Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sangue Cérebro Modelo Barreira

Resumo

Este método descreve como isolar e imortalizar células endoteliais microvasculares de cérebro de rato. Descreve-se um protocolo de passo-a-passo a partir da homogeneização do tecido cerebral, as etapas de digestão, a semeadura e imortalização das células. Normalmente, leva cerca de cinco semanas, para se obter uma homogeneidade, linha celular imortalizada microvascular endotelial.

Resumo

As células epiteliais e endoteliais (CE) são a construção de barreiras paracelular que protegem o tecido a partir do ambiente externo e interno. A barreira hemato-encefálica (BHE), constituído por CE, astrócitos finais pés, pericitos e a membrana basal é responsável pela protecção e homeostase do parênquima cerebral. Modelos in vitro BBB são ferramentas comuns para o estudo da estrutura e função da BHE a nível celular. Um número considerável de diferentes modelos in vitro BBB foram estabelecidos por pesquisa em diferentes laboratórios até à data. Normalmente, as células são obtidas a partir de bovinos, suínos, rato ou ratinho tecido cerebral (discutido em detalhe na revisão por Wilhelm et al. ^1). Amostras de tecido humano estão disponíveis apenas em um número restrito de laboratórios ou empresas ^2,3. Embora as preparações de células primárias são demorados e as culturas de EC pode variar de lote para lote, o estabelecimento de imortalizada CE lines é o foco de interesse científico.

Aqui, apresentamos um método para estabelecer um imortalizado cérebro microvascular linha CE do cérebro de rato neonatal. Descreve-se o procedimento de listagem passo-a-passo a reagentes e soluções utilizados. O método estabelecido pelo nosso laboratório permite o isolamento de uma linha celular imortalizada endotelial homogénea dentro de 4-5 semanas. As linhas de células cerebrais microvasculares endoteliais denominado CEND ⁴ (a partir de córtex cerebral) e cerebEND ⁵ (a partir de córtex cerebelar), foram isolados de acordo com este procedimento no laboratório Förster e têm sido eficazmente utilizados para explicação de diversos processos fisiológicos e patológicos no BBB. Usando CEND cerebEND e demonstrámos que as células respondem a glucocorticóides ^4,6-9 e estrogénio-tratamento ^10, bem como a pró-infammatory mediadores, tais como TNFalfa ^5,8. Além disso, estudou-se a patologia de múltiplas sclerosis ¹¹ e hipóxia ^12,13 na CE-nível. O CEND e linhas cerebEND pode ser considerado como uma boa ferramenta para o estudo da estrutura e função das respostas celulares, BBB de ECs a diferentes estímulos ou interacção da CE com linfócitos ou células cancerosas.

Protocolo

1. Isolation of Brain microvasos

1. Para cada preparação utilizar 5-10 ratinhos neonatais de ambos os sexos (3-5 dias de idade).
2. Euthanize um rato de acordo com locais IACUC / veterinário recomendações, remover o cérebro imediatamente, e transferir para um prato de Petri contendo a solução seguinte: 15 mM de Hepes (pH 7,4), 153 mM de NaCl, 5,6 mM de KCl, 2,3 mM CaCl ₂ x 2H ₂ O, 2,6 mM MgCl ₂ x 6H ₂ O, 1% (w / v) BSA (daqui em diante referido como tampão A).
3. Salvo indicação em contrário, todos os procedimentos de isolamento deve ser efectuado à temperatura ambiente (RT) (22-24 ° C), sob a câmara de fluxo laminar. Cortar o cérebro (cérebro sem cerebelo e tronco cerebral), após remoção das meninges e fragmentos capilares, em tampão A, utilizando um bisturi esterilizado. Pipetar o tecido fragmenta cima e para baixo usando uma pipeta de 10 ml até não aglomerados aparecer. Transferir a suspensão para um tubo Falcon de 50 ml e centrifugar a 250 xg durante 5 min à TA.

Nota: Meninges pode ser identificado como membranas finas, transparentes na superfície do tecido cerebral. Eles podem ser removidos cuidadosamente com uma pinça estéril.

