성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

요약

myofibers의 절연과 문화는 황금 표준입니다 체외에서 시스템입니다. 중요한 것은 하나의 myofiber 문화 시스템은 근육 줄기 세포 틈새의 필수적인 구성 요소입니다 myofiber / 줄기 세포 연결을 유지합니다.

초록

성인의 근육 재생은 위성 세포라고 주민 줄기 세포에 의해 수행됩니다. 위성 세포는 기저 얇은 판 각 myofiber의 sarcolemma 사이에 자신의 위치에 의해 정의됩니다. 자신의 행동의 현재 지식은 크게 단일 myofiber 격리 프로토콜의 사용에 의존하고 있습니다. 1985 년에 비 쇼프는 myofiber과 줄기 세포 사이의 물리적 연결이 ¹ 보존되는 체외 시스템에를 만드는 것을 목표로 성인 쥐의 Flexor Digitorum Brevis (FDB)에서 하나의 라이브 섬유를 분리하는 프로토콜을 설명했다. 1995 년 비 쇼프 프로토콜 등이 myofibers이 단독으로 데려와 대신 중력 침강 ^{2, 3} 분리되는 collagenase를 소화 한 후 별도로 처리됩니다를 Rosenblattmodified. Rosenblatt 또는 비 쇼프 프로토콜은 이후 다른 근육, 연령이나 조건 ^3-6에 맞게되었습니다. 단일 myofiber 절연 기술은 필수입니다독특한 장점 때문에 도구입니다. 첫째, 단일 myofiber 프로토콜에, 위성 세포는 기저 얇은 판 아래에 유지됩니다. 이러한 형광 활성화 셀 정렬과 같은 다른 기술을 화학 및 기계적 조직 분리 ⁷ 필요로이 프로토콜의 독특한 기능입니다. myofiber 문화 시스템은 생체 연구에 대한 대체 할 수 있지만 근육 줄기 세포의 관련 생물학적 속성을 처리 할 수있는 뛰어난 플랫폼을 제공 않습니다. 싱글 myofibers는 표준 도금 조건 또는 부동 조건에서 배양 할 수 있습니다. 부동 myofibers에 위성 세포는 myofiber 환경보다 거의 다른 어떤 영향을 받게됩니다. 기판 강성 및 코팅은 근육 ^{8, 9를 다시} 생성 할 수 위성 세포 '능력에 영향을 표시 한 것도 이러한 요소의 각을 제어 할 수있는 것은 독립적으로 할 수 있습니다 틈새 시장에 의존하고 독립적 인 반응 사이의 차별. 혈청의 다른 농도가또한 정지에서 활성으로의 전환에 영향을 가지고 표시되었습니다. 관련 위성 세포의 정지 상태를 유지하려면 섬유는 ^1-3 낮은 혈청 매체에 보관해야합니다. 정지 상태에 관련된 유전자를 연구 할 때 특히 유용합니다. 혈청 풍부한 매체에, 위성 세포가 빠르게 활성화, 따라서 ^1-3 생체 재생 과정에를 모방, 마이그레이션 및 차별화, 세포 분열 따위에 의해 번식. 바이러스 배달 유전자의 이소성 표현; oligonucleotide 기반의 유전자 똑 다운 또는 라이브 이미징 시스템은 이러한 화학 억제제의 테스트와 같은 assays의 다양한을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오 문서는 현재 성인 마우스 (6-8주 이전)의 신근 Digitorum의 Longus (편집 판단리스트) 근육에서 단일 myofibers를 분리하기 위해 실험실에서 사용되는 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

모든 실험은 동물 보호 및 취급에 대한 오타와 규정의 대학에 따라 처리했다.

프로토콜의 개요 표 1을 참조하십시오.

