlar için ^4,16 bakınız) paylaşılan ortak malzeme olarak elde edilebilir.
2. Için virüs içeren bir ortamda kullanmak ölümsüzlük, 24 saat boyunca G418 serbest ortamda GPENeo hücreleri yetiştirmek.
3. GPEneo süpernatan, 10 ml çıkarın ve 8 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona Polybrene (hexadimethrine bromür) (Sigma) eklenir, hücre parçaları ortadan kaldırmak için filtre aracılığıyla steril 0.45 mikron.
4. Bölüm 1 'de hazırlanan EC kültürlerden büyüme ortamı çıkarın ve kuyulara GPEneo süpernatan / Polybrene karışım 2 ml ekleyin. Bir taze GPEneo Polybrene / süpernatant karışımının kullanılması ile bir sonraki gün tekrarlayın Not:. Polybrene viral partiküller) ile enfeksiyon kolaylaştırmak için hücre duvarı içinde gözenekler yapmak için kullanılır.
5. GPEneo süpernatant / Polybrene karışım ertesi gün çıkarın, PBS ile iki kere yıkayın hücrelerini ve her 3 günde bir değiştirilmesi büyüme ortamında hücreleri korumak. Izdiham üzerine, kollajen IV kaplı plakalar üzerinde hücrelerinin 01:02 bölün.
6. Tipik olarak, istikrarlı serebral endotel (cEND) hücre hatları 4-5 hafta sonra alınmalıdır.

e "> 3. Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde yetiştirilmesi

1. 10 ml önceden ısıtılmış ortam ile 15 ml Falcon-su banyosu içinde ve transfer cryoaliquot gelen hücreleri çözülme.
2. RT az 5 dakika boyunca 250 xg'de süspansiyon santrifüjleyin.
3. Ortamı çıkarın (kaplama için hücre yoğunluğu en az 1x 10 ⁴ hücre / ml olmalıdır) önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile kollajen IV kaplamalı T _{25 cm} ² hücre kültürü şişesi içinde pelet aktarın.
4. Ertesi gün orta değiştirin ve hücrelerin birleştiği ulaştıktan sonra (genellikle 5 gün sonra) hücreleri bölme.

4. CEND-hücrelerinin Yarma (Not: Yarma sadece haftada bir kez Yapılmalıdır, 1:4 daha yüksek Yarma kaçının).

1. , Orta kaldır PBS ile hücreleri yıkayın.
2. 37 inkübe sıcak tripsin-EDTA çözeltisi (PAA Laboratories) (T _{75 cm} ² balon), 3 ml ekleyin ° C ve hücre tabakası (genellikle 5 ila 15 dakika içinde) lana kadar bekleyin.
3. 5 ml o eklemef büyüme, orta ve aşağı yukarı pipetle, ve IV kaplı şişesi yeni kollajen transfer.

5. CEND-hücrelerinin dondurulması

1. Adım 4'te tarif edildiği gibi hücre süspansiyonu elde edilir
2. RT az 5 dakika boyunca 250 xg'de süspansiyon santrifüjleyin.
3. 6 ml dondurma ortamına (% 95 büyüme ortamı,% 5 DMSO) içinde hücre peleti (1 T _{75 ^cm2} şişeye elde edildi) yeniden süspanse edin.
4. . One kriyo-kısım T _{25 cm} ² balon üzerine numaralı seribaşı olabilir: Dört 1.5 ml'lik kriyo-alikotları Not içine hücre süspansiyonu bölün.
5. Sıvı azot buharında sıcaklık altında kriyo-alikotları saklayın.

450 ml DMEM,% 10 FCS, 10 ml L-glutamin,% 2 MEM-Kit,% 2 NEAA, 10 ml sodyum piruvat, 50 U / ml penisilin / streptomisin: büyüme ortamı cEND

