Выделение ядер кардиомиоцитов с Посмертные тканей

Резюме

Сердечная ядра изолированы с помощью осаждения и плотность immunolabeled с антителами против pericentriolar материал 1 (PCM-1) определить и сортировать ядер кардиомиоцитов с помощью проточной цитометрии.

Аннотация

Идентификация ядер кардиомиоцитов была сложной в срезах тканей большинство стратегий полагаться только на цитоплазматических белков-маркеров ^1. Редкие события в кардиомиоциты, таких как пролиферации и апоптозе требуют точной идентификации сердечных миоцитов ядер для анализа клеточного обновления в гомеостаза и при патологических состояниях ^2. Здесь мы предлагаем метод, чтобы изолировать ядер кардиомиоцитов из тканей после смерти путем осаждения и плотность immunolabeling с антителами против pericentriolar материала 1 (PCM-1) и последующая сортировка проточной цитометрии. Эта стратегия обеспечивает высокую пропускную способность и анализ изоляцией с преимуществом работы одинаково хорошо на свежем ткани и замороженных архивных материалов. Это позволяет изучать материалы уже собраны в биобанках. Этот метод применим и испытан в широком диапазоне видов и пригодны для нескольких ниже приложений, таких как углерод-14 знакомства ^3, клетка-суCLE анализа ^4, визуализация тимидина аналогов (например, BrdU и ПИН) ^4, транскриптом и эпигенетических анализа.

протокол

1. Выделение сердечного ядра

1. Пальто ультрацентрифуге труб (Beckman пробирок # 363664) с 10 мл 1% BSA / PBS покрытие решение. Закройте трубы, и пусть они вращаются в течение 30 минут в трубке ротатора. Удалите покрытие решение, и пусть пробирок воздух сухой (одна трубка в сердце мыши требуется для анализа одного сердца мыши, поочередно до 5 сердца мыши или 1 г ткани сердца от различных видов (например, человека) может быть обработан в одной трубке).
2. Все последующие шаги должны быть выполнены на льду. Проанализируйте левого желудочка из свежих или замороженных оснастки мышь сердца с помощью скальпеля. Обратите внимание, что данный протокол оптимизирован для мыши сердце, но также может быть адаптирована к крысе или человеческое сердце. Кроме того, использовать до 1 г ткани сердца от различных видов.
3. Обрежьте образца на маленькие ячейки с помощью скальпеля.
4. Передача части ткани в 50 мл Сокол трубки, заполненной 15 мл лизис буфера.
5. Однородныйткани сердца с Т-25 Ultra-Turrax зонд гомогенизатор (IKA) на 24 000 оборотов в минуту на 10 секунд.
6. Развести гомогената с равным объемом лизис буфера до 30 мл.
7. Использование стекла douncer (40 мл) для дальнейшего гомогенизации ткани и свободные ядра. Выполнять восемь ударов с большим пестиком оформления.
8. Передайте сырой ядер изоляции через 100 мкм и 70 мкм нейлоновая сетка ячейка фильтр (BD Biosciences), последовательно.
9. Спином вниз сырой ядер изолировать в охлажденном центрифуги (4 ° С) при 700 мкг в течение 10 мин.
10. Удаляют супернатант тщательно обращения трубки и вытрите трубки с бумажным полотенцем. Будьте осторожны, чтобы не нарушить ядра гранулы.
11. Растворите сырой ядер изолировать в 5 мл сахарозы буфера с помощью пипетки раствор несколько раз вверх и вниз. Добавьте еще 25 мл сахарозы буфер растворенных гранул.
12. Добавить 10 мл свежеприготовленного сахарозы буфер покрытием труб ультрацентрифуге (см. п. 1.1).
13. Аккуратно наложить добавляют 10 мл буфера с сахарозой ресуспендированного ядра гранулы растворяются в сахароза буфера, начиная с шага 1.9.
14. Баланс пробирок перед помещением их в JS13.1 бесплатно размахивая ротора и поместить ротор в высокоскоростной центрифуге (Beckman Avanti S-25).
15. Спин ядра образца при 13000 х г при 4 ° С в течение 60 мин.
16. Когда спина завершено, удалить трубы тщательно от ротора и отказаться от супернатант обращения трубы и уничтожить оставшихся обломков от внутренней поверхности трубы с бумажным полотенцем.
17. Растворите гранулы ядер в 1 мл буфера хранения ядра (NSB плюс буфер). Примечание: NSB также содержит 1,5 мМ спермина как ДНК-стабилизатор.
18. Перейдите к шагу 2.1, иммунной ядер кардиомиоцитов.

