בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Summary

בידוד והתרבות של myofibers הוא תקן הזהב במבחנה מערכת ללמוד את המעבר של תאי לווין ברגיעה, הפעלה והתמיינות. חשוב מכך, מערכת תרבות myofiber אחת שומרת על קשר תא myofiber / גזע, שהוא מרכיב חיוני בנישה של תאי הגזע בשרירים.

Abstract

התחדשות שרירים במבוגרים מתבצעת על ידי תאי גזע תושבים נקראים תאי לווין. תאי לווין מוגדרים לפי עמדתם בין lamina הבסיס וsarcolemma של כל myofiber. ידע הנוכחי של ההתנהגות שלהם מסתמך במידה רב על השימוש בפרוטוקול בידוד myofiber האחת. בשנת 1985, בישוף תאר פרוטוקול לבודד סיבים חיים בודדים מflexor digitorum רוויס (FDB) של חולדות בוגרות במטרה ליצור במערכת מבחנה שבהתאחדות הפיסית בין myofiber ותאי הגזע שלה נשמרה ^1. בשנת 1995, Rosenblattmodified פרוטוקול הבישוף כאלה שmyofibers נקטף ומטופלים בנפרד ביחידים לאחר עיכול collagenase במקום להיות מבודד על ידי הכח הכביד שקיעת ^{2, 3.} רוזנבלט או בישוף הפרוטוקול מאז הותאם לשרירים שונים, גיל או תנאי ^3-6. טכניקת בידוד myofiber היחידה היא הכרחיתכלי בגלל היתרונות הייחודיים שלה. ראשית, בפרוטוקול myofiber היחיד, תאי לווין נשמרים מתחת lamina הבסיס. זוהי תכונה ייחודית של הפרוטוקול כטכניקות אחרות כגון מיון תא הופעל פלואורסצנטי דורשות כימיות ומכאנית רקמה ⁷ דיסוציאציה. למרות שמערכת תרבות myofiber לא יכולה להוות תחליף למחקרי vivo, זה להציע פלטפורמה מצוינת כדי לטפל במאפיינים ביולוגיים רלוונטיים של שריר בתאי גזע. myofibers היחיד יכולה להיות מתורבת בתנאי ציפוי סטנדרטיים או בתנאים משתנים. תאי לווין על myofibers הצף נתונים לכמעט שום השפעה אחרת מאשר סביבת myofiber. קשיחות מצע וציפוי הוכחו להשפיע על היכולת של תאי לווין להתחדש שרירי ^{8, 9} באופן עצמאי להיות מסוגל לשלוט בכל הגורמים הללו מאפשר אפליה בין תגובות נישה תלויה ועצמאיות. ריכוזים שונים של סרום ליגם הוכח יש השפעה על המעבר מרגיעה להפעלה. כדי לשמר את מצב הרגיעה של תאי לווין הקשורים אליו, סיבים צריכים להיות כל זמן במדיום סרום נמוך ^1-3. התכונה זו שימושית במיוחד כאשר בודקות את הגנים מעורבים במצב הרגיעה. במדיום עשיר סרום, תאי לווין להפעיל במהירות, מתרבה, נודד ולהבדיל, ובכך מחק בתהליך התחדשות vivo ^1-3. המערכת יכולה לשמש לביצוע מגוון של מבחנים כגון בדיקה של מעכבים כימיים; ביטוי אקטופי של גנים על ידי משלוח וירוסים; גן oligonucleotide המבוסס עקום למטה או הדמיה חייה. מאמר וידאו זה מתאר את הפרוטוקול המשמש כיום במעבדה שלנו לבודד myofibers הבודד מLongus extensor digitorum (אדי) השרירים של עכברים בוגרים (6-8 שבועות).

Protocol

כל הניסויים טופלו בהתאם לתקנות אוניברסיטת אוטווה לטיפול בבעלי חיים וטיפול.

ראה בטבלת 1 סקירה כללית של הפרוטוקול.