1. 절연를 시작하기 전에

1. 다음과 같은 솔루션을 준비 :
   0.2 % Collagenase 유형 DMEM에서 I (Dulbecco의 수정 이글 배지, 110 MG / ML 나트륨 pyruvate 높은 포도당, L-글루타민). 이 편집 판단리스트 근육 DMEM의 0.2 % Collagenease 2 ML을 준비하십시오. 0.22 μm 필터를 통해 솔루션을 필터링 할 수 있습니다. 37 번 prewarm 분리하기 전에 10 분, ° C 물 목욕 인치 undiluted collagenase의 추가 aliquots는 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 냉동 할 수 있습니다.
   참고 : 프로 시저의 모든 걸쳐 나트륨 pyruvate로 DMEM을 사용합니다. 섬유는 나트륨 pyruvate없는 매체에 살아남지 못할 거요.
   • 세탁 미디어 (모든 세차를 수행 할 수 있습니다). 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신과 DMEM을 보완. 0을 필터사용하기 전에 0.22 μm 필터.
   • Myofiber 문화 미디어. 20% FBS, 1 % 닭 배아 추출물과 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신과 DMEM을 보완. 사용하기 전에 필터 0.22 μm을 통해 필터링 할 수 있습니다.
   • 코팅 요리를 Matrigel. 오랜 기간 동안 문화 섬유로, 우리는 코팅 기판으로 Matrigel를 사용하는 것이 좋습니다. Matrigel 코팅 요리를 준비하려면, 4 ° C 하룻밤에 Matrigel의 나누어지는을 해동. 하루를 보낸 후, DMEM에 Matrigel 1시 10분을 희석. 항상 ° 4에서 C를 Matrigel을 유지하고이 고르지 코팅의 결과로 Matrigel 솔루션 내에서 미세한 크리스탈을 만들 것이기​​ 때문에 갑작스런 온도 변화를 피하십시오. 장소 요리는 얼음에 코팅 될 수 있습니다. 표면을 충당 할 충분한 볼륨 코트 요리. 가 1 분에 앉아 보자. 완전히 남은 Matrigel을 제거합니다. 사용하기 이전 또는 밤 적어도 3 시간에 37 ° C에서 요리 건조 보자.
   
   참고 : 4 & 드에 저장된 경우 희석 Matrigel의 aliquots는 코팅 목적으로 여러 번 다시 사용할 수 있습니다g, C.
2. 마지막으로, 70 %의 에탄올과 현미경 역 해부 도구를 청소해야합니다.
3. 두 가지 편집 판단리스트 isolations (한 마우스는) 다음과 등 5 플라스틱 배양 접시를 (60 * 15mm) 준비에 대해
   • 절연을위한 네 가지 요리 (근육 분리 1, 직렬 세차 3). 모든 요리는 플라스틱에 붙이는 myofibers을 방지하기 위해 말 혈청 (HS)로 코팅되어야합니다. 코트에, 각 요리, 소용돌이에 말 혈청 피펫 3 ML에도 코팅을 허용하도록, 말 혈청을 제거하고 적어도 30 분의 음식이 건조 보자. 각 요리에 DMEM 4 ML을 추가합니다. 사용하기 전에 5 % CO ₂ 배양기에서 37 ° C에서 요리를하세요.
   
   참고 : 살균 보관하면 말 혈청가 여러 번을 다시 사용할 수 있습니다. 또한, DMEM에 10 %의 HS의 솔루션은 코트 요리에 사용할 수 있습니다. 전체 프로토콜을 통해 HS 코팅 요리를 사용하여 부동 조건에 때 배양의 myofibers.
   • 한 접시는 분리 한 후 문화 myofibers에 사용됩니다. Alt 키ernative 접시 크기 나 형식은 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 myofibers의 마지막 문화 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리는 60 * 15mm보다 큰 접시 크기를 제안하지 않습니다. 하이퍼 수축이 발생하기 전에 Myofibers는 더 이상 96 시간에 정지에 보관하실 수 있습니다. 더 이상 문화 회, 우리는 Matrigel 코팅 요리 나 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다.
4. myofiber 조작을위한 근육 처리 및 작은 구멍에 피펫에 대해 하나의 큰 구멍 피펫 : 하나 섬유 절연 (2 편집 판단리스트)의 경우 두 개의 무균 파스퇴르 피펫을 준비합니다. 원하는 길이와 피펫의 가장자리를 부드럽게하기 위해 열 폴란드어 각 유리 피펫을 잘라 다이아몬드 펜을 사용합니다. 불을 사용하여, 작은 구멍 피펫의 곡선 끝. 이 단일 섬유를 처리하는 데 도움이됩니다. 살균하는 화염. 사용하기 전에 HS와 코트는 각 피펫.

