הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

Summary

גרעינים לב מבודדים באמצעות שקיעה צפיפות immunolabeled עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) כדי לזהות ולמיין גרעינים cardiomyocyte ידי cytometry הזרימה.

Abstract

זיהוי של גרעיני cardiomyocyte כבר מאתגר בסעיפים רקמות כמו רוב אסטרטגיות לסמוך רק על חלבונים סמן cytoplasmic ^1. אירועים נדירים מיוציטים לב כגון התפשטות אפופטוזיס מחייבים זיהוי מדויק של גרעיני myocyte לב לנתח חידוש הסלולר הומאוסטזיס ובתנאים פתולוגיות ^2. כאן, אנו מספקים שיטה לבודד את הגרעינים cardiomyocyte מרקמות מורטם הודעה על ידי שקיעה צפיפות immunolabeling עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) ומיון לאחר cytometry הזרימה. אסטרטגיה זו מאפשרת ניתוח התפוקה בידוד גבוה עם יתרון של עובד באותה מידה על רקמות טרי חומר ארכיוני קפוא. זה מאפשר ללמוד החומר שנאסף כבר biobanks. טכניקה זו ישימה ונבדקו מגוון רחב של מינים מתאימים ליישומים רבים במורד הזרם כמו פחמן 14 תיארוך ^3, תאים סיCLE ניתוח ^4, ויזואליזציה של אנלוגים תימידין (למשל BrdU ו IdU) ^4, ניתוח transcriptome ו epigenetic.

Protocol

1. הבידוד של גרעינים לב

1. Ultracentrifuge המעיל צינורות (צינורות Beckman צנטריפוגות # 363664) עם 10 מ"ל של תמיסת BSA / PBS 1% ציפוי. מכסה צינורות ולתת להם להסתובב למשך 30 דקות ב Rotator צינור. הסר את פתרון הציפוי ולתת צנטריפוגות צינורות אוויר יבש (1 צינור לכל הלב העכבר נדרש ניתוח לב עכבר אחת, לסירוגין עד 5 לבבות עכבר או 1 גרם של רקמת לב ממספר זנים שונים (למשל אדם) יכול להיות מעובד בצינור 1).
2. כל השלבים הבאים יש לבצע על הקרח. לנתח את החדר השמאלי של הלב העכבר טרי או קפוא הצמד עם אזמל. שים לב, פרוטוקול זה הוא מותאם במיוחד הלב העכבר אבל יכול גם להיות מותאם חולדה או לב אנושי. לחלופין, השתמש עד 1 גרם של רקמת לב מכמה מינים שונים.
3. חתוך את הדגימה לתוך תאים קטנים עם אזמל.
4. מעבירים את חתיכות רקמה לתוך צינור פלקון 50 מ"ל 15 מ"ל מלא של המאגר תמוגה.
5. Homogenizeרקמת לב עם T-25-Ultra Turrax בדיקה homogenizer (איקא) בסל"ד 24,000 עבור 10 שניות.
6. לדלל את homogenate עם נפח שווה של חיץ תמוגה ל 30 מ"ל.
7. השתמש כוס douncer (40 מ"ל) כדי להמשיך homogenize רקמות גרעינים חינם. לבצע שמונה משיכות עם העלי אישור גדולה.
8. להעביר את הגרעינים גולמי לבודד באמצעות 100 מיקרומטר ו 70 מיקרומטר רשת ניילון התא מסננת (BD Biosciences), ברציפות.
9. לסובב את הגרעינים גולמי לבודד בצנטריפוגה קירור (4 ° C) בשעה XG 700 דקות 10.
10. הסר את supernatant בקפידה על ידי צינורות היפוך ולנגב את פנים הצינור עם מגבת נייר. להיזהר לא להפריע גרעינים גלולה.
11. ממיסים את הגרעינים גולמי לבודד ב 5 מ"ל של חיץ סוכרוז על ידי pipetting הפתרון מספר פעמים למעלה ולמטה. הוסף עוד 25 מ"ל של חיץ סוכרוז כדי גלולה המומס.
12. הוסף 10 מ"ל של חיץ סוכרוז מוכן טרי לצינור ultracentrifuge מצופה (ראה שלב 1.1).
13. בזהירות כיסוי מ"ל מוסף 10 של המאגר סוכרוז עם גרעינים גלולה resuspended מומס חיץ סוכרוז משלב 1.9.
14. יתרה צינורות צנטריפוגות לפני הצבתם לתוך הרוטור JS13.1 מתנדנד חופשי למקם את הרוטור לתוך הצנטריפוגות במהירות גבוהה (Beckman אוואנטי-S 25).
15. ספין גרעיני מדגם XG ב 13,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
16. כאשר ספין השלימה, להסיר את צינורות בקפידה מתוך הרוטור וזורקים supernatant ידי צינורות היפוך ומוחה את הפסולת שנותרה מבפנים של צינורות עם מגבת נייר.
17. ממיסים את הגרעינים גלולה ב 1ml של למאגר אחסון גרעינים (NSB בתוספת חיץ). הערה: NSB פלוס מכיל 1.5 מ"מ spermine כמייצב DNA.
18. המשך עם צעד 2.1, immunostaining של גרעיני cardiomyocyte.