1. לפני שמתחיל את הבידוד

1. הכן את הפתרונים הבאים:
   0.2% מסוג collagenase אני בDMEM (המדיום של Dulbecco העדכון של הנשר; הגבוה גלוקוז, L-גלוטמין עם 110 מ"ג / המ"ל פירובט נתרן). לשני שרירי אדי להכין 2 מ"ל של 0.2% בCollagenease DMEM. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. 10 דקות לפני הבידוד, prewarm על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. aliquots הנוסף של collagenase החי אפשר להקפיא ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
   הערה: להשתמש DMEM עם פירובט נתרן לאורך כל ההליך. סיבים לא ישרדו במדיום נתרן פירובט חופשי.
   • תקשורת כביסה (להשתמש כדי לבצע את כל הכביסות). תוספת DMEM עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין. סנן דרך 0.22 מיקרומטר מסנן לפני השימוש.
   • תקשורת תרבות Myofiber. תוספת DMEM עם 20% FBS, 1% תמצית עוף עובר ו1% פניצילין / סטרפטומיצין. לסנן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
   • Matrigel מנות מצופות. לסיבי התרבות לתקופה ארוכה של זמן, מומלץ להשתמש Matrigel כמצע ציפוי. כדי להכין מנות מצופות Matrigel, להפשיר aliquot של Matrigel ב 4 ° C למשך הלילה. היום אחרי, לדלל Matrigel 1:10 בDMEM. שמור Matrigel ב 4 ° C בכל העת ולהימנע משינויי הטמפרטורה פתאומיות כמו זה יהיה ליצור גבישים מיקרוסקופים בתוך פתרון Matrigel כתוצאה מהציפוי אחיד. מנות Place להיות מצופות בקרח. מנות מעיילות עם מספיק נפח כדי לכסות את פני השטח. תן לו לשבת במשך דקות 1. להסיר לגמרי את שאריות Matrigel. בואו מאכלים יבשים על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות לפני שימוש או לילה.
   
   הערה: aliquots של Matrigel המדולל ניתן מחדש מספר פעמים, למטרת ציפוי אם הם נמצאים ב4 & דהז; ג
2. לבסוף, הקפד לנקות את תחנת מיקרוסקופ וכלים המבתרים עם אתנול 70%.
3. במשך שני בידודי אדי (עכבר אחד) להכין חמש מנות פלסטיק פטרי (60 * 15mm) כדלקמן:
   • ארבע מנות לבידוד (1 לשריר דיסוציאציה, 3 לכביסות סידוריות). כל המנות חייבות להיות מצופות עם סוס סרום (HS) כדי למנוע מmyofibers מצרף לפלסטיק. למעייל, 3 מיליליטר פיפטה של ​​סרום סוס לכל מנה, מערבולת לאפשר אפילו ציפוי, להסיר את סרום הסוס ולתת את המנה יבשה במשך לפחות 30 דקות. הוסף 4 מ"ל של DMEM לכל מנה. שמור מנות על 37 מעלות צלזיוס בCO ₂ חממה 5% לפני השימוש.
   
   הערה: סרום על סוסים יכול להיות שימוש חוזר מספר פעמים, אם שמר סטרילי. לחלופין, פתרון של HS 10% בDMEM יכול לשמש למאכלי פרווה. השתמש בכלים מצופים HS לאורך כל הפרוטוקול וכאשר myofibers culturing בתנאים משתנים.
   • צלחת אחת תשמש לmyofibers התרבות לאחר הבידוד. Altניתן להשתמש בגדלי צלחת ernative או פורמטים לתרבות הסופית של myofibers בהתאם ליישומים במורד זרם. עם זאת, אנו לא מציעים גדלי צלחת גדולים יותר מאשר 60 * 15mm. Myofibers יכול להיות כל זמן בהשעיה לא יותר מאשר 96 שעות לפני התכווצות היפר מתרחשת. לזמנים ארוכים יותר תרבות, אנו ממליצים להשתמש בכלים מצופים Matrigel או צלחות.
4. לבידוד סיב אחד (2 אדי), להכין שתי pipettes פסטר סטריליים: פיפטה משעממת אחד גדולה לטיפול בשרירים ופיפטה שעם הקטנה למניפולצית myofiber. השתמש בעט יהלומים כדי לחתוך כל כוס טפטפה לאורך הרצוי ולק חום כדי להחליק הקצוות של פיפטה. על ידי שימוש בלהבה, עקומת קצה פיפטה השעם הקטנה. זה יעזור טיפול סיבים בודדים. להבה לעקר. מעייל כל פיפטה עם HS לפני השימוש.