4. Descartar o sobrenadante.
5. Dissolve-se o sedimento em 4,5 ml de tampão A com 1,5 ml de 0,75% (w / v) de colagenase / dispase (Roche) e incubar durante 45 min a 37 ° C num banho de água (ocasionalmente agitação).
6. Ao mesmo tempo, preparar as placas de 12 poços por revestimento de quatro poços com colagénio IV (0,1 mg / ml dissolvido em 50 mM de ácido acético). Deixa-se aderir durante 1 hora.
7. Parar a digestão através da adição de 15 ml de tampão gelado A. Ressuspender o pellet cuidadosamente.
8. Centrifugar a suspensão a 250 xg durante 10 min a RT.
9. Descartar o sobrenadante.
10. Para remover a mielina, adicionam-se 10 ml de 25% (w / v) de BSA (Sigma, pureza> 98%) e centrifuga-se a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. 25% de BSA deve ser dissolvido em 1x PBS (PAA Laboratories) e filtrada através de 0,2 f ^ Milter).
11. Cuidadosamente descarte do sobrenadante, dissolve-se o sedimento em 10 mL de tampão A e transferir para um tubo Falcon novo.
12. Centrifugar a suspensão a 250 xg durante 5 min à TA. O sedimento resultante contém as células endoteliais.
13. Lavar duas vezes o colagénio IV revestido placa de 12 poços com PBS.
14. Ressuspender o sedimento em 4 ml de meio de crescimento (DMEM contendo FCS a 10%, 50U/ml de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina) e de placa de suspensão celular em dois poços, 2 ml em cada poço. Adicionar a puromicina a uma concentração final de 4 | ig / ml e incubar durante 45 min a 37 ° C numa incubadora de cultura de células. Este passo permite a remoção de células aderentes rapidamente Nota:. Puromicina é adicionado, durante 24 horas. Apenas o cérebro ECs podem metabolizá-la, para outros tipos de células puromicina é tóxico ^14.
15. Transferir o meio de 2 ml, contendo células não aderentes a partir da etapa 1,14 em dois poços frescas (estes poços contêm a fracção CE). Encher os poços com células aderidas de step 1,14 com 2 ml de meio fresco (estes poços conter outros tipos de células, por exemplo, f ibroblastos, astrócitos e podem ser cultivadas em paralelo e utilizado para comparação da morfologia).
16. Alterar o meio no dia seguinte.

2. Imortalizando o cérebro células endoteliais microvasculares

1. Cultivar a GP + E-86 (Neo GPENeo) ¹⁵ fibroblastos, que segregam um vírus deficiente em replicação com polioma oncogene T em meio DMEM contendo 10% de FCS inactivado pelo calor, 50U/ml de penicilina / estreptomicina e 2 mg / ml de G418 ( . PAA Laboratories) em frascos revestidos de gelatina Nota: Polyoma meio de transfecção oncogene T faz com vantagem o crescimento de células endoteliais sobre os não-CEs que conduz a uma monocamada homogénea de células com morfologia endotelial 4 a 6 semanas de cultura. GPENeo não estão disponíveis comercialmente e pode ser obtido como material público compartilhado (consulte publicações originais ^4,16).
2. Para usar o meio contendo vírus para imortalização, cultivar as células GPENeo em meio isento de G418 por 24 h.
3. Remover 10 ml do sobrenadante e adicionar GPEneo Polybrene (brometo Hexadimetrina) (Sigma) a uma concentração final de 8 mg / ml, esterilizar por filtro de 0,45 um para remover os fragmentos celulares.
4. Remover o meio de crescimento das culturas da CE preparados na Parte 1 e juntar 2 ml de sobrenadante GPEneo mistura / Polybrene nas cavidades. Repetir no dia seguinte utilizando um fresco GPEneo mistura sobrenadante / Polybrene Nota:. Polybrene é usado para fazer os poros na parede da célula para facilitar a infecção com as partículas virais).
5. Remover o sobrenadante GPEneo mistura / Polybrene no dia seguinte, lava-se as células duas vezes com PBS e manter as células em meio de crescimento em mudança a cada 3 dias. Após confluência, as células divididas 1:2 no colagénio IV placas revestidas.
6. Tipicamente, estáveis ​​endoteliais cerebrais linhas (CEND) células devem ser obtidas 4-5 semanas mais tarde.