2. Immunostaining עבור cytometry זרימה

1. מכינים את השליטה שלילי immunostaining. קח את aliquot של 20 μl של המדגם גרעינים וdd 980 μl של NSB בתוספת חיץ.
2. הוסף חומר אנטי pericentriolar 1 נוגדנים (הארנב נגד PCM-1, נוגדנים אטלס) מדגם גרעינים בדילול של 1:500 כדי גרעינים immunolabel cardiomyocyte. מוסיפים את הנוגדן isotype בדילול כמו נוגדנים נגד PCM-1 לשליטה שלילי, מוכן בשלב 2.1.
3. דגירה שליטה שלילי צינור דגימה ב 4 ° C למשך הלילה.
4. לשטוף את השליטה מדגם שלילי לפחות פעם אחת עם NSB בתוספת חיץ (לסובב את הצינורות בצנטריפוגה קירור (4 ° C) בשעה XG 700 דקות 10. מחק supernatant ו לפזר את הגרעינים גלולה ב 1 מ"ל של NSB בתוספת חיץ).
5. הוסף נגד ארנב נוגדנים משני ניאון (FITC או APC) לשליטה שלילי צינור דגימה בדילול של 1:1000.
6. דגירה שליטה שלילי צינור דגימה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
7. לשטוף את השליטה מדגם שלילי לפחות פעם אחת עם NSB בתוספת חיץ (לסובב את הצינורות בצנטריפוגה קירור (4 ° C) בשעה XG 700 דקות 10. מחק supernatant ו לפזר את הגרעינים גלולה ב 1 מ"ל של NSB בתוספת חיץ).
8. להמשיך ניתוח זרימת מיון cytometric ו.

3. תזרים Cytometry

1. גרעינים המעיל איסוף צינורות פלקון (15 מ"ל) עם פתרון BSA / PBS 1% לפני תחילת זרימת cytometry מיון כמתואר בשלב 1.1.
2. סנן מדגם הביקורת השלילית דרך מסננת 30 מיקרומטר תא המטען הראשון הביקורת השלילית cytometer את זרימת (זרם BD). הגדר את השער הראשון והשני להגדיר גרעינים ו singlets (גרעינים אחת), המבוססת על פיזור קדימה (FSC), פיזור קדימה רוחב הפולס (רוחב הדופק FS) ולפזר בצד (SSC) (איור 2 א 'וב'). הוספת ה-DNA כתם (DRAQ5 (1:500)) המדגם יכול לעזור לזהות את האוכלוסייה גרעינים בתחילה.
3. טען מדגם immunolabeled ולהגדיר את השער 3 לבודד גרעינים cardiomyocyte (PCM-1-positve) מן הגרעינים הלא cardiomyocyte (PCM-1-שלילי). להתחיל את המיון(איור 2 ג ו - ד).

אופציונלי: כדי לנתח את תוכן ה-DNA הגרעיני (ploidy) ולבצע ניתוח מחזור התא להוסיף DNA המתאים כתם על גרעינים (למשל Hoechst 33342 או DRAQ5) (איור 2 ה).

4. לאחר מיון cytometry זרימה, הצב את הגרעינים על הקרח מחדש לנתח כדי לקבוע את טוהר מיון (איור 3 א 'וב').
5. לסובב את הגרעינים למיין את צינורות לאיסוף XG 1500 בצנטריפוגה בקירור במשך 15 דקות.
6. ממיסים את הגרעינים גלולה במאגר תואם יישום במורד הזרם.

4. נציג תוצאות

מורפולוגיה גרעינים ויושרה ניתן להעריך על ידי כתמי דנ"א דמיינו ידי מיקרוסקופ (איור 1). מוצלח PCM-1 תיוג ניתן להעריך על ידי מיקרוסקופ epifluorescence ועל ידי cytometry זרימה (איור 1, איור. 2C ו-D). PCM-1-positiיש ואוכלוסיות שליליות צריכים להיות מופרדים היטב זה מזה (איור 2 ג ו - ד). ב החדר השמאלי Murine על 30% גרעינים כל צריך להיות cardiomyocyte גרעינים (איור 2). מיון טוהר אפשר להעריך מחדש על ידי ניתוח מיון גרעינים (איור 3 א 'וב'). שתי אוכלוסיות גרעינים צריך טוהר מיון עולה על 95%.