2. Иммуноокрашивание для проточной цитометрии

1. Подготовка отрицательного контроля для иммунной. Возьмите аликвоту 20 мкл из ядер образца идд 980 мкл NSB плюс буфера.
2. Добавить анти-pericentriolar материала 1 антител (кролик анти-PCM-1, Атлас антитела) с ядрами образца в разведении 1:500 до immunolabel ядер кардиомиоцитов. Добавить изотипа антител в том же разведении как анти-PCM-1 антитела к отрицательным контролем, подготовленный в шаге 2.1.
3. Инкубируйте отрицательного контроля и пробирку при 4 ° С в течение ночи.
4. Вымойте отрицательного контроля и образцов по крайней мере, один раз с NSB плюс буфер (спин вниз трубы в охлажденном центрифуги (4 ° С) при 700 мкг в течение 10 минут. Удалить супернатант и растворить ядер гранул в 1 мл NSB плюс буфер).
5. Добавить анти-кролик люминесцентные вторичными антителами (FITC или APC) для отрицательного контроля и пробирку в разведении 1:1000.
6. Инкубируйте отрицательного контроля и пробирку при 4 ° С в течение 1 часа.
7. Вымойте отрицательного контроля и образцов по крайней мере, один раз с NSB плюс буфер (спин вниз трубы в охлажденном центрифуги (4 ° С) при 700 мкг в течение 10 минут. Удалить супернатант и растворить ядер гранул в 1 мл NSB плюс буфер).
8. Приступить к проточной цитометрии и сортировки.

3. Проточной цитометрии

1. Пальто ядер коллекции труб (Falcon 15 мл) с 1% BSA / PBS решение, прежде чем начать проточной цитометрии сортировки, как описано в пункте 1.1.
2. Фильтр образца и отрицательного контроля через 30 мкм фильтр клетки и загрузить сначала отрицательного контроля в проточной цитометрии (BD приток). Определение первых и вторых ворот для определения ядер и фуфайки (одного ядра), основанный на рассеяние вперед (FSC), длительность импульса вперед разброс (FS ширины импульса) и боковых рассеяния (SSC) (рис. 2, б). Добавление ДНК пятна (DRAQ5 (1:500)) в образце может помочь выявить ядер населения на начальном этапе.
3. Загрузите immunolabeled образца и определить третьи ворота, чтобы изолировать ядер кардиомиоцитов (PCM-1-positve) от не-ядер кардиомиоцитов (PCM-1-отрицательный). Начать сортировку(Рис. 2, г).

Дополнительно: Для того, чтобы проанализировать содержание ядерной ДНК (плоидности) и проводить анализ клеточного цикла добавить соответствующие ДНК пятна с ядрами (например, Hoechst 33342 или DRAQ5) (рис. 2д).

4. После того, как поток сортировки цитометрии, поместите ядер на льду и повторный анализ, чтобы определить чистоту сортировки (рис. 3а, б).
5. Спином вниз отсортированы ядер в коллекции труб в 1500 мкг в охлажденном центрифуги в течение 15 мин.
6. Растворите гранулы ядер в буфере совместим с приложением вниз по течению.

4. Представитель Результаты

Морфология ядра и целостности могут быть оценены с помощью ДНК пятна и визуализированы с помощью микроскопа (рис. 1). Успешное PCM-1 маркировка может быть оценена эпифлуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии (рис. 1 и рис. 2в, г). PCM-1-positiве и отрицательные население должно быть хорошо отделены друг от друга (рис. 2, г). В мышиной левого желудочка около 30% всех ядер должно быть ядер кардиомиоцитов (рис. 2). Сортировка чистоты могут быть оценены путем повторного анализа отсортированы ядер (рис. 3а, б). Оба ядра популяции должны сортировки чистотой более 95%.