e "> 3. Cultivando as células cerebrais microvasculares endoteliais

1. Descongelar as células de cryoaliquot em banho de água e transfere-se 15 ml-Falcon com 10 ml de meio de pré-aquecido.
2. Centrifugar a suspensão a 250 xg durante 5 min à TA.
3. Remover meio, transferir o sedimento em a revestido de colagénio IV T _{25 ^cm2} frasco de cultura de células pré-aquecida com meio de crescimento (densidade celular para revestimento deve ser de pelo menos 1 x 10 ⁴ células / ml).
4. Alterar meio no dia seguinte e depois de as células alcançaram a confluência (normalmente após 5 dias) dividir as células.

4. A divisão de células-CEND (Nota: A divisão deve ser feita apenas uma vez por semana, evitar a divisão Superior 1:4).

1. Remover meio, lavar as células com PBS.
2. Adicionar 3 ml de tripsina-EDTA aquecido solução (PAA Laboratories) (T _{75 ^cm2} do frasco), incubar a 37 ° C e esperar até que as células da camada é dispersa (geralmente dentro de 5 a 15 min).
3. Adicionar 5 ml omeio de crescimento f, pipetar cima e para baixo, e transferir para um novo colágeno IV revestido frasco.

5. A congelação das células CEND

1. Obter a suspensão de células, tal como descrito no passo 4
2. Centrifugar a suspensão a 250 xg durante 5 min à TA.
3. Ressuspender o sedimento de células (obtidas a partir de 1 _{75 centímetros} T ² frasco) em 6 ml de meio de congelação (95% de meio de crescimento, 5% DMSO).
4. Dividir a suspensão de células em 1,5 ml de quatro crio-se alíquotas Nota:. Uma alíquota de crio-podem ser semeadas no frasco T _{25 cm} ^2.
5. Armazenar os crio-alíquotas sob vapor de nitrogênio líquido a temperatura.

CEND meio de crescimento: 450 ml de DMEM, FCS a 10%, 10 ml de L-glutamina, 2% de MEM-Kit, 2% de NEAA, 10 piruvato natrium ml, 50 U / ml de penicilina / estreptomicina

6. Resultados representativos

As células CEND cerebEND e foram caracterizados por imunomarcações de um endotelialnd BBB marcadores, bem como por meio de medições de resistência eléctrica transendotelial (TEER) e permeabilidade. O CEND cerebEND e tinha uma morfologia semelhante à de culturas primárias de cérebro ECs, com as monocamadas de células compactadas alongadas que exibiram inibição de crescimento a confluência. As células expressaram níveis detectáveis ​​de bem claudina-5 occludin e VE-caderina proteínas que estavam localizados nas junções célula-célula, como se mostra por meio de imunofluorescência (Figura 3) ^4,5. A cultura de células em soro CEND reduzida meio conduziu a um aumento na TEER (de 150 Ωcm ² na presença de 10% de soro a 500 Ωcm ² na presença de 2% de soro), que foi potenciada pela adição de hidrocortisona (800 Ωcm ^2), ou a insulina (1.000 Ωcm ^{2) 4.} As monocamadas de CEND cultivadas em soro reduzido, médio, durante 21 dias teve TEER de 900 Ωcm ² (Figura 4). TEER foi medida utilizando um conjuntocontendo eletrodos atual passes e tensão de medição (Instrumentos de Precisão mundo). Para comparação, o primário microvascular cerebral ECs tem sido relatada a ter valores de TEER 200-600 Ωcm ² e uma linha celular de ratinho comercialmente disponíveis bEnd.3 tinham valores de TEER 100-140 Ωcm ² (para revisão recente veja Abbot 2005 e Toth et al., 2011 ^17,18). Além disso, a passagem de macromoléculas, tais como a não-carregada de FITC-dextrano de massas moleculares 4, 10, 70 e 500 kDa, ou de fluoresceína (300 Da) através da monocamada de CEND em meio de 2% de FCS a diferenciação ao longo de 4 horas foi reduzida em comparação com as células de controlo mantidas em meio de crescimento contendo FCS a 10%: fluxo paracelular foi reduzida para 30% das células de controlo para a fluoresceína, a 26% para FITC-dextrano 10 e 70 kDa, e de fluxo foi reduzido para 4,5% de células de controlo de FITC -dextrtan 500 kDa. Semelhante a TEER valores, a permeabilidade era no nível mais baixo, em que as células cultivadas na presença de glicocorticoids ⁴ (GC). Em outros estudos, identificamos os genes alvo de glicocorticóides, occludin, claudina-5 e VE-caderina no endotélio vascular cerebral ^4,7,9. GC tratamento conduziu a um aumento na expressão destas proteínas e para o rearranjo de VE-caderina com o citoesqueleto. O regulamento GC-mediada direta da junção apertada proteínas occludin e claudina-5 aparece através de elementos de resposta GC em suas regiões promotoras ^4,7,19. Além disso, claudina-5 foi identificado como um alvo em estrogénio novel vascular endotélio ^10.