באיור 1. PCM-1 מזהה גרעינים cardiomyocyte. גרעינים לב (א) מגואלות נוגדנים ל PCM-1 (ב) ו Nkx2.5 (ג) בלב עכבר בוגר. (ד) PCM-1-שכותרתו גרעינים מוקפים בציטופלסמה cardiomyocyte (שרשרת כבדה שרירן (MHC)) ולהביע גורם שעתוק Nkx2.5, המתעד את זיהוי מדויק של גרעיני cardiomyocyte ידי מכתים-1 PCM (ברים בקנה מידה 20 ו -10 מיקרומטר מיקרומטר (ד, הבלעה)). (ה) מבודד גרעינים הלב דמיינו עם ה-DNA כתם DRAQ5. (F ו-G) Cardiomyocגרעינים yte מסומנים עם נוגדנים כנגד PCM-1 (מיקרומטר בהיקף 10 בר). שים לב, דפוס מכתים epinuclear של PCM-1 בגרעין myocyte בסעיף רקמות בגרעין מבודד (חיצים).

איור 2. תזרים מיון cytometric של גרעיני cardiomyocyte. (א) גרעיני לב מזוהים פיזור קדימה (FSC) וצד פיזור (SSC). (ב) שער 2 מזהה גרעינים אחד על ידי FSC ו FS רוחב פולס ^5. (ג, ד) gating פלורסנט מאפשר הפרדת הגרעינים cardiomyocyte (PCM-1-חיובי) ולא cardiomyocyte (PCM-1-שלילי) גרעינים של רקמת לב. (ה) עכבר cardiomyocyte הם ברובם (> 80%) דיפלואידי (2n), רק קבוצה קטנה הוא tetraploid (4n) ^6. שים לב, cardiomyocytes אדם להכיל תדירות גבוהה יותר של גרעינים polyploidy (> 2n) ^7,8.

באיור 3. טוהר ניתוח של גרעיני cardiomyocyte ולא cardiomyocyte מיון. ניתוח מחדש של גרעינים שאינם cardiomyocyte (א) ו cardiomyocyte מיון (ב). שתי האוכלוסיות להראות טוהר מיון עולה על 99%.

Discussion

זיהוי מדויק של גרעיני cardiomyocyte הוא קריטי לניתוח תהליכי ההתחדשות של שריר הלב ^2,3. טכניקות קונבנציונאלי לבודד מרקמות cardiomyocytes טרי מבוססים בעיקר על עיכול אנזימטי של חלבונים תאי מטריקס וטיהור הבאים מתאי ביניים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה. טיהור נוסף של cardiomyocytes חיי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. מאגר תמוגה
שם מגיב
0.32 מ 'סוכרוז
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 מ"מ CaCl 2
5 mM מגנזיום אצטט
2.0 mM EDTA
0.5 מ"מ EGTA
1 mM DTT

2. סוכרוז חיץ

שם מגיב

2.1 מ 'סוכרוז

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM מגנזיום אצטט

1 mM DTT

3. אחסון גרעינים חיץ (NSB פלוס)

שם מגיב

0.44 מ 'סוכרוז

10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)

70 mM KCl

10 mM MgCl 2

1.5 מ"מ spermine

חומרים כימיים וציוד	חברה
Isotype ארנב IgG-Chip כיתה, # ab37415	Abcam
הארנב נגד PCM-1 נוגדנים, # HPA023374	אטלס נוגדנים
החמור שניות. , נוגדנים נגד ארנב Alexa 488 פלואוריד, # 21206, או שווה ערך שניות. ניאון נוגדן	החיים טכנולוגיות
DRAQ5	Biostatus
תא מסננות 30 מיקרומטר, 70 מיקרומטר ו 100 מיקרומטר	BD Biosciences
זכוכית douncer (40 מ"ל) ובוכנה "L"	VWR (ויטון תעשיות בע"מ)
T-25-Ultra Turrax Homogenizer	איקא גרמניה
פיזור S25 N-18 כלי G	איקא גרמניה
Beckman צנטריפוגה אוואנטי	Beckman Coulter
פלקון צינורות 15 מ"ל ו -50 מ"ל	VWR
Beckman צינורות צנטריפוגות # 363664	Beckman Coulter
JS13.1 הרוטור מתנדנד חינם	Beckman Coulter
גל cytometer	Beckman Coulter
צינור Rotator	VWR