2. 근육 절개와 소화

1. Rosa26TdTomato (;이 실험의 목적은, 8 일주일 정도 SV129, Pax7 CreER ^Cklr에 대한Pax7Cre - TdTomato)와 Myf5-Cre, Rosa26YFP가 사용되었습니다.
2. 70 % 에탄올로 두 다리를 스프레이. 절차 동안 뒷다리의 더 나은 이해가 지원 보드에 동물 (얼굴까지)를 핀.
3. 가위의 도움으로 다리의 전체 길이를 잘라 내고 근육을 쉽게받을 수 있습니다. 피부뿐만 아니라 머리카락이나 털 (그림 1A)를 제거합니다.
4. 좋은 가위로 기본 근육을 손상시키지 않고 얇은 근막을 잘라. 시각은 편집 판단리스트를 현지화. 편집 판단리스트는 단지 Tibialis 앞쪽 (TA) 근육 아래에있는 뒷다리의 앞 칸에서 발견됩니다.
5. 이 집게의 도움으로 말초 힘줄을 쉽​​게받을 수 있습니다.
6. 날카로운 Cohann - Vannas 봄 가위로 말초 힘줄을 (TA 및 편집 판단리스트 모두) 자른다.
7. 포셉의 도움은 힘줄의 TA 및 편집 판단리스트 근육을 모두 보유하고 섬세 근위 끝 부분의 근육을 당겨와 함께. 이 시점에서 당신은 명확하게 볼 수 있어야합니다단지 TA 근육 아래에있는 편집 판단리스트 근육. 이제 반대 방향 (그림 1B)에 두 힘줄을 당겨 TA 근육에서 편집 판단리스트를 구분합니다. 이 myofibers를 손상시킬 수로이 작업을 수행하는 동안 편집 판단리스트 근육을 스트레칭하지 마십시오.
8. 편집 판단리스트 힘줄을 쉽​​게받을 수 있습니다. 더 나은 근위 힘줄을 시각화하기는 TA 근육을 제거하는이 시점에서 도움이 될 수 있습니다. 또한 무릎 주변의 일부 결합 조직 (그림 1C)을 차단하는 데 도움이 될 수 있습니다.
9. 근위 힘줄을 잘라 조심스럽게 편집 판단리스트를 (그림 1D)를 제거하십시오.
10. 의 힘줄을 통해 근육을 잡고, 이전에 준비 collagenase 솔루션 2 ML로 전송할 수 있습니다. 물 욕조에 37 ° C에서 알을 품다.
    참고 : 성공적인 섬유 절연을 위해, 그것은 myofiber 무결성이 유지 될 수 있도록 힘줄의 힘줄에 편집 판단리스트를 분리하는 것이 중요합니다. 2.3-2.9 단계는 해부 현미경으로 수행 할 수 있습니다. 또한, magn의 사용유리를 ifying하면 근육의 더 나은 전망을 즐기실 수 있습니다하는 데 도움이 될 수 있습니다.
11. 두 번째 편집 판단리스트를 분리 할 수​​ 2.3-2.9 단계를 반복합니다. 같은 관에서 두 번째로 편집 판단리스트를 전송합니다. 고르지 소화를 방지하려면 두 번째 편집 판단리스트의 고립은 첫 번째 이후 더 이상 5 이상 분을 완료해야한다.
    주 1 : 부화 시간이 collagenase 활동에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. 긴 또는 짧은 부화는 크기, 연령 및 / 또는 근육의 상태 (예 : fibrotic 근육이 더 소화 시간이 필요합니다)에 따라 요구 될 수 있습니다.
    주 2 : 근육 소화 시간 동안 정지 조건 하에서 교반을 위성 세포의 행동을 검토하는 것이 위성 세포 ^{10 달러를} 활성화 않을 수 있습니다.
12. 소화 기간 동안 정기적으로 오버 소화을 피하기 위해 근육을 확인합니다. 근육 긴장을 푸 시작하고 myofibers가 표시되는 경우 소화를 중지합니다. 소화를 중지하려면 신중하게 DME​​M 4 ML (dissociati과 prewarmed 페트리 접시에 두 근육을 전송요리에). 이 작업을 수행 할 수있는 큰 구멍 크기 피펫을 사용합니다.
    참고 : 하이퍼 계약을 체결 myofibers의 고립이 필연적 결과로 근육 overdigestion를 피할 수 있습니다.