2. Dissection שרירים ועיכול

1. לצורך הניסויים אלה, 8 בן שבוע SV129, Pax7 קואל ^Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) וMyf5-Cre; Rosa26YFP היו בשימוש.
2. רסס גפיים אחוריים עם אתנול 70%. להצמיד את החיה (את הפנים) לפורום תמיכה שיש לך הבנה טובה יותר של האיבר האחורי במהלך ההליך.
3. בעזרת מספריים, לחתוך דרך כל אורכו של האיבר ולחשוף את השרירים שמתחת. הסר את העור, כמו גם כל שיער או פרווה (איור 1 א).
4. עם מספריים בסדר, לחתוך fascia הדק מבלי לפגוע בשרירים הבסיסיים. חזותי למקם האד. אדי נמצא בתא הקדמי של הגפה האחורית בדיוק מתחת לשריר tibialis הקדמי (ת"א).
5. בעזרתו של שני מלקחיים, לחשוף את גידי דיסטלי.
6. חותך את גידי דיסטלי (של שניהם ת"א והאד) עם מספריים חדים Cohann-Vannas האביב.
7. בעזרת מלקחיים החזיקו את שניהם ת"א ושרירי אדי ידי גידיהם ולמשוך בעדינות את השרירים לקראת הסוף הפרוקסימלי. בשלב זה אתה אמור להיות מסוגל לראות בבירור אתשרירי האד פשוט מתחת לשריר ת"א. עכשיו, להפריד את האד משרירי ת"א על ידי משייכת שני הגידים בכיוונים מנוגדים (1B איור). הימנע ממתיחה בשריר האד במהלך ביצוע פעולה זו כדבר יפגע בmyofibers.
8. לחשוף את גיד האד. כדי להמחיש טוב יותר את הגיד הפרוקסימלי הוא עשוי לסייע בשלב זה להסיר את שריר ת"א. היא עשויה גם לעזור לחתוך כמה רקמת חיבור סביב הברך (התרשים 1C).
9. חותך את הגיד הפרוקסימלי ועדינות להסיר את האד (1D איור).
10. על ידי החזקת השריר באמצעות הגידים שלו, להעביר אותו ל 2 מ"ל של פתרון collagenase הכין בעבר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    הערה: לבידוד סיבים מוצלחים, חשוב לבודד את האד מגיד לגיד, כך ששלמות myofiber נשמרה. צעדים 2.3-2.9 יכולים להתבצע תחת מיקרוסקופ לנתח. לחלופין, השימוש בmagnifying זכוכית עשויה גם לעזור לי תצוגה טובה יותר של השרירים.
11. חזור על שלבים 2.3-2.9 לבודד אדי 2. העברת האד השני באותו הצינור. כדי להימנע מעיכול לא אחיד, בידוד של אדי 2 אמור להסתיים לא יותר מ 5 דקות אחרי הראשון.
    הערה 1: זמן דגירה עלול צריך להיות מותאם בהתאם לפעילות collagenase. ארוכה או קצרה דגירה ייתכן שתהיה צורך בהתאם לגודל, הגיל ו / או מצב שריר (שרירי fibrotic למשל זקוקים לזמן עיכול ארוך יותר).
    הערה 2: אם בוחן את התנהגות תאי לווין בתנאי רגיעה, תסיסה בזמן עיכול שריר עשוי להפעיל תאי לווין ^10.
12. במהלך זמן העיכול, לבדוק באופן קבוע את השריר כדי למנוע יתר מערכת עיכול. עצור את העיכול כאשר שרירים מתחילים להשתחרר וmyofibers גלויים. כדי להפסיק עיכול, להעביר שני השרירים בזהירות לצלחת פטרי prewarmed עם 4 מ"ל של DMEM (dissociatiעל צלחת). השתמש פיפטה הגודל נשא הגדולה לביצוע פעולה זו.
    הערה: למנוע overdigestion השריר באופן בלתי נמנע זה תוצאות בבידוד של myofibers נדבק היפר.