Рисунок 1. PCM-1 определяет ядер кардиомиоцитов. Сердечная ядер (а) окрашивали антителами к PCM-1 (б) и Nkx2.5 (с) во взрослом сердце мыши. (Г) PCM-1-меченых ядер кардиомиоцитов окружении цитоплазмы (тяжелой цепи миозина (MHC)) и выразить транскрипционный фактор Nkx2.5, документально точной идентификации ядер кардиомиоцитов на PCM-1 окрашивания (масштаб баров 20 мкм и 10 мкм (г, вставка)). (Е) Сердечная изолятов ядер визуализированы с ДНК пятна DRAQ5. (Е, ж) Cardiomyocyte ядер, меченных антител против PCM-1 (линейки 10 мкм). Обратите внимание, что шаблон epinuclear окрашивания PCM-1 в ядрах миоцитов в тканях раздел и в изолированных ядрах (стрелки).

Рисунок 2. Проточной цитометрии сортировка ядер кардиомиоцитов. (А) Сердечная ядер определяются вперед рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). (Б) вторые ворота определяет единый ядер FSC и FS длительность импульса ^5. (C, D) Флуоресцентные стробирования позволяет разделение ядер кардиомиоцитов (PCM-1-положительных) и не кардиомиоцитов (PCM-1-отрицательная) ядер из ткани сердца. (Е) Мышь кардиомиоцитов в основном (> 80%) диплоидный (2п), лишь небольшое подмножество тетраплоидных (4л) ^6. Обратите внимание, что человеческие кардиомиоциты содержат более высокой частоте полиплоидии ядер (> 2п) ^7,8.

Рисунок 3. Чистота анализа отсортированы кардиомиоцитов и не ядер кардиомиоцитов. Повторный анализ отсортированных без кардиомиоцитов (а) и ядер кардиомиоцитов (б). Обе популяции показать сортировки чистотой более 99%.

Обсуждение

Точная идентификация ядер кардиомиоцитов имеет решающее значение для анализа регенеративных процессов в миокарде ^2,3. Обычные методы, чтобы изолировать кардиомиоцитов из свежей ткани в основном на основе ферментативного переваривания белки внеклеточного матрикса и последующе?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Лизирующего буфера
Название реагента
0,32 М сахарозы
10 мМ Трис-HCl (рН = 8)
5 мМ CaCl 2
5 мМ ацетат магния
2,0 мМ ЭДТА
0,5 мМ EGTA
1 мМ DTT

2. Сахароза буфер

Название реагента

2,1 М сахарозы

10 мМ Трис-HCl (рН = 8)

5 мМ ацетат магния

1 мМ DTT

3. Ядер хранения буфера (NSB плюс)

Название реагента

0,44 М сахарозы

10 мМ Трис-HCl (рН = 7,2)

70 мМ KCl

10 мМ MgCl 2

1,5 мМ спермина

Реактивы и оборудование	Компания
Изотип кролика IgG-CHIP класса, # ab37415	Abcam
Кролик анти-PCM-1 антител, # HPA023374	Атлас Антитела
Осел сек. антитела, анти-кролик Alexa Fluor 488, #-21206 или эквивалент сек. флуоресцентных антител	Life Technologies
DRAQ5	Biostatus
ячейки сита 30 мкм, 70 мкм и 100 мкм	BD Biosciences
Стекло douncer (40 мл) ипестик "L"	VWR (Уитон Industries Inc)
Т-25 Ultra-Turrax Гомогенизатор	IKA Германии
Диспергирование инструмент S25 N-18 G	IKA Германии
Бекман Avanti центрифуги	Beckman Coulter
Сокол трубы 15 мл и 50 мл	VWR
Бекман пробирок # 363664	Beckman Coulter
JS13.1 свободного качания ротора	Beckman Coulter
Приток цитометр	Beckman Coulter
Труба Rotator	VWR