3. 싱글 Myofiber 해리와 문화

1. myofibers를 공개하려면, 섬유 자연적으로 출시되기 시작 때까지 따뜻한 매체 근육을 내리려고 큰 구멍 유리 피펫을 사용합니다. 이 필연적으로 피해 섬유를 얻을 수 있습니다로 근육을 씹다하지 마십시오. 이것과 해부 현미경으로 다음 단계를 수행합니다.
2. 원하는 숫자에 도달 할 때까지 myofibers를 공개 계속합니다. 요리 더 이상 10 분 동안 실온에서 필요한 경우 37 번 5 분 (최소) 부화 ° C, 5 % CO ₂ 매체를 다시 평형 할 수 할 수 있습니다.
   참고 : 매체는 오랜 시간에 생리 이하의 온도 (37 ° C)에 도달하면 myofibers이 죽는 것입니다.
3. 작은 크기 구멍 피펫, transfe를 사용하여R은 새로운 prewarmed 요리 (3 연속 세차의 첫 번째)에 단일 myofibers을 살고 있습니다. 대신 모두 한 번에 myofibers의 대량 전송 개별적으로 myofiber를 처리합니다. 필요한 경우, 37에서 배양 ° C, 매체를 다시 평형하는 10-15 분에 대한 5 % CO _2.
4. 2 번에 대한 단계 3.3 반복 또는 모든 죽은 myofibers 및 찌꺼기가 제거 될 때까지. 우리는 적절한 청소를위한 최소한 세 연속 세차를 사용하는 것이 좋습니다.
   참고 : 짧은과 하이퍼가 현미경 빛 아래에서 계약으로 죽은 myofibers가 나타납니다.
5. 37 단일 myofibers을 길러 ° C, 이전에 문화 매체로 전환 적어도 하나의 시간에 대해 마지막 세탁 요리 (단 DMEM)에서 5 % CO _2. 이 myofibers의 혈청이 없으면 체외 조건에 적응 할 수 있습니다. 우리는 혈청 풍부한 중간 섬유 축소 증가에 myofibers의 즉각적인 문화를 발견했다.
6. 한 시간 후, 새로운 prewarmed 요리 또는 적절한 문화 형식으로 myofibers 전송다운 스트림 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 높은 혈청 중간에 문화 섬유는 위성 세포 활성화를 허용합니다. 또한, 혈청 또는 닭 배아 추출물의 다른 농도도 사용할 수 있습니다. 매일 매체를 변경합니다.

