Isolamento dei Nuclei Cardiomyocyte dal post-mortem del tessuto

Riepilogo

Nuclei cardiaca sono isolati tramite sedimentazione densità e immunolabeled con anticorpi contro materiale pericentriolar 1 (PCM-1) per identificare e ordinare nuclei cardiomiociti mediante citometria a flusso.

Abstract

Identificazione dei nuclei cardiomiociti è stato impegnativo in sezioni di tessuto, come la maggior parte delle strategie di contare solo su proteine ​​marker citoplasmatici ^1. Eventi rari in miociti cardiaci quali la proliferazione e l'apoptosi richiedono una identificazione accurata dei miociti cardiaci nuclei di analizzare il rinnovamento cellulare in omeostasi e in condizioni patologiche ^2. Qui, forniamo un metodo per isolare nuclei cardiomyocyte dal tessuto post mortem di sedimentazione densità e immunomarcatura con anticorpi contro materiale pericentriolar 1 (PCM-1) e la successiva selezione citometria a flusso. Questa strategia permette una analisi un elevato throughput e l'isolamento con il vantaggio di lavorare altrettanto bene su tessuti freschi e congelati materiale d'archivio. Ciò rende possibile studiare materiale già raccolto in biobanche. Questa tecnica è applicabile e testato in una vasta gamma di specie e adatto a molteplici applicazioni a valle, come il carbonio-14 datazione ^3, cell-cyCLE analisi ^4, la visualizzazione di analoghi della timidina (ad esempio BrdU e IDU) ^4, l'analisi del trascrittoma ed epigenetici.

Protocollo

1. Isolamento dei Nuclei Cardiac

1. Coat tubi ultracentrifuga (Tubi centrifuga Beckman # 363664) con 10 ml di 1% BSA / PBS soluzione di rivestimento. Coprire le provette e farli ruotare per 30 minuti in un rotatore tubo. Rimuovere la soluzione di rivestimento e lasciare la centrifuga tubi aria secca (un tubo per il cuore di topo è richiesto per l'analisi di cuore di topo singoli, alternativamente fino a 5 cuore di topo o 1 g di tessuto cardiaco da una specie diversa (ad esempio umano) può essere elaborato in un tubo).
2. Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti sul ghiaccio. Sezionare il ventricolo sinistro del mouse dal cuore fresco o snap-frozen con un bisturi. Attenzione, questo protocollo è ottimizzato per il cuore del mouse, ma può anche essere adattato per ratto o cuore umano. In alternativa, utilizzare fino a 1 g di tessuto cardiaco da una specie diversa.
3. Tagliare il campione in cubicoli di piccole dimensioni con un bisturi.
4. Trasferire i pezzi di tessuto in un tubo Falcon da 50 ml riempito con 15 ml di tampone di lisi.
5. Omogeneizzare latessuto cardiaco con un T-25 Ultra-Turrax sonda omogeneizzatore (IKA) a 24.000 rpm per 10 sec.
6. Diluire l'omogeneizzato con un volume uguale di tampone di lisi a 30 ml.
7. Utilizzare un bicchiere douncer (40 ml) per omogeneizzare ulteriormente il tessuto e il libero nuclei. Eseguire otto colpi con un pestello gioco di grandi dimensioni.
8. Passare il greggio isolare nuclei attraverso un 100 micron e 70 micron nylon mesh cellulare filtro (BD Biosciences), consecutivamente.
9. Centrifugare la nuclei grezzo isolato in una centrifuga refrigerata (4 ° C) a 700 xg per 10 min.
10. Rimuovere il surnatante attentamente invertendo i tubi e pulire l'interno del tubo con carta assorbente. Fare attenzione a non disturbare il pellet nuclei.
11. Sciogliere il nuclei grezzo isolato in 5 ml di tampone saccarosio pipettando la soluzione più volte su e giù. Aggiungi un ulteriore 25 ml di tampone saccarosio alla disciolta pellet.
12. Aggiungere 10 ml di tampone saccarosio appena preparato al tubo rivestito ultracentrifuga (vedi punto 1.1).
13. Accuratamente sovrapporre il aggiunti 10 ml di tampone saccarosio con i nuclei pellet risospeso sciolto in tampone saccarosio dal passaggio 1,9.
14. Bilanciare le provette prima di metterli in un rotore JS13.1 libera oscillazione e posizionare il rotore in una centrifuga ad alta velocità (Beckman Avanti S-25).
15. Spin il campione nuclei a 13.000 xga 4 ° C per 60 min.
16. Quando la rotazione è stata completata, rimuovere i tubi accuratamente dal rotore e scartare il supernatante invertendo i tubi e pulire i detriti restante dall'interno dei tubi con carta assorbente.
17. Sciogliere i nuclei pellet in 1 ml di tampone nuclei di stoccaggio (NSB più buffer). Nota: NSB più contiene 1,5 mM spermina come stabilizzante DNA.
18. Procedere con il punto 2.1, immunocolorazione dei nuclei cardiomiociti.