6. Temsilcisi Sonuçlar

CEND ve cerebEND hücrelerin endotel a immunostainings ile karakterize edildind BBB transendothelial elektriksel direnci (Teer) ve geçirgenlik ölçümleri ile yanı sıra markers. CEND ve cerebEND izdiham büyüme inhibisyonu sergilenen sıkışık uzamış hücre mono tabakaları ile beyin EC primer kültürlerinde, benzer bir morfoloji vardı. Hücreleri gibi immunofloresan (Şekil 3) ^4,5 ile gösterildiği gibi hücre-hücre birleşme lokalize Claudin-5, occludin ve VE-cadherin proteinlerin kadar, algılanabilir bir seviyeleri ifade edilmiştir. Serum azaltılmış ortamda kültüre cEND hücreleri Teer bir artışa (Ωcm ² 150 dan% 2 serum varlığında 500 Ωcm ^{2 ila%} 10 serum varlığında) hidrokortizon ilave potansiyalize edildi (800 Ωcm yol açmıştır ²⁾ veya insülin (1.000 Ωcm ^{2) 4.} 21 gün için serum azaltılmış bir ortamda kültürlenen cEND tek katmanlarını olan 900 Ωcm ² (Şekil 4) Teer. Teer bir montaj kullanılarak ölçüldüiçeren akım geçen ve gerilim ölçme elektrotları (Dünya Hassas Aletler). Karşılaştırma için, birincil mikrovasküler beyin EC Ωcm ² ve piyasada satılan bir fare hücre hattı bEnd.3 Abbot 2005 ve Toth ve ark görmek son değerlendirme için 100-140 Ωcm ² (of Teer değerleri vardı 200-600 arasında Teer değerleri rapor edilmiştir ark., 2011 ^17,18). Buna ek olarak, 4 saat boyunca bu gibi şarjlı olmayan moleküler kütleleri 4, 10, 70 ve 500 kDa FITC-dekstran, veya% 2 FCS türev ortam içinde cEND bir tek tabaka boyunca fluoresein (300 Da) gibi makromoleküller, ve geçiş azalmıştır % 10 FCS içeren büyüme ortamında tutulan kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında: paracellular akı FITC-dekstran 10 ve 70 kDa için% 26, floresein kontrol hücrelerin% 30 düşürüldü ve akı FITC için kontrol hücrelerin% 4,5 'e düşmüştür -dextrtan 500 kDa. Değerleri Teer benzer şekilde, geçirgenlik gluc varlığında kültüre hücrelerinde düşük olduğu görüldüocorticoids (GC) ^4. Daha sonraki çalışmalarda, biz glukokortikoid hedef gen, occludin, Claudin-5 ve beyin damar endoteli ^4,7,9 bölgesindeki VE-cadherin belirlenmiştir. GC tedavi, bu proteinlerin ekspresyonunda bir artışa ve hücre iskeleti ile VE-cadherin yeniden düzenlenmesine yol açtı. Sıkı kavşak proteinlerin occludin ve Claudin-5 doğrudan GC-aracılı yönetmelik kendi promotor bölgelerinde ^4,7,19 GC yanıt elemanları aracılığıyla görünür. Ayrıca, Claudin-5 vasküler endotel ¹⁰ bir roman östrojen hedef olarak tespit edilmiştir.

Endotel disfonksiyonu altında yatan pek çok farklı hastalıklar. Oksijen / glikoz yoksunluğu (OGD) koşullar altında cEND kültüre. OGD GC ve proteazom inhibitörü bortezomib ¹² ile kombine tedavi sonrası tekrar oluşturulabilmektedir BBB fonksiyonunun bozulmasına yol açtı. OGD koşullarda glukoz alımını güçlü bir artışa yol açmıştır ve glikoz Taşıma ifadesindemk801, NMDA-reseptörü ¹³ bir rekabetçi olmayan inhibitör ilavesiyle zayıflatılmış olabilir cerebEND içinde ters.

Şekil 1. Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cEND) izolasyon bir hafta sonra. Işık mikroskopisi resim morfolojisi 6x (A) ve 15x (B) büyütme altında alınmıştır. Endotel hücreleri ada oluşan koloniler görebilir.

Şekil 2. Izolasyon ve ölümsüzlük sonra beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cEND) Morfoloji bir ay. Işık mikroskobu fotoğrafları 15x büyütme altında alınmıştır. Bir birleşik, homojen endotel hücre monolayer görülebilir.

Şekil 3,. Ölümsüzleştirdi beyin microvascular endotel hücreleri ekspres Claudin-5, occludin ve VE-kaderin. CEND hücreleri kollajen IV kaplı lamelleri yetişen ve Claudin-5 karşı antikorlar (A), occludin (B) ve VE-kaderin (C) ile boyandı. Görüntüler 40x büyütme altında bir Zeiss Axioscop2 mikroskop kullanılarak alınmıştır.

Şekil 4. CEND monolayer. CEND arasında transendothelial elektriksel direncinin ölçülmesi (Teer) IV kollajen kaplı transwell filtreler (gözenek boyutu 0,4 mikron) üzerinde yetiştirilmiştir. Izdiham ulaştıktan sonra, hücreler,% 2 FCS ihtiva eden ortam içinde muhafaza edildi. Teer akım geçen ve gerilim ölçme elektrotları içeren bir derleme kullanarak 7, 14 ve 21 gün sonra ölçüldü.