4. 다운 스트림 응용

1. Immunostaining. 라이브 myofibers은 고립 동안 시점에서 고정과 스테인드 할 수 있습니다. Immunofluorescence는 플로팅 및 기판에 연결된 두 myofibers에 수행 할 수 있습니다. 부동 myofibers 얼룩 경우, 하나의 솔루션에서 myofibers를 전송할 작은 구멍 유리 피펫을 사용합니다. 또한, 모든 절차를 통해 같은 우물에 myofibers를 유지하고 유리 피펫을 사용하여 솔루션을 추가 / 제거 할 수 있습니다. 이뿐만 아니라 myofibers의 제거가 발생합니다 같은 표준 흡인하지 마십시오. 간단히 완전히 배양액을 제거, 5 분에 prewarmed 4 % paraformaldehyde (PFA)의 수정 myofibers. 광범위하게 PBS 여러 번 씻는다. IncubaPBS 또는 기타 표준 담금질 솔루션에 1% 글리신의 테 myofibers는 PFA 배경 착색을 최소화합니다. 필요한 경우와 0.1 % 트리톤 PBS에서 5 분 세척 한 다음 10 분을위한 PBS에서 X-100. myofibers을 permeabilize 1 실의 온도에서 시간 또는 바람직 박 4 ° C.에 대한 차단 솔루션 섬유 (10 % 말 혈청, 0.1 % 트리톤 X-100, 1 % 할머니를) 품다 대체 차단 솔루션은 관심 항체에 따라 사용할 수 있습니다. 5 분을 위해 PBS에 한 번 씻으십시오. 4 ° C.에서 1 상온에서 시간 또는 야간에 차단 솔루션에 희석 적절한 기본 항체를 품다 모든 언 바운드 항체를 제거하는 PBS에 세척 당 5 분에서 섬유에게 3 번 씻으십시오. 실온에서 45 분으로 1 시간에 해당하는 보조 항체를 품다. PBS에 세척 당 5 분에서 3 번 씻으십시오. 1 MG / ML DAPI로 핵을 Counterstain. 부동 섬유를 얼룩 경우, 현미경에 적합한 유리 슬라이드에 각각의 섬유를 전송할 수 있습니다. PBS 또는 매체의 초과를 제거합니다. 메디 장착 적용음 ... 다음 coverslip을 추가합니다. 형광 현미경으로 myofibers를 시각적으로 진행합니다. 편집 판단리스트 myofibers의 대표 immunofluorescence에 대한 그림 4를 참조하십시오. 강한 fixatives를 사용하여 다른 착색 절차 Verma, M. 외. ¹¹ Wosniak, AC 외. ^12에 설명되어 있습니다.
2. Oligonucleotide 또는 플라스미드 과도 transfection. 라이브 myofibers는 특정 유전자 / 관심 s의 플라스미드 또는 siRNA와 transfected 수 있습니다. siRNA를 사용하는 경우, 두 transfection는 효율적인 유전자 최저 권장합니다. 우리는 고립에서 8 시간 후 첫 transfection을 수행하는 것이 좋습니다. transfection 후 여섯 시간은 신선한 매체로 대체합니다. siRNA의 transfection 위해, 우리는 50 nm의 최종 농도를 사용하여 시작하는 것이 좋습니다. 유전자 표현 최저는 RNA 추출 또는 바람직 immunostaining에 의해 분석 될 수 있습니다.
3. 바이러스 감염. 라이브 myofibers의 감염이 가능하지만, 세포의 발생죽음이 oligo의 transfection과 감염의 효율성과보다 높은 것은 근육 상태와 나이에 따라 변수가 될 수 있습니다. 예를 들어, 그대로 성인 근육 myofibers는 호스트 감염 ^{13, 14에} 대한 보호 장벽을 제공하기 위해 표시되었습니다 기저 얇은 판의 존재로 인해 바이러스 감염에 대응 특히 비입니다. 그들은 동작 (비 mitotic) 세포를 감염 될 수 있기 때문에 Lentiviral 벡터는 retroviral 벡터 선호하고 있습니다. 바이러스 감염를 들어, Matrigel 코팅 접시 플레이트와 myofibers는 첫 24 시간에 대한 미디어 환경에 적응하게에 문화 섬유에 좋습니다.
4. 영상을 살고 있습니다. myofibers의 영상은 특히 시간이 소요되며, 37 ° C, 5 % CO ₂ 챔버가 장착 된 현미경을 필요로 살고 있습니다. 하나의 위성 세포의 행동을 평가 때 유용합니다. 이 기술을 사용하여 수행 작업은 위성 세포 이질성의 발견에 대한 역할을했습니다하고 beha을 공부하기섬유 vior (15, 16).

결과

여기 성인 마우스의 편집 판단리스트 근육에서 단일 myofibers의 절연을 설명했다. 성공적인 myofibers는 collagenase 활동이나 근육 조건이나 연령 등 여러 가지 요인에 따라 달라집니다를 얻을 수 있습니다. 가장 중요한 건에서 편집 판단리스트 근육의 길이 그대로 myofibers의 힘줄이 결과 근육의 고립. 그림 1은 고립 "힘줄에 힘줄이"의 단계 그래픽 표현을 통해 단계를 보여줍니다. 근육이 완전히 소화되면 myofibers는 근육에 부드러운 압력을 적용하여 출시하고 있습니다. 그림 2A는 첫 번째 세척 후에 myofiber 격리 실험의 대표 사진을 보여줍니다. 이 시점에서 문화는 길고 빛나는 관 구조로 표시 한 myofibers 묶음의 혼합물을 포함, 하이퍼은 소화 과정에서 어둡고 짧고 파편 아르 myofibers을 계약. 적어도 세 연속 세차의 끝으로 만 하나의 라이브 myofibers는 디에 남아 있어야문화 또는 다운 스트림 분석을위한 쉬 (그림 2B). 그림 2C는 하이퍼 계약을 체결 섬유 (C ')에 비해 긴, 라이브 섬유를 보여줍니다. 고립시, 위성 세포는 myofiber 표면 (그림 3A)에 작은 protuberances으로 나타납니다. 혈청 풍부한 매체에 유지하는 경우, 위성 세포는 활성화 분아 따위에 의해 중식, 마이그레이션 결국 myotubes (B)에 융합. 문화 15 일이 지나면 모든 myotubes는 성인의 근육 재생이 자신의 개발 기간 동안 어떤 시점에서 myogenic 결정자 계수 Myf5을 표명했다고 세포에 의해 수행되는 제안 Myf5 기자 YFP (C)를 표현한다. 모든 객실에는 위성 세포는 짝을 상자 전사 인자에게 Pax7 ¹⁷ 표현한다. 기자 마우스 라인 Pax7Cre-TdTomato는 TdTomato 형광 신호 (그림 3D 및 E)의 표현을 통해 위성 세포를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 그림은 4 쇼 대표 immu더블 Pax7 + / Myod 위성 세포의 nofluorescence. 클래식 한 더블 Pax7 + / Myod + 위성 세포는 하나 다운 Myod을 조절하고 Pax7 표현 ¹⁸ 유지하여 Myod 표현하거나 정지로 수익을 유지하면서 다운 Pax7을 조절하여 차별화 프로그램을 완료 proliferative 헌신적 인 근육 progenitors로 간주됩니다