Endoteliais subjacente disfunção muitas doenças diferentes. Nós cultivadas sob o CEND oxigênio / glicose privação (POG) condições. OGD levou à interrupção da função BBB, o que pode ser reconstituído após o tratamento combinado com o inibidor de proteassoma GC e bortezomib ^12. OGD condições levou a um forte aumento da captação de glicose e na expressão de Transpor glucoseters em cerebEND, que pode ser atenuado pela adição de MK801, um inibidor não competitivo de NMDA do ^receptor-13.

Figura 1. Morfologia das células endoteliais microvasculares cerebrais (CEND) uma semana após o isolamento. Imagens de microscopia de luz foram tomadas sob a 6x (A) e 15x de ampliação (B). As colónias formadas ilha de células endoteliais são visíveis.

Figura 2. Morfologia do cérebro células endoteliais microvasculares (CEND) um mês após o isolamento e imortalização. Imagens de microscopia de luz foram tomadas sob a ampliação 15x. A confluentes, monocamada de células endoteliais homogénea pode ser observado.

Figura 3. Microvascul cérebro imortalizadoar as células endoteliais expressam claudina-5, occludin e VE-caderina. CEND células foram cultivadas em colagénio IV revestidos lamelas e coradas com anticorpos contra claudina-5 (A), occludin (B) e VE-caderina (C). As imagens foram feitas usando um microscópio Zeiss Axioscop2 sob a ampliação 40x.

Figura 4. Medição da resistência eléctrica transendotelial (TEER) das CEND monocamada. CEND foram cultivadas em filtros de colagénio IV revestidos Transwell (tamanho de poro de 0,4 um). Depois de atingir a confluência, as células foram mantidas em meio contendo FCS a 2%. TEER foi medido após 7, 14 e 21 dias por meio de um conjunto que contém os eléctrodos de corrente e de tensão de passagem de medição.

Discussão

O processo descrito pode ser utilizado para o isolamento de microvascular CEs a partir de diferentes estirpes de ratinho, bem como a partir de diferentes estirpes de ratinho knock-out para estudar as alterações específicas na função do endotélio vascular. Como um método de imortalização utilizou-se a transformação com oncoproteína de poliomavírus murino, Polioma meio antigénio T. Ele transforma rapidamente imaturos células endoteliais in vivo e in vitro ^20,21,22. Outros métodos de imortalização das células endoteliais descritos na literatura incluem, por exemplo, a imortalização com antigénio T grande de SV40 do Simian Virus vacuolar 40 ^23, o produto do gene E1A do adenovírus ²⁴ ou sobre-expressão da subunidade catalítica da telomerase humana ^3. A imortalização com PymT é específico para a ECs murino imaturo, que permite a obtenção de uma cultura CE homogénea a partir de ratinhos neonatais em curto espaço de tempo. Imortalização altera as propriedades das células e poos resultados obtidos com os e linhas celulares imortalizadas, deve ser comparada com as células primárias ou com as experiências in vivo com ratinhos. PymT CE imortalizada foi descrito para expressar níveis elevados de actividade fibrinolítica resultantes de aumento da produção de activador do plasminogénio tipo urocinase-e diminuição da produção de activador do plasminogénio inibidores ^25. A comparação directa de PymT bEND5 linha celular imortalizada com primário CEs revelou que tanto em modelos in vitro BBB são adequados para estudos de adesão de células T ^26.