3. אחת Myofiber דיסוציאציה ותרבות

1. לשחרר myofibers, השתמש בכוס טפטפה השעם הגדול כדי לשטוף את השריר עם מדיום חם עד סיבים טבעיים מתחילים ששוחררו. אל triturate שריר כמו זה יהיה בהכרח תוצאה של סיבים מזיקים. לבצע את זה ואת הצעדים הבאים תחת מיקרוסקופ לנתח.
2. המשך שחרור myofibers עד המספר הרצוי הוא הגיע. אם המנה נדרשה בטמפרטורת חדר במשך יותר מ 10 דקות לאפשר 5 דקות (מינימום) דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ מחדש לאזן הבינוני.
   הערה: אם בינוניים מגיע לטמפרטורות שמתחת פיסיולוגי (37 מעלות צלזיוס) במשך זמן ממושך myofibers ימות.
3. שימוש בגודל קטן נשא פיפטה, transfer לחיות myofibers הבודד למנת prewarmed חדשה (הראשון של שלוש כביסות רצופות). לטפל בכל myofiber בנפרד במקום להעביר כמויות גדולות של myofibers בבת אחת. במידת צורך, לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עבור 10-15 דקות כדי לאזן מחדש את המדיום.
4. חזור על שלב 3.3 עבור 2 יותר פעמים או עד שכל myofibers ופסולת המתים יוסרו. אנו ממליצים לפחות שלוש כביסות רצופות ללנקות נכון.
   הערה: myofibers המת יופיע כקצר והיפר התכווץ תחת מיקרוסקופ האור.
5. דגירת myofibers הבודד על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ בצלחת השטיפה האחרונה (DMEM בלבד) לשעה אחת לפחות לפני המעבר למדיום התרבות. זה מאפשר myofibers להסתגל לתנאים במבחנה בהעדר הסרום. מצאנו כי תרבות המיידית של myofibers במדיום עשיר סרום מגביר התכווצות סיבים.
6. לאחר שעה אחת, להעביר לצלחת myofibers prewarmed חדשה או לפורמט המתאים התרבותבהתאם ליישום במורד הזרם. סיבי תרבות במדיום סרום גבוה כדי לאפשר הפעלת תא לווין. לחלופין, ריכוזים שונים של סרום או תמצית עובר עוף יכולים לשמש גם. שינוי בינוני בכל יום אחר.