1 그림. 마우스 hindlimb에서 편집 판단리스트 근육 절연. 8 일주일 정도 성인 마우스. Hindlimb. 화살표는 말초 (무릎) 힘줄과 인접 (도보) 힘줄을 나타냅니다. B는. Tibialis 앞쪽 (TA) 근육과 신근 Digitorum의 Longus (편집 판단리스트) 근육. C의 해부 위치. 근위 힘줄을 통해 편집 판단리스트를 개최함으로써, 근육은 말초 힘줄이 노출 무릎쪽으로 당겨 있습니다. D는. 말초 힘줄은잘라 내기 및 편집 판단리스트가 공개되어 있습니다.

그림 2. 하나의 myofiber 격리 실험의 대표 결과입니다. 첫 번째 세척 단계에서 myofiber 격리 실험. 밝은 현장 사진. 레드 화살표가 라이브 myofibers을 나타냅니다, 흰색 화살표가 하이퍼 계약 myofibers을 나타내며 노란색 화살표는 세포, myofiber 또는 ECM의 파편을 나타냅니다. B는. DMEM의 연속 세차 후에는 라이브 myofibers이 남아있다. C와 C '. 이미지 긴 그대로 라이브 myofiber (C)를 ​​상징하며 짧은 하이퍼가 myofiber을 (C ') 계약을 체결. 바 10 μm. 사진은 AxioCam HR 갖춘 Zeiss Axio 옵저버 Z1 현미경으로 촬영 된 것입니다.

Figur E 3. 하나의 myofiber 문화 실험의 대표 결과입니다. 바로 분리 한 후 관련 위성 세포 (화살표) (시간 0). B와 하나의, 라이브 myofiber의. 밝은 현장 사진. 싱글 myofibers는 Matrigel에 도금 15 일 혈청 다양한 매체에 배양 하였다. 화이트 화살표는 하나의 셀 (노란색 화살표) C에 비해 차별화 된 myotubes을 나타냅니다. Myf5Cre에서 싱글 myofibers는, RosaYFP 마우스는 B와 같이 배양되었다. 화살표 Myf5 파생 myotubes을 나타냅니다. D와 E. Pax7Cre에서 싱글 myofibers, TdTomato는 바로 한 후 격리하고 수정되었습니다. 화살표는 Pax7 긍정적 정지 위성 세포 (E, 빨간색)을 나타냅니다. 핵은 DAPI (D)와 counterstained되었습니다. 바 : 50 μm. 사진은 AxioCam HR 갖춘 Zeiss Axio 옵저버 Z1 현미경으로 촬영 된 것입니다.

방법 ">
4 그림. myofibers 위성 세포의 immunofluorescence 얼룩의 예. 싱글 myofibers는 절연 및 플로팅 조건에서 72 시간에 배양 하였다. myofibers에 위성 세포는 위성 세포 특정 마커 Pax7 (B, 빨간색)와 myogenic 규제 요소 Myod (C, 녹색)에 얼룩이되었습니다. 핵은 DAPI (A)와 counterstained되었습니다. 바 : 50 μm. 사진은 AxioCam HR 갖춘 Zeiss Axio 옵저버 Z1 현미경으로 촬영 된 것입니다.