2. Immunoenzimatica per Citometria a Flusso

1. Preparare il controllo negativo per immunocolorazione. Prelevare un 'aliquota di 20 microlitri di fuori del campione nuclei edd 980 pl di tampone NSB più.
2. Aggiungi anti-pericentriolar materiale 1 anticorpi (di coniglio anti-PCM-1, anticorpi Atlas) al campione nuclei in una diluizione di 1:500 per nuclei immunolabel cardiomiociti. Aggiungere l'anticorpo isotipo nella stessa diluizione come l'anti-anticorpo PCM-1 per il controllo negativo, preparato nella fase 2,1.
3. Incubare controllo negativo e la provetta a 4 ° C per una notte.
4. Lavare controllo negativo e campione almeno una volta con NSB più tampone (spin down tubi in una centrifuga refrigerata (4 ° C) a 700 xg per 10 min. Eliminare il surnatante e sciogliere il nuclei pellet in 1 ml di tampone più NSB).
5. Aggiungi anti-coniglio immunofluorescenza secondario (FITC o APC) al controllo negativo e la provetta in una diluizione di 1:1000.
6. Incubare controllo negativo e la provetta a 4 ° C per 1 h.
7. Lavare controllo negativo e campione almeno una volta con NSB più tampone (spin down tubi in una centrifuga refrigerata (4 ° C) a 700 xg per 10 min. Gettare il surnatante e sciogliere i nuclei pellet in 1 ml di NSB più buffer).
8. Procedere con l'analisi di citometria di flusso e di smistamento.

3. Citometria a Flusso

1. Coat nuclei provette Falcon (15 ml) con 1% BSA / PBS soluzione prima di iniziare la citometria a flusso di smistamento come descritto al punto 1,1.
2. Filtrare il campione e il controllo negativo tramite un setaccio cella 30 um e caricare il primo controllo negativo al citofluorimetro (Influx BD). Definire il primo cancello e la seconda per definire nuclei e canottiere (nuclei singola), sulla base di forward scatter (FSC), larghezza di impulso in avanti scatter (FS larghezza d'impulso) e Side Scatter (SSC) (Fig. 2a e b). Aggiunta di un DNA macchia (DRAQ5 (1:500)) per il campione può aiutare a identificare la popolazione nuclei inizialmente.
3. Caricare il campione immunolabeled e definire la terza porta per isolare nuclei cardiomiociti (PCM-1-positve) da non-cardiomiociti nuclei (PCM-1-negativo). Avviare l'ordinamento(Fig. 2c e d).

Optional: Al fine di analizzare il contenuto nucleare di DNA (ploidia) e di eseguire l'analisi del ciclo cellulare aggiungere un DNA adeguato macchia per i nuclei (ad esempio, Hoechst 33342 o DRAQ5) (Fig. 2e).

4. Dopo cernita citometria di flusso, posizionare i nuclei su ghiaccio e ri-analisi per determinare la purezza di smistamento (Fig. 3a e b).
5. Centrifugare la nuclei ordinato nei tubi di raccolta a 1500 xg in una centrifuga refrigerata per 15 min.
6. Sciogliere il nuclei pellet in un buffer compatibile con l'applicazione a valle.

4. Risultati rappresentativi

Nuclei morfologia e l'integrità può essere valutata attraverso macchie di DNA e visualizzati al microscopio (Fig. 1). Successo PCM-1 di etichettatura può essere valutata mediante microscopia in epifluorescenza e mediante citometria a flusso (Fig. 1 e Fig. 2c e d). PCM-1-positiVE e popolazioni negativi devono essere ben separati uno dall'altro (Fig. 2c e d). In murino ventricolo sinistro circa il 30% di tutti i nuclei dovrebbe essere nuclei cardiomiociti (Fig. 2d). Ordinamento purezza può essere valutata da ri-analizzando i nuclei ordinati (Fig. 3a e b). Entrambe le popolazioni nuclei dovrebbe avere una purezza superiore al 95% di smistamento.