4. יישומים במורד זרם

1. Immunostaining. myofibers Live יכול להיות קבוע ומוכתם בכל נקודת זמן במהלך הבידוד. Immunofluorescence יכול להתבצע על myofibers הן צף ומצע מצורף. אם הכתמת myofibers הצף, השתמש כוס טפטפה משעממת קטנה להעביר myofibers מפתרון אחד למשנו. לחלופין, ניתן לשמור myofibers באותו היטב לאורך כל ההליך ולהוסיף / להסיר פתרונות באמצעות כוס טפטפה. הימנע משאיפה רגילה כמו זה יגרום להסרה כמו גם את myofibers. בקצרה, להסיר לחלוטין את התרבות בינונית; myofibers לתקן בparaformaldehyde 4% prewarmed (PFA) למשך 5 דקות. בהרחבה לשטוף מספר פעמים בPBS. Incubamyofibers טה ב1% גליצין ב PBS או פתרוני מרווה סטנדרטיים אחרים כדי למזער מכתים רקע PFA. במידת צורך, permeabilize myofibers עם 0.1% Triton X-100 ב PBS למשך 10 דקות ואחרי 5 דקות לשטוף בPBS. דגירת סיבים בפתרון חסימה (10% סוס סרום, 0.1% Triton X-100, 1% NaN) עבור 1 שעה בטמפרטורת חדר או עדיף למשך הלילה ב 4 ° C. פתרוני חסימה אלטרנטיביים יכולים לשמש, בהתאם לנוגדן של עניין. לשטוף פעם ב PBS למשך 5 דקות. דגירה עם הנוגדן הראשוני המתאים דילול בפתרון חסימה לשעה 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C. שטוף סיבים 3 פעמים ב 5 דקות לשטיפה בPBS להסיר את כל נוגדנים מאוגדים. דגירה עם נוגדנים משני המתאימים ל45 דקות לשעה 1 בטמפרטורת חדר. לשטוף 3 פעמים ב 5 דקות לשטיפה בPBS. Counterstain גרעינים עם 1 מ"ג / המ"ל DAPI. אם הכתמת סיבים צפים, להעביר כל סיבים לשקופית זכוכית מתאימה למיקרוסקופיה. הסר את כל עודפים של PBS או בינוני. החל הרכבת Mediאום ולאחר מכן להוסיף coverslip. המשך לדמיין myofibers תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראה תרשים 4 לimmunofluorescence נציג myofibers אד. הליכים חלופיים באמצעות צביעת fixatives החזק מתוארים ברמא, מ 'ואח'. וWosniak ^11, AC et al. ^12.
2. Oligonucleotide או transfection פלסמיד החולף. myofibers החי ניתן transfected עם siRNA פלסמיד או לגן / s של עניין ספציפי. כאשר באמצעות siRNA, transfection הכפול מומלץ למציאה יעילה של גנים. מומלץ לבצע transfection הראשון לאחר שעות 8 מהבידוד. שש שעות לאחר transfection, להחליף עם מדיום חדש. לtransfection siRNA, אנו מציעים להתחיל באמצעות ריכוז סופי של 50 ננומטר. מציאת ביטוי גנים יכולה להיות מנותחת על ידי מיצוי RNA או רצוי על ידי immunostaining.
3. זיהום נגיפי. זיהום של myofibers החי הוא אפשרי אם כי השכיחות של תאהמוות הוא גבוה יותר מאשר עם transfection Oligo והיעילות של זיהום עלול להיות משתנים בהתאם לתנאים בשרירים ובגיל. לדוגמה, השריר myofibers המבוגר ללא פגע במיוחד שאינו מגיב לזיהום נגיפי בשל נוכחותם של lamina הבסיס אשר הוכח כדי לספק מחסום הגנה נגד מארח זיהום ^{13, 14.} וקטורי lentiviral עדיפים על וקטורי retroviral כי הם יכולים להדביק תאים רדומים (המיטוטי לא). לזיהום נגיפי, מומלץ לסיבי תרבות על צלחת Matrigel מצופית או צלחת ולתת myofibers להסתגל לתנאי מדיה עבור 24 השעות הראשונות.
4. חי הדמיה. חי הדמיה של myofibers במיוחד זמן רבה ומחייבת מיקרוסקופ מצויד ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ קאמריים. זה שימושי בעת הערכת ההתנהגות של תאי לווין בודדים. העבודה שנעשה שימוש בטכניקה זו כבר סייעה לגילוי ההטרוגניות תא לווין וללמוד Behavior על סיבים (15 ו 16).

תוצאות

כאן תארו את הבידוד של myofibers הבודד משרירי האד של עכברים בוגרים. myofibers המצליח להניב תלוי במספר גורמים, כגון תנאי שריר או גיל או פעילות collagenase. והכי חשוב, את הבידוד של השריר מגיד לגיד בתוצאות myofibers ארוך, ללא פגע משרירי אד. איור 1 מציג צעד אחר צעד ייצוג גרפי של "הגיד לגיד" בידוד. ברגע שהשריר עכל לגמרי, myofibers הם שוחררו על ידי הפעלת לחץ עדין לשרירים. 2A האיור מראה תמונה מייצגת של ניסוי בידוד myofiber אחרי הכביסה הראשונה. בנקודה זו התרבות מכילה תערובת של צרורות של myofibers הבודד אשר מופיע כמבנים צינורי ארוכים ונוצצים, היפר נדבק myofibers שהם כהים וקצרים ופסולת מתהליך העיכול. בסופו של לפחות שלוש כביסות רצופות, רק myofibers החי בודדה צריך להישאר בדיsh לתרבות או ניתוח במורד הזרם (האיור 2B). האיור 2C תערוכות סיבים ארוכים, בשידור חי, בהשוואה לסיבים התכווצו היפר (ג'). בעת הבידוד, תאי לווין מופיעים כבליטות קטנות על פני שטח myofiber (איור 3 א). אם נשמר במדיום עשיר סרום, תאי לווין להפעיל, מתרבים, נודדים וסופו של דבר למזג לתוך myotubes (B). לאחר 15 ימים בתרבות, בכל myotubes להביע Myf5 הכתב YFP (ג) טוען כי התחדשות שרירים במבוגרים מתבצעת על ידי תאים שבשלב מסוים במהלך פיתוחם הביעו הגורם הקובע myogenic Myf5. כל תאי הלווין להביע גורם שעתוק התיבה לזווג Pax7 ^17. קו עכבר כתב Pax7Cre-TdTomato ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר תאי לווין דרך הביטוי של אות ניאון TdTomato (תרשימים 3D ו-E). איור 4 מראה נציג immunofluorescence של כפול Pax7 + / תאי לווין Myod. קלסי כפול Pax7 + / Myod + תאי לווין נחשבים אבות שרירים מחויבים שגשוג שיהיה גם להשלים את תכנית הבידול על ידי ויסות Pax7 למטה תוך השמירה על ביטוי או לחזור לרגיעה לMyod ידי ויסות מטה Myod ושמירת Pax7 ביטוי ¹⁸