근육 절개 (5 분 각각의 근육)	힘줄이 고립 건 샤프 도구 최소 근육 손상
근육 소화 (30-45 분)	온도민감한 overdigestion을 피
섬유 절연	섬유의 조작을 통해 피 여러 세차와 파편을 제거
섬유 문화 (최대 3~4주까지)	형식 : 모든 코팅 : 말 혈청, Matrigel 매체 : 기초 또는 혈청 높은

표 1. myofiber 격리 프로토콜의 개요. myofiber 절연 프로토콜은 4 주요 단계로 구성되어 있습니다. 각 단계에 대해 대략적인 시간과 주요 핵심 포인트를 설명합니다. 각 단계에 대한 자세한 설명은 프로토콜 텍스트를 참조하십시오.

토론

그대로 근육의 단일 myofibers의 절연 및 문화 근육 재생의 과정을 공부하는 체외 모델에 우수한를 제공합니다. 이 시스템의 고유 기능은 기저 얇은 판 아래의 생리적 환경에서 위성 세포의 보존입니다. 가장 중요한 기술은 정지하고 활성 상태 모두에서 근육 줄기 세포의 행동을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 지난 20 년 동안 myofiber 문화 시스템은 고유 및 외부 determinants 모두에 대해 위성 세포 인구의 생물에 의미있는 통찰력을 제공하고 있습니다. 배양 개인의 myofibers으로 myofiber, 근육 입력하거나 재생 가능성과 관련하여 위성 세포 이질성은 ¹⁵ 해결되었습니다. 위성 세포 이주 패턴 ¹⁶ 획득 정보를 허용 한 배양 섬유의 라이브 영상을 사용하여 정교한 연구. 양적 데이터의 취득은수 LSO. 시간이 많이 있지만, 특정 이벤트 (줄기 세포 비대칭 분할, 증식과 분화 비율 등)의 유통 및 발생에 관한 중요한 정보를 제공합니다. FACS 또는 기타 수단으로 위성 세포의 순수한 인구의 분리는 분자 수준에서 단백질이나 유전자 표현 변화를 조사 할 수있는 좋은 플랫폼을 제공 할 수 있지만 함께 이전에 설명 된 응용 프로그램과 단일 섬유에서 단백질이나 RNA 추출도 가능합니다. 우리의 경험에서 성공적인 섬유 절연을위한 가장 중요한 단계는 절연 (2.5-2.9 프로토콜 텍스트의 단계) "힘줄에 힘줄이"입니다. 이 근육 소화 한 후, 섬유 최소한의 또는 전혀 손상이 때문에 다음 단계에서 자신의 성능을 증가와 함께 편집 판단리스트에서 해제되어 있는지 보장합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
			시약 / 재료
Collagenase	시그마 - 알드리치	C0130-1g	최적의 결과를 신선한 모든 시간을 준비합니다. undiluted collagenase의 추가 aliquots는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다
DMEM 높은 포도당 + NaPyr	Invitrogen	11995073	펜 / 패 혈성의 추가는 대기 contaminations을 최소화 할 필요가 있습니다
특징 태아 소 혈청	Hyclone	SH30396.03	롯 # KUJ35152
말 혈청	Hyclone	SH300.74.03	롯 # AVJ82494
닭 배아 추출	정확한 화학	CE-650-T, 배치 B7035010	동결 - 해동 사이클을 피하십시오.
Matrigel	BD		-20 ° C.에 저장 aliquots 동결 - 해동 사이클을 피하십시오. 4 ° C.에 희석 aliquots를 저장
			장비
Cohann - Vannas 봄 가위 블레이드 - 스트레이트 - 샤프 6mm	정밀 과학 도구	15000-02
추가 씬 아이리스 가위-10.5cm	정밀 과학 도구	14088-10
모리아 - 홍채 집게가 구부러진	정밀 과학 도구	11373-12
파스퇴르 피펫	VWR	14672-380	14672-200
다이아몬드 펜	VWR	52865-005
60 * 15mm 페트리 접시	VWR	25384-092
Acrodisc 0.22 μm 필터	VWR	CA28-145-477
현미경 StemiV6을 해부	Zeiss		추가 광원이 더 나은 초점 전경을 조망하실 수 있습니다해야 할 수 있습니다