As linhas celulares estabelecidas de acordo com o processo descrito pode ser utilizado no número de passagem baixa para manter as propriedades de barreira pela expressão elevada de BBB e CE proteínas juncionais, como as células perdem estas propriedades durante o envelhecimento. Assim, após a perda de propriedades de barreira, a preparação de uma nova linha de células deve ser considerada. Densidade de plaqueamento de células deve ser elevada para os ECs, como este é crítica para a proliferação de células. Isto deve ser considerado durante o processo de isolamento, bem como a manutenção do ECs imortalizado. Cada linha de células de novo deve ser testada para as suas propriedades de barreira e de possíveis contaminantes, com outros tipos de células. Monocamadas EC podem ser coradas com anti-antigénio músculo galactocerebrósido, anti-glial fibrilar ácida e proteína anti-liso como anticorpos primários para excluir a contaminação com oligodendrócitos, astrócitos e pericitos ^4,27. Para impedir a contaminação pela vasculatura meningal, a expressão da trombomodulina pode ser testado, o que é expresso em todos os leitos vasculares com a excepção do cérebro ^28.

Curiosamente, as linhas celulares imortalizadas microvasculares endoteliais isoladas de diferentes regiões do cérebro diferem nas suas propriedades de barreira e de susceptibilidade a estímulos pró-inflamatórios. Como um exemplo, as linhas de células cerebrais e cerebelares CEND cerebEND podem ser mencionados ^4,5. CerebEND mostrou, em comparaçãopara CEND, menores níveis de expressão dos principais componentes da junção apertadas claudina-1 e occludin. No entanto, os níveis de claudina-3 e -12 foram maiores no cerebEND. A função da barreira de células cerebEND sofreu muito mais sob o tratamento com o mediador inflamatório, TNFa do que as propriedades de barreira de células CEND fez ^5. Vulnerabilidade cerebelar superior a estímulos inflamatórios, podem ser observados in vivo em doentes com esclerose múltipla e na sua experimental do modelo animal, a encefalomielite auto-imune ^29. Estes resultados interessantes mostrar a necessidade de gerar e caracterizar indivíduo em modelos in vitro de diferentes regiões do cérebro, de modo a melhorar o direccionamento da droga futuro para o cérebro.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Pureza> 98%
colágeno IV	Sigma-Aldrich	C5533	50 ug / ml em 50 mM de ácido acético
Colagenase / Dispase	Roche	10269638001
Meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Dimetil-sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Soro Fetal de Vitelo (FCS)	PAA Laboratories	A15110-1333	concentração final de 10%, inactivado pelo calor (30 min a 56 ° C)
L-glutamina	Biochrom AG	K0282	Armazenamento: ≤ -15 ° C
MEM Vitamine	Biochrom AG	K0373	Armazenamento: ≤ -15 ° C
Piruvato de Na-	Biochrom AG	L0473
Neomicina (G418)	PAA Laboratories	P11-012
Os aminoácidos não essenciais (AEN)	Biochrom AG	K0293	O armazenamento a 4 ° C
Penicilina / estreptomicina	Biochrom AG	A2212	Armazenamento: ≤ -15 ° C
Salina tamponada com fosfato (PBS)	Biochrom AG	L1825
Polybrene (brometo Hexadimetrina)	Sigma-Aldrich	107689	0,8 mg / ml em PBS, a armazenagem à temperatura de -20 ° C
Puromicina	Sigma-Aldrich	P8833
Tripsina / EDTA	Biochrom AG	L1825	0,05%, EDTA a 0,02% em PBS