Figura 1. PCM-1 identifica nuclei cardiomiociti. Nuclei cardiaca (a) vengono colorate con anticorpi anti PCM-1 (b) e per Nkx2.5 (c) in un cuore topo adulto. (D) PCM-1-marcato nuclei sono circondati da citoplasma cardiomiociti (catena pesante della miosina (MHC)) ed esprimere il fattore di trascrizione Nkx2.5, che documenta l'identificazione accurata dei nuclei cardiomiociti da PCM-1 colorazione (scala di 20 bar e 10 micron micron (d, inserto)). (E) isolati nuclei cardiache visualizzati con il DNA macchia DRAQ5. (F e G) Cardiomyocnuclei yte sono etichettati con anticorpi contro il PCM-1 (scala bar 10 micron). Nota, il pattern di colorazione epinuclear PCM-1 in nuclei muscolari in sezione del tessuto e in nuclei isolati (frecce).

Figura 2. Citometria a flusso ordinamento dei nuclei cardiomiociti. (A) nuclei Cardiac sono identificati dalla forward scatter (FSC) e lato scatter (SSC). (B) Una seconda porta identifica i singoli nuclei da FSC e FS larghezza di impulso ^5. (C, d) gating fluorescente permette la separazione dei nuclei cardiomiociti (PCM-1-positive) e non-cardiomiociti (PCM-1-negativi) nuclei di tessuto cardiaco. (E) cardiomiociti mouse sono in gran parte (> 80%) diploide (2n), solo un piccolo sottoinsieme è tetraploide (4n) ^6. Nota, cardiomiociti umani contengono una maggiore frequenza di nuclei poliploidia (> 2n) ^7,8.

Figura 3. Analisi di purezza ordinati nuclei cardiomiocita e non cardiomiociti. Re-analisi di ordinato nuclei non cardiomiociti (a) e cardiomiociti (b). Entrambe le popolazioni mostrano una purezza superiore al 99% di smistamento.

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Discussione

Identificazione accurata di nuclei cardiomiocita è cruciale per l'analisi dei processi rigenerativi nel miocardio ^2,3. Le tecniche convenzionali per isolare cardiomiociti di tessuto fresco si basa principalmente sulla digestione enzimatica delle proteine ​​della matrice extracellulare e la successiva purificazione dalle cellule interstiziali mediante centrifugazione a bassa velocità. Ulteriore purificazione di cardiomiociti viventi di cellule staminali embrionali (ESC) può essere eseguita da immuno...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Lysis Buffer
Nome del reattivo
0,32 M di saccarosio
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 mM CaCl 2
5 mM acetato di magnesio
2,0 mM EDTA
0,5 mM EGTA
1 mM DTT

2. Saccarosio tampone

Nome del reattivo

2,1 M saccarosio

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM acetato di magnesio

1 mM DTT

3. Nuclei soluzione per la conservazione (NSB plus)

Nome del reattivo

0,44 M di saccarosio

10 mM Tris-HCl (pH = 7,2)

70 mM KCl

10 mM MgCl 2

1,5 mM spermina

Reagenti e materiale	Azienda
Isotipo IgG di coniglio ChIP-Grade, # ab37415	Abcam
Coniglio anti-PCM-1 anticorpo, # HPA023374	Atlas Anticorpi
Donkey sec. anticorpo anti-coniglio Alexa Fluor 488, # A-21.206 o equivalente sec. immunofluorescenza	Life Technologies
DRAQ5	Biostatus
filtri cella 30 micron, 70 micron e 100 micron	BD Biosciences
Douncer vetro (40 ml) epestello "L"	VWR (Wheaton Industries Inc.)
T-25 Ultra-Turrax	IKA Germania
Disperdente strumento S25 N-18 G	IKA Germania
Centrifuga Beckman Avanti	Beckman Coulter
Provette Falcon da 15 ml e 50 ml	VWR
Tubi centrifuga Beckman # 363664	Beckman Coulter
JS13.1 rotore oscillante libero	Beckman Coulter
Influx citometro	Beckman Coulter
Tubo Rotator	VWR