איור 1. בידוד שריר אד מהעכבר hindlimb. . Hindlimb של עכבר בוגר 8 שבוע. חיצים מציינים את הגיד הדיסטלי (ברך) וגיד הפרוקסימלי (רגל). ב '. מיקום האנטומי של שריר tibialis הקדמי (ת"א) וLongus extensor digitorum (אדי) השריר. ג. על ידי החזקת האד באמצעות הגיד הפרוקסימלי, השרירים יפנו לכיוון הברך לחשוף את הגיד הדיסטלי. ד. הגיד הדיסטלי הואלגזור והאד הוא שוחרר.

איור 2. תוצאות מייצגות של ניסוי בידוד myofiber יחיד. . תמונת שדה מוארת של ניסוי בידוד myofiber בשלב השטיפה הראשונה. החץ אדום מציין myofibers החי, חץ לבן מצביע myofibers קבלניים היפר וחץ צהוב מציין תאים, myofiber או פסולת ECM. ב '. אחרי שוטף רצוף בDMEM, רק myofibers חיים יישאר. C ו '. תמונה מייצגת חי myofiber שלם ארוך (C) והיפר קצר נדבק myofiber (ג'). 10 מיקרומטר ברים. תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ Zeiss Axio אובזרוור Z1 המצויד בAxioCam משאבי אנוש.

Figur דואר 3. תוצאות מייצגות של ניסוי תרבות myofiber יחיד. . תמונת שדה מוארת של myofiber יחיד, חיה עם התא שלה הקשור בלווין (חץ) מייד לאחר הבידוד (זמן 0). ב '. myofibers היחיד היה מצופה על Matrigel ותרבית במדיום עשיר סרום במשך 15 ימים. חץ לבן מצביע myotubes נבדל בהשוואה לתאים בודדים (חץ צהוב) C. myofibers היחיד מMyf5Cre; עכבר RosaYFP היה בתרבית כמו בB. חץ מציין Myf5 myotubes הנגזר. D ו-E. myofibers היחיד מPax7Cre; TdTomato הייתי מבודד ותקן מייד אחרי. חיצים מעידים תא Pax7 חיובי שקט לווין (E, אדום). גרעינים היו counterstained עם DAPI (ד '). בר: 50 מיקרומטר. תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ Zeiss Axio אובזרוור Z1 המצויד בAxioCam משאבי אנוש.

דרכים ">
איור 4. דוגמה לצביעת immunofluorescence של תאי לווין על myofibers. Myofibers היחיד הייתי מבודדת ותרבית במשך 72 שעות בתנאים משתנים. תאי לווין על myofibers הוכתמו לתא סמן Pax7 הלווין הספציפי (B, אדום) וMyod הגורם הרגולטורי myogenic (C, ירוק). גרעינים היו counterstained עם DAPI (). בארים: 50 מיקרומטר. תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ Zeiss Axio אובזרוור Z1 המצויד בAxioCam משאבי אנוש.