Tartışmalar

Burada tarif edilen prosedür vasküler endotelyum fonksiyon olarak belirli değişiklikler incelemek için çeşitli fare suşlarının yanı sıra farklı knock-out fare suşları AK haplarına reçetesiz mikrovasküler izolasyonu için de kullanılabilir. Ölümsüzleşme için bir yöntem olarak, mürin polyomavirus, Polyoma orta T antijen onkoprotein ile dönüşüm kullanılır. Bu, in vivo ve in vitro ^20,21,22 hızla olgunlaşmamış endotel hücreleri dönüştürür. Literatürde tanımlanan EC arasında ölümsüzleşme diğer yöntemler, örneğin SV40 büyük Simian Virüs Vacuolating T antijen 40 ^23, adenovirüs E1 gen ürün ²⁴ ya da insan telomeraz ^3'ün katalitik alt birimi aşırı ekspresyonu ile ölümsüzleşme içerir. PymT ile ölümsüzleşme kısa bir süre içinde neonatal fareden homojen bir AT kültürü elde olanak mürin olgunlaşmamış EC için spesifiktir. Ölümsüzleşme hücreleri ve inci özelliklerini değiştirirölümsüzleştirilmiş hücre hatları ile elde edilen sonuçlar e birincil hücreler ile birlikte ya da fareler, in vivo deneyler ile ya da karşılaştırılması gerekmektedir. PymT ölümsüzleştirdi AT ürokinaz tipi plazminojen aktivatörü artan üretiminden kaynaklanan fibrinolitik aktivite yüksek düzeyde ifade açıklanan ve plazminojen aktivatör inhibitörleri ²⁵ üretimi azalmıştır. PymT Doğrudan karşılaştırma vitro BBB modellerinde hem de T hücre adezyonu çalışmalarında ²⁶ için uygun olduğunu ortaya ilköğretim bEND5 hücre hattı, AK haplarına reçetesiz ölümsüzleştirdi.

Tarif edilen prosedüre göre tespit hücre hatları hücreler yaşlanma sırasında bu özellikleri kaybederse, bbb ve EC kavşak proteinlerin yüksek ekspresyonu ile bariyer özelliklerini korumak için düşük geçiş sayısını da kullanılabilir. Böylece bariyer özellikleri kaybından sonra, yeni bir hücre çizgisinin hazırlanması dikkate alınmalıdır. Hücre kaplama yoğunluğu bu hücre proliferasyonu için kritik olduğu gibi, EC için yüksek olmalıdır. Bu da ölümsüzleştirilmiş EC bakımı gibi izolasyon prosedürü sırasında dikkate alınmalıdır. Her yeni hücre hattı olan bariyer özellikleri ve diğer hücre türleri ile olası kirleticiler için test edilmelidir. AK monolayers oligodendrosit, astrositler ve perisitlere ^4,27 ile kontaminasyon dışlamak için primer antikor olarak anti-galactocerebroside, anti-glial fibriler asidik protein ve anti-düz kas antijeni ile lekeli olabilir. Meningal damar tarafından kontaminasyona ekarte etmek için, trombomodülin ifadesi beynin ²⁸ hariç tüm vasküler yataklarda ifade edildiği, test edilebilir.

İlginçtir, beynin farklı bölgelerinde izole ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hatları pro-inflamatuar uyaranlara kendi bariyer özellikleri ve duyarlılıkları farklıdır. Bir örnek olarak, beyin cEND ve serebellar cerebEND hücre çizgileri ^4,5 söz edilebilir. CerebEND karşılaştırıldığında gösterdi, başlıca bileşenler sıkı birleşim Claudin-1 ve occludin daha düşük seviyelerde ifade cEND için. Bununla birlikte, Claudin-3 ve -12 seviyeleri cerebEND daha yüksek bulunmuştur. CerebEND hücrelerin bariyer fonksiyonunun cEND hücrelerinin bariyer özellikleri ⁵ mi daha TNFa iltihaplı aracı ile tedavi altında, çok daha fazla acı. Inflamatuar uyaranlara Yükseköğretim serebellar açığı, multipl skleroz hastalarında ve ensefalomiyelit ²⁹ otoimmün onun hayvan modelinde deneysel in vivo olarak görülebilir. Bu ilginç bulgu beyin içine hedefleme gelecek ilaç geliştirilmesi için, üretim ve beynin farklı bölgelerinde için in vitro model içinde bireysel karakterize gerektiğini göstermektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sığır serum albümini (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Saflık>% 98
kollajen IV	Sigma-Aldrich	C5533	50 mM asetik asit içerisinde 50 ug / ml
Kollajenaz / dispase	Roche	10269638001
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Fötal Buzağı Serumu (FCS)	PAA Laboratuvarlar	A15110-1333	nihai konsantrasyon% 10 ısı ile inaktive edilmiş (30 dakika, 56 ° C)
L-glutamin	Biochrom AG	K0282	Depolama: ≤ -15 ° C
MEM Vitamin	Biochrom AG	K0373	Depolama: ≤ -15 ° C
Na-piruvat	Biochrom AG	L0473
Neomisin (G418)	PAA Laboratuvarlar	P11-012
Sigara esansiyel amino asitler (NEA)	Biochrom AG	K0293	4 at Depolama ° C
Penisilin / Streptomisin	Biochrom AG	A2212	Depolama: ≤ -15 ° C
Fosfat salin (PBS) tamponlu	Biochrom AG	L1825
Polybrene (hexadimethrine bromür)	Sigma-Aldrich	107689	PBS içinde 0.8 mg / ml, -20 ° C'de saklama
Puromisin	Sigma-Aldrich	P8833
Tripsin / EDTA	Biochrom AG	L1825	% 0.05, PBS içinde% 0.02 EDTA