Dissection שריר (5 דקות כל שריר)	גיד לגיד בידוד כלים חדים ניזק לשריר מינימאלי
עיכול שריר (30-45 דקות)	טמפרטורהרגיש הימנע overdigestion
בידוד סיבים	הימנע על מניפולציה של סיבים לחסל את הפסולת עם כמה כביסות
תרבות סיבים (עד שבועות 3-4)	פורמט: כל ציפוי: סוס סרום, Matrigel בינוני: בסיס או גבוה בסרום

טבלת 1. סקירה כללית של פרוטוקול בידוד myofiber. פרוטוקול בידוד myofiber כוללת 4 שלבים עיקריים. לכל שלב, הזמן המשוער ונקודות קריטיות עיקריות הם דנו. לדיון מפורט בכל שלב, מתייחס לטקסט בפרוטוקול.

Discussion

הבידוד והתרבות של myofibers הבודד משרירים שלמים מספקים מצוין במודל מבחנה כדי ללמוד את התהליך של התחדשות שריר. תכונה ייחודית של מערכת זו היא השמירה על תאי לווין בסביבה הפיזיולוגית שלהם מתחת lamina הבסיס. והכי חשוב, טכניקה יכולה לשמש כדי לחקור התנהגות תאי גזע שריר בשתי מדינות הופעלו רגיעה ול. במהלך 20 השנים האחרונות, מערכת תרבות myofiber ספקה תובנה משמעותיות לביולוגיה של אוכלוסיית תאי הלווין ביחס לשני גורמים פנימיים וחיצוניים. על ידי myofibers הבודד culturing, הטרוגניות תא לווין ביחס לmyofiber, סוג שריר או פוטנציאל משובים טופלה ^15. מחקרים משוכללים באמצעות הדמית חיה של סיבי תרבית יחידים מותרים למידע צובר בדפוס נדידת תאי לווין ^16. הרכישה של נתונים כמותיים היאסימפוני אפשרי. אמנם זמן רב, הוא מספק מידע משמעותי על ההפצה וההתרחשות של אירועים ספציפיים (תאי גזע סימטרי יחס חלוקה, שגשוג והתמיינות, וכו '). יחד עם יישומים שתוארו קודם לכן, חלבון או RNA חילוץ מסיבים בודדים הוא גם אפשרי, למרות בידודה של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין על ידי FACS או באמצעים אחרים עלול לספק פלטפורמה טובה יותר כדי לחקור שינויי ביטוי חלבון או גן ברמה מולקולרית. מניסיוננו, השלב הקריטי ביותר לבידוד סיבים מוצלחים הוא "הגיד לגיד" בידוד (שלבים 2.5-2.9 בטקסט הפרוטוקול). זה מבטיח שלאחר עיכול שריר, סיבים משתחררים מהאד עם ניזק מינימאלי או ללא הגדלת הביצועים שלהם ובכך בשלבים הבאים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			מגיב / חומרים
Collagenase	סיגמה אולדריץ	C0130-1g	הכן הטרי כל הזמן לקבלת תוצאות אופטימליות. aliquots הנוסף של collagenase החי ניתן לאחסן ב -20 ° C.
גלוקוז DMEM הגבוה + NaPyr	Invitrogen	11995073	בנוסף לפן / דלקת יש צורך לצמצם זיהומי אוויר
סרום שור עוברי מאופיין	Hyclone	SH30396.03	לוט # KUJ35152
סוס סרום	Hyclone	SH300.74.03	לוט # AVJ82494
תמצית עוברי עוף	כימי מדויק	CE-650-T, תצווה B7035010	הימנע ממחזורי הקפאת הפשרה-.
Matrigel	BD		aliquots החנות ב -20 ° C. הימנע ממחזורי הקפאת הפשרה-. אחסן aliquots המדולל ב 4 ° C.
			ציוד
מספרי Cohann-Vannas אביב 6mm להבים-ישר ארפ	כלי מדע פיין	15000-02
נוספת איריס הדקה מספריים-10.5cm	כלי מדע פיין	14088-10
מלקחי מוריה, איריס מעוקלות	כלי מדע פיין	11373-12
פסטר פיפטות	VWR	14672-380	14672-200
יהלומי עט	VWR	52865-005
60 * 15mm צלחת פטרי	VWR	25384-092
Acrodisc 0.22 מסנן מיקרומטר	VWR	CA28-145-477
ביתור מיקרוסקופ StemiV6	Zeiss		מקור אור נוסף עשוי להידרש יש נוף להתמקד